Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

De auteurs bedanken alle leden van de Braakman lab, verleden en presenteren, voor hun vruchtbare discussies en helpen bij de ontwikkeling van de methoden in dit artikel wordt gepresenteerd. Dit project heeft financiering ontvangen van zowel de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (KP7/2007-2013) N ° 235649 en de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) onder het ECHO-programma N ° 711.012.008.

Alle radioactieve reagentia en procedures werden behandeld in overeenstemming met lokale Universiteit Utrecht straling regels en voorschriften.
1. pulse Chase
<ol><li>
Pulse Chase voor Adherente cellen Opmerking: De hier gegeven volumes zijn gebaseerd op 60 mm cel cultuur gerechten. Voor 35 mm of 100 mm gerechten, vermenigvuldigt u de volumes met 1/2 of 2, respectievelijk. Dit protocol maakt gebruik van een puls-tijd van 10 min en chase tijden van 0, 15, 30, 60, 120 en 24...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Puls-chase methoden zijn essentieel voor de ontwikkeling van wetenschappers inzicht in waar de eiwitvouwing in onbeschadigde cellen. Terwijl wij hebben geprobeerd om te verstrekken een methode die is zo algemeen mogelijk, heeft deze aanpak het potentieel voor bijna onbegrensd variaties om verschillende processen die zich voordoen tijdens het vouwen, het vervoer, en het leven van proteïnen in de cel te bestuderen.
Bij het uitvoeren van een puls-achtervolging aanhangend cuvetten in gerechten, i...

De vouwen van zelfs relatief eenvoudig eiwitten omvat vele verschillende opvouwbare enzymen, moleculaire chaperones en covalente wijzigingen1. Een volledige reconstructie van deze processen in vitro is praktisch onmogelijk, gezien het grote aantal verschillende componenten betrokken. Het is daarom zeer wenselijk, het bestuderen van in levende cellen waar de eiwitvouwing in vivo. Radioactieve pulse-jacht technieken blijken een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de synthese, vouwen, vervoer en afbraak van eiwitten in hun natuurlijke omgeving.
De metabole labeling van eiwitten tijdens een korte puls met 35S-geëtiketteerden methionine/cysteïne, gevolgd door een achtervolging in het ontbreken van een radioactieve label, kunt specifieke bijhouden van een bevolking van nieuw samengestelde eiwitten in de bredere cellulaire milieu. Vervolgens doel eiwitten kunnen worden geïsoleerd via immunoprecipitation en geanalyseerd via SDS-pagina of andere technieken. Voor veel eiwitten, wordt hun reis door de cel gekenmerkt door wijzigingen die zichtbaar op de SDS-pagina gel zijn. Bijvoorbeeld gaat het vervoer van geglycosyleerde eiwitten uit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het Golgi-complex vaak gepaard met wijzigingen van N-gebonden glycanen of de toevoeging van O-gebonden glycanen2,3. Deze wijzigingen veroorzaken grote stijgingen in de schijnbare moleculaire massa, die kan worden gezien door mobiliteit veranderingen in SDS-pagina. Rijping kan ook worden gemarkeerd door Proteolytische breuklijnen, zoals de signaal-peptide decollete of de verwijdering van pro-peptides, wat resulteert in veranderingen in de schijnbare moleculaire massa die kan gemakkelijk worden gevolgd op SDS-pagina gel4. Radioactiviteit heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van vergelijkbare technieken zoals cycloheximide achtervolgingen, waar nieuwe eiwitsynthese wordt voorkomen, zoals langere behandelingen giftig voor de cellen zijn en sluit niet de meerderheid van de oudere, steady-state eiwitten uit de analyse, zoals sommige eiwitten hebben half-leven van dagen. De vergelijking van eiwitten onder beide nonreducing en vermindering van de voorwaarden kan de analyse van de vorming van de bond van bisulfide, een belangrijke stap in de vouwen van vele secretoire eiwitten4,5,6, 7.
Hier beschrijven we een algemene methode voor de analyse van de vouwing van eiwitten en vervoer in onbeschadigde cellen, met behulp van een radioactief pulse-chase-aanpak. Terwijl wij hebben gericht op de methode als gedetailleerd mogelijk, het protocol heeft een bijna onbegrensde mogelijkheden voor aanpassingsvermogen en optimalisatie te bestuderen van specifieke proteïnen van elke lezer zal toestaan.
Twee alternatieve pulse-chase protocollen, één voor Adherente cellen (stap 1.1 van het hier gepresenteerde protocol) en één voor schorsing cellen (stap 1.2 van het hier gepresenteerde protocol) worden verstrekt. De voorwaarden bedoeld hier volstaan om te visualiseren een eiwit uitgedrukt met middellange - tot hoog-expressie niveaus. Als de lezer met slecht uitgedrukte proteïnen of verschillende posttreatment omstandigheden, zoals meerdere immunoprecipitations werkt, is het noodzakelijk om te verhogen van de grootte van de schotel of cel nummer op de juiste manier.
Voor schorsing pulse chase, worden de chase-monsters op elk punt van de tijd genomen uit een enkele buis van cellen. De stappen wassen nadat de pols worden weggelaten; in plaats daarvan wordt verdere integratie van 35S verhinderd door verdunning met een hoge overmaat van labelloze methionine en cysteïne.
De gepresenteerde protocollen gebruiken radioactieve 35S-geëtiketteerden cysteïne en methionine te volgen van cellulaire eiwitvouwing processen. Alle bewerkingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van passende beschermende maatregelen om te minimaliseren van eventuele blootstelling van de exploitant en het milieu aan radioactieve straling en worden uitgevoerd in een aangewezen laboratorium. Als de puls-chase labeling techniek is relatief inefficiënt korte puls tijde (< 15 min), minder dan 1% van het beginbedrag van radioactiviteit is verwerkt in de onlangs samengestelde eiwitten. Na de verrijking van de target eiwit via immunoprecipitation bevat het monster voor SDS-pagina minder dan 0,05 procent van het beginbedrag van radioactiviteit.
Hoewel de 35S methionine en cysteïne labeling mix is gestabiliseerd, zal sommige ontleding, opbrengst van de vluchtige radioactieve stoffen, plaatsvinden. Ter bescherming van de onderzoeker en de apparatuur, moeten sommige voorzorgsmaatregelen worden genomen. De onderzoeker moet altijd de veiligheidsvoorschriften van de lokale straling gehoorzamen en een houtskool masker, naast een laboratoriumjas en (dubbele) handschoenen van de verpleegkunde mag dragen. Voorraad flesjes met 35S methionine en cysteïne moeten altijd worden geopend in een zuurkast of onder een lokale aspiratie-punt. Bekende laboratorium besmetting plekken zijn centrifuges, pipetten, waterbaden, incubatoren en shakers. De besmetting van deze gebieden wordt verminderd door het gebruik van de pipet tips met een houtskool filter, positief-seal microcentrifuge buizen (Zie Tabel of Materials), aquarium houtskool sponzen in water baden, houtskool filtreerpapier gelijmd in de puls-chase gerechten, houtskool bewaker in de aspiratie systeem, en de plaatsing van gerechten met houtskool korrels in voorbroeders en opslagtanks.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Puls-chase radioactieve labeling is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de conformationele rijping, het vervoer naar hun functionele cellulaire locatie, en de afbraak van doel proteÃ¯nen in levende cellen. Met behulp van korte (puls) radiolabeling keer (< 30 min) en streng gecontroleerd chase tijden, is het mogelijk om slechts een klein deel van de totale proteïne-pool label en volg de vouwen. Wanneer gecombineerd met nonreducing/vermindering van de Elektroforese van het gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en immunoprecipitation met (conformatie-specifieke) antilichamen, kan vouwen processen worden onderzocht in groot detail. Dit systeem is gebruikt om te analyseren de vouwing van eiwitten met een enorme variatie in eigenschappen zoals oplosbare eiwitten, enkele en Multi-Pass transmembraan eiwitten, zwaar N - en O-geglycosyleerde eiwitten en proteïnen met en zonder uitgebreide bisulfide verlijmen. Puls-chase methoden vormen de basis van kinetische studies naar een aantal extra functies, waaronder co - en posttranslationele modificaties oligomerisatie en polymerisatie, waardoor in wezen de analyse van een eiwit vanaf de geboorte tot de dood. Puls-chase studies over de vouwing van eiwitten zijn complementair met andere biochemische en Biofysische methoden voor studeren eiwitten in vitro door verhoogde temporele resolutie en fysiologische informatie te bieden. De methoden zoals beschreven in dit document zijn gemakkelijk aangepast om te bestuderen de vouwen van bijna elk eiwit dat kan worden uitgedrukt in zoogdieren of insect-cel systemen.

De vouwen en afscheiding van HIV-1 gp120 vanaf een aanhangend pulse chase is afgebeeld in Figuur 2. De nonreducing gel (NR van de cellen in de figuur) toont de oxidatieve vouwen van gp120. Onmiddellijk na de pols labeling van 5 min (0 min chase) gp120 weergegeven als een diffuse band hoger in de gel, en naarmate de chase de band migreert naar beneden de gel door nog meer verspreid vouwen tussenproducten (IT) totdat het hoopt zich op in de strakke band (NT) di...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

De radioactieve pulsjacht met behulp van 35 S-gelabelde methionine en cysteïne is nog steeds de enige biochemische methoden om eiwitbiosynthese met de tijd in levende cellen te onderzoeken. Eiwitbiosynthese omvat zowel vertaling, vouwen en assemblage, als handel en degradatie. Het combineren van de radioactieve pulsjacht met analyse van co-en post-translation eiwitmodificaties, zoals disulfide bindingsvorming en acetylatie, biedt een gevoelige en kwantitatieve test om het geloof van het eiwit met de tijd te onderzoeken.Voor deze procedure is een goede focus en experimentele behandeling vereist. Een goede voorbereiding is cruciaal, zoals buffers, uw radioactieve werkruimte en een duidelijk schema. Deze video biedt een duidelijk over de schouder weergave van de radioactieve puls chase protocol.Het demonstreren van de procedure zal Hui Ying Yeoh, een pHd kandidaat van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, zaad transfect en cultuur cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor de pulsjacht, inspecteer je cellen door de microscoop.Was vervolgens de afwas met twee milliliter wasbuffer. En twee milliliter hongermedium naar de cellen en plaats de gerechten in een bevochtigde couveuse op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat uw pols achtervolging in orde is.Breng de gerechten naar de rekken in het waterbad, voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat de gerechten in contact zijn met water, maar niet drijven. Start dan een timer.Op 40 seconden, het aanzuigen van het verhongeringsmedium. Met behulp van een micropipet, opstellen 600 microliter puls oplossing. Voeg op precies één minuut voorzichtig de pulsoplossing toe aan het midden van de schotel.Herhaal dit proces van het verwijderen van het verhongeringsmedium en het toevoegen van de pulsoplossing voor de resterende schotels met intervallen van één minuut. Op precies 11 minuten en voor alle volgende gerechten, volgens de puls chase regeling, met uitzondering van de nul minuten achtervolging monster, voeg twee milliliter chase medium direct aan de schotel. Aspirate de jacht medium en vervang het door twee milliliter van verse achtervolging medium.Herhaal dit proces voor alle resterende gerechten met tussenpozen van één minuut. Wanneer de timer leest precies 16 minuten, voeg twee militers van chase medium direct aan de nul minuten chase schotel, op de top van de puls medium, om te stoppen met labelen. Onmiddellijk het medium aanzuigen.Breng de schotel op een gekoelde aluminium plaat en voeg twee militers van ijskoude stop buffer. Breng alle andere gerechten naar een couveuse op 37 graden Celsius. Breng elke chase schotel terug van de couveuse naar het waterbad twee minuten voor het einde van elke achtervolgingstijd.Op de exacte achtervolging tijd voor elk gerecht, aspirate de jacht medium en breng de schotel naar een gekoelde aluminium plaat. Voeg twee milliliter ijskoude stopbuffer toe. Laat alle gerechten op ijs en stop buffer totdat er tijd is om de cellen lyse.Spoel vervolgens de stopoplossing aan en was alle afwas. Drie tegelijk met twee milliliter ijskoude stopoplossing. Aspirate de stopoplossing volledig en voeg 600 microliters lyse buffer toe aan twee gerechten tegelijk.Schraap met een celschraper het oppervlak van de schaal grondig, maar voorzichtig om het lysaat te mengen. Breng lysaat van elk gerecht naar een verse 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Centrifuge op 15.000 tot 20.000 G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de kernen te pelleteren.Voor de puls achtervolging op suspensie cellen collectie vijf miljoen cellen per keerpunt in een 50 milliliter buis. Voer de hongerprocedure uit zoals beschreven in de tekst. Na de verhongeringsprocedure in het waterbad gedurende 15 minuten, start de timer.Voeg op precies één minuut 275 microcuries onverdunde etiket direct toe aan de buis met cellen en wervel om te mengen. Voeg op precies 11 minuten vier milliliter chase media toe om de etikettering te stoppen. En onmiddellijk een milliliter overbrengen naar een 15 milliliter buis op ijs die negen milliliter ijskoude stopoplossing bevat om te stoppen met labelen.Herhaal dit proces van het overbrengen van een milliliter jacht naar een buis op ijs met negen milliliter stopoplossing voor elk opeenvolgende chase time point. Na de immunoprecipitatie, de laatste wasbeurt volledig aanzuigen. Schort de kralen opnieuw op in 20 microliters van TE-buffer en vortex.Voeg 20 microliter van twee X monsterbuffer toe zonder het reducerende middel. Vortex de monsters en dan verwarmen ze op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Vortex de monsters weer.Centrifuge op 12.000 keer G bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Breng 19 microliter van de niet-gereduceerde supernatant over naar een verse microcentrifugebuis die één microliter van 500 millimolar DDT bevat. Indien nodig, centrifugeren het monster snel, zodat alle vloeistoffen zijn aan de onderkant.En verwarm op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Laat het gereduceerde monster afkoelen en dan vortex. Centrifugeren zowel de verlaagde als de niet-gereduceerde monsters bij 12.000 keer G bij kamertemperatuur gedurende een minuut, en voeg vervolgens 1,1 microliter van één molaire NEM toe aan alle monsters.In deze studie wordt een radioactieve pulsjachtbenadering gebruikt om eiwitvouwen en transport in intacte cellen te analyseren. Het vouwen en afscheiding van HIV GP120 van een aanhangende impulsachtervolging wordt hier getoond. De niet-reducerende gel toont de oxidatieve vouwen van GP120.Onmiddellijk na de puls labeling, verschijnt het als een diffuse band hoger in de gel. Naarmate de achtervolging vordert, migreert de band de gel door nog meer diffuse vouwen intermediates totdat het zich ophoopt in de strakke band die native gevouwen vertegenwoordigt bij GP120. Dit gebeurt als de vorming van disulfide bindingen verhoogt de compactheid van het eiwit, waardoor het sneller migreren dan de volledig verminderde eiwit.Op de reducerende gel zijn de disulfidebindingen en alle moleculen verminderd en hebben geen invloed op mobiilty. Als zodanig zijn verschillen in mobiliteit alleen het gevolg van veranderingen in moleculaire massa. De verschuiving in de tijd van het verminderde signaal peptide oomaved vorm aan de verminderde signaal peptide decolleté vorm vertegenwoordigt de post-translationele signaal peptide decolleté van GP120.De mobiliteit neemt toe als gevolg van het verlies van het signaal peptide die toeneemt tijdens de achtervolging als meer eiwitten bereiken de inheemse vouw en verliezen hun signaal peptide. Op zowel de niet-reducerende als de reducerende gel begint het signaal te dalen van ongeveer een uur als gevolg van de afscheiding van GP120. Dit kan worden gecontroleerd door het analyseren van de media.Deze methode is van toepassing op elke cellijn, inclusief organoïde celmodellen. Maar het succes hangt sterk af van het expressieniveau van het eiwit van belang. Voordat u met deze procedure begint, markeert u uw gerechten en bewaar deze volgorde tijdens het experiment.Zorg ervoor dat alles is voorbereid voordat het toevoegen van honger medium. Dit is het begin van het experiment. En je lab tijd is je vriend, maar kan je grootste vijand zijn als je niet voorbereid bent.Bill's achtervolging kan worden gecombineerd met beperkte proteolyse om de volledige nalatenschap van eiwitten met de tijd te onderzoeken. Ook verschillende gekozen vriezers methoden zal analyse van spoeling of rigormorization of kosten verschillen mogelijk te maken. Om de onderzoeker en het apparaat te beschermen, moeten alle lokale stralingsveiligheidsregels worden nageleefd.En beschermende maatregelen moeten worden genomen volgens protocol. Merk op dat uw acrylamide, gebruikt voor uw STH-pagina is neurotoxisch.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...