Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
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लेखक Braakman लैब, अतीत और वर्तमान के सभी सदस्यों को धंयवाद, उनके उपयोगी विचार विमर्श के लिए और इस लेख में प्रस्तुत तरीकों के विकास में मदद करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम (FP7/2007-2013) एन ° २३५६४९ और नीदरलैंड संगठन के वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO) के तहत दोनों यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है इको-प्रोग्राम N ° 711.012.008 के अंतर्गत ।

सभी रेडियोधर्मी एजेंट और प्रक्रियाओं स्थानीय Utrecht विश्वविद्यालय विकिरण नियमों और विनियमों के अनुसार संभाला गया था ।
1. पल्स चेस
<ol><li>
अनुयाई कोशिकाओं के लिए पल्स चेस नोट: यहां दिए गए वॉल...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

पल्स-चेस विधियों बरकरार कोशिकाओं में प्रोटीन तह के वैज्ञानिकों की समझ विकसित करने के लिए आवश्यक हो गया है । जब तक हम एक तरीका है कि संभव के रूप में सामांय है प्रदान करने का प्रयास किया है, इस दृष्टिकोण लग...

यहां तक कि अपेक्षाकृत सरल प्रोटीन की तह कई अलग तह एंजाइमों, आणविक chaperones, और आबंध संशोधनों1शामिल है । इन विट्रो में प्रक्रियाओं का एक पूरा पुनर्गठन व्यावहारिक रूप से असंभव है, शामिल विभिंन घटकों की विशाल संख्या दी । यह अत्यधिक वांछनीय है, इसलिए, vivo मेंप्रोटीन तह अध्ययन करने के लिए, जीवित कोशिकाओं में । रेडियोधर्मी पल्स-चेस तकनीक संश्लेषण, तह, परिवहन, और उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन के क्षरण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित ।
३५S-लेबल methionine/cysteine के साथ एक छोटी नाड़ी के दौरान प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग, एक रेडियोधर्मी लेबल के अभाव में एक पीछा द्वारा पीछा किया, व्यापक सेलुलर वातावरण में नव संश्लेषित प्रोटीन की आबादी के विशिष्ट ट्रैकिंग की अनुमति देता है । फिर, लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation के माध्यम से अलग किया जा सकता है और एसडीएस के माध्यम से विश्लेषण-पृष्ठ या अंय तकनीकों । कई प्रोटीन के लिए, सेल के माध्यम से उनकी यात्रा एसडीएस-पृष्ठ जेल पर दिखाई दे रहे हैं कि संशोधनों के द्वारा चिह्नित है । उदाहरण के लिए, endoplasmic जालिका (ईआर) से Golgi परिसर में ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का परिवहन अक्सर N-लिंक्ड glycans के संशोधनों के साथ होता है या ओ-लिंक्ड glycans2,3के अलावा । इन संशोधनों के कारण स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में बड़ी वृद्धि होती है, जो एसडीएस में गतिशीलता परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है-पृष्ठ. परिपक्वता भी proteolytic दरारें द्वारा चिह्नित किया जा सकता है, जैसे सिग्नल पेप्टाइड दरार या समर्थक के हटाने पेप्टाइड्स, स्पष्ट आणविक द्रव्यमान है कि आसानी से एसडीएस पर पीछा किया जा सकता में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप-पृष्ठ जेल4. रेडियोधर्मिता जैसे cycloheximide चेस, जहां उपंयास प्रोटीन संश्लेषण रोका जाता है के रूप में तुलनीय तकनीक पर काफी लाभ है, के रूप में अब उपचार कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे है और पुराने के बहुमत से बाहर नहीं है, स्थिर राज्य प्रोटीन से विश्लेषण, के रूप में कुछ प्रोटीन है आधा दिनों की रहती है । दोनों और कम करने की स्थिति के तहत प्रोटीन की तुलना डाइसल्फ़ाइड बांड गठन के विश्लेषण की अनुमति देता है, कई स्रावी प्रोटीन की तह में एक महत्वपूर्ण कदम4,5,6, 7.
यहां हम प्रोटीन तह और बरकरार कोशिकाओं में परिवहन के विश्लेषण के लिए एक सामांय विधि का वर्णन, एक रेडियोधर्मी पल्स-चेस दृष्टिकोण का उपयोग कर । जब तक हम के रूप में संभव के रूप में विस्तृत विधि प्रदान करने का उद्देश्य है, प्रोटोकॉल अनुकूलन क्षमता के लिए एक लगभग असीम संभावना है और अनुकूलन प्रत्येक पाठक विशिष्ट प्रोटीन का अध्ययन करने की अनुमति होगी ।
दो वैकल्पिक पल्स चेस प्रोटोकॉल, अनुयाई कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.१) और निलंबन कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.२) प्रदान की जाती हैं । यहां उपलब्ध कराई गई शर्तों को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के माध्यम से व्यक्त एक प्रोटीन कल्पना करने के लिए पर्याप्त हैं । यदि पाठक खराब व्यक्त प्रोटीन या विभिन्न posttreatment स्थितियों, जैसे कई immunoprecipitations के साथ काम कर रहा है, यह उचित रूप से पकवान आकार या सेल संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है ।
निलंबन पल्स चेस के लिए, हर समय बिंदु पर लिया चेस नमूने सभी कोशिकाओं की एक ट्यूब से लिया जाता है । नाड़ी के बाद धो चरण छोड़ दिए जाते हैं; इसके बजाय, ३५एस के आगे निगमन unlabel्ड methionine और cysteine की एक उच्च अतिरिक्त के साथ कमजोर पड़ने से रोका जाता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेडियोधर्मी ३५एस का उपयोग करें-लेबल cysteine और methionine सेलुलर प्रोटीन तह प्रक्रियाओं का पालन करें । रेडियोधर्मी एजेंट के साथ सभी आपरेशनों के ऑपरेटर और रेडियोधर्मी विकिरण के लिए पर्यावरण के किसी भी जोखिम को कम करने और एक नामित प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने के लिए उपयुक्त सुरक्षात्मक उपायों का उपयोग किया जाना चाहिए । पल्स-चेस लेबलिंग तकनीक के रूप में कम पल्स बार में अपेक्षाकृत अक्षम है (< 15 मिनट), रेडियोधर्मिता के प्रारंभिक राशि के कम से 1% नव संश्लेषित प्रोटीन में शामिल किया गया है. immunoprecipitation के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के संवर्धन के बाद, एसडीएस के लिए नमूना पृष्ठ रेडियोधर्मिता की प्रारंभिक राशि के कम से ०.०५% होता है ।
हालांकि ३५एस methionine और cysteine लेबलिंग मिश्रण स्थिर है, कुछ अपघटन, अस्थिर रेडियोधर्मी यौगिकों उपज, हो जाएगा । शोधकर्ता और तंत्र की रक्षा के लिए कुछ सावधानियां बरती जानी चाहिए । शोधकर्ता हमेशा स्थानीय विकिरण सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए और एक प्रयोगशाला कोट और (डबल) दस्ताने के अलावा एक चारकोल नर्सिंग मास्क, पहन सकते हैं । ३५एस methionine और cysteine के साथ शेयर शीशियों हमेशा एक धुएं डाकू में खोला जाना चाहिए, या एक स्थानीय आकांक्षा बिंदु के तहत । ज्ञात प्रयोगशाला प्रदूषित धब्बे केंद्रापसारक, पिपेट, पानी स्नान, मशीन, और शेखर हैं । इन क्षेत्रों के संदूषण एक लकड़ी का कोयला फिल्टर के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करके कम है, सकारात्मक मुहर microcentrifuge ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें), पानी स्नान में मछलीघर लकड़ी का कोयला स्पंज, चारकोल फिल्टर कागज नाड़ी में चिपके-चेस व्यंजन, आकांक्षा प्रणाली में लकड़ी का कोयला गार्ड, और बर्तन और मशीन और भंडारण कंटेनरों में लकड़ी का कोयला युक्त अनाज की नियुक्ति ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

रेडियोधर्मी पल्स-चेस लेबलिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो अपने कार्यात्मक सेलुलर स्थान के लिए परिवहन, और जीवित कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन की गिरावट का अध्ययन करने के लिए । लघु (पल्स) radiolabeling बार (< 30 मिनट) और कसकर नियंत्रित चेस बार का उपयोग करके, यह कुल प्रोटीन पूल का केवल एक छोटा सा अंश लेबल और इसके तह का पालन करने के लिए संभव है । जब एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और immunoprecipitation के साथ (अनुरूपण-विशिष्ट) एंटीबॉडी को कम करने के साथ संयुक्त, तह प्रक्रियाओं महान विस्तार में जांच की जा सकती है । इस प्रणाली में घुलनशील प्रोटीन, एकल और बहु-पास transmembrane प्रोटीन, भारी एन और ओ-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, और प्रोटीन के साथ और व्यापक डाइसल्फ़ाइड के बिना गुणों में एक विशाल भिन्नता के साथ प्रोटीन की तह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संबंध. पल्स-चेस तरीकों अतिरिक्त सुविधाओं की एक सीमा में काइनेटिक अध्ययन के आधार हैं, सह और posttranslational संशोधनों, oligomerization, और बहुलकीकरण सहित, अनिवार्य रूप से जंम से मृत्यु तक एक प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति । नाड़ी-चेस प्रोटीन तह पर अध्ययन वृद्धि हुई लौकिक संकल्प और शारीरिक जानकारी प्रदान करके इन विट्रो में प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अंय जैव रासायनिक और भौतिक तरीकों के साथ पूरक हैं । इस समाचार पत्र के भीतर वर्णित तरीकों को आसानी से अनुकूलित कर रहे है लगभग किसी भी प्रोटीन है कि स्तनधारी या कीट-कोशिका प्रणालियों में व्यक्त किया जा सकता है की तह का अध्ययन ।

तह और एक अनुयाई पल्स चेस से एचआईवी-1 gp120 के स्राव चित्रा 2में दिखाया गया है । (संख्या में NR) जेल gp120 की ऑक्सीडेटिव तह दिखाता है । तुरंत 5 मिनट के पल्स लेबलिंग के बाद (0 मिन चेस) gp120 एक फैलाना ?...

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Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

यहाँ हम एक सामान्य पल्स-चेस विधि है कि तह, परिवहन के काइनेटिक विश्लेषण की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, और प्रोटीन की गिरावट जीवित कोशिकाओं में पालन किया जाना है ।

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

रेडियोधर्मी पल्स चेस ३५ एस लेबल मेथियोनाइन और सिस्टीन का उपयोग कर अभी भी जीवित कोशिकाओं में समय के साथ प्रोटीन जैव संश्लेषण की जांच करने के लिए केवल जैव रासायनिक तरीकों है । प्रोटीन बायोसिंथेसिस में अनुवाद, तह और असेंबली, और तस्करी और गिरावट दोनों शामिल हैं। सह और अनुवाद के बाद प्रोटीन संशोधनों के विश्लेषण के साथ रेडियोधर्मी पल्स चेस के संयोजन, जैसे disulfide बांड गठन और acetylation समय के साथ प्रोटीन के विश्वास की जांच करने के लिए एक संवेदनशील और मात्रात्मक परख प्रदान करता है ।इस प्रक्रिया के लिए अच्छा फोकस और एक्सपेरिमेंटल हैंडलिंग जरूरी है । अच्छी तैयारी महत्वपूर्ण है, बफ़र्स की तरह, अपने रेडियोधर्मी कार्यक्षेत्र, और एक स्पष्ट कार्यक्रम । यह वीडियो रेडियोधर्मी पल्स चेस प्रोटोकॉल के कंधे पर एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है ।प्रक्रिया का प्रदर्शन हुई यिंग येह, हमारी प्रयोगशाला से एक पीएचडी उम्मीदवार होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित बीज ट्रांसफेक्ट और संस्कृति कोशिकाएं। पल्स चेस से पहले, माइक्रोस्कोप के माध्यम से अपनी कोशिकाओं का निरीक्षण करें।इसके बाद, बर्तन धोने बफर के दो मिलीलीटर के साथ धोते हैं। और भुखमरी माध्यम के दो मिलीलीटर कोशिकाओं के लिए और 15 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में व्यंजन जगह है । सुनिश्चित करें कि आपकी पल्स चेस सेट अप क्रम में है।पानी के स्नान में रैक के लिए व्यंजन स्थानांतरित, पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम । सुनिश्चित करें कि व्यंजन पानी के संपर्क में हैं, लेकिन तैरते नहीं हैं। इसके बाद टाइमर शुरू करें।40 सेकंड में, भुखमरी माध्यम को आकांक्षी करें। माइक्रो पिपेट का उपयोग करके, पल्स सॉल्यूशन के 600 माइक्रोलीटर तैयार करें। ठीक एक मिनट में, धीरे से पकवान के केंद्र में पल्स समाधान जोड़ें।भुखमरी माध्यम को हटाने और एक मिनट के अंतराल पर शेष व्यंजनों के लिए नाड़ी समाधान जोड़ने की इस प्रक्रिया को दोहराएं। ठीक 11 मिनट में और सभी निम्नलिखित व्यंजनों के लिए, पल्स चेस योजना के अनुसार, शून्य मिनट चेस नमूने को छोड़कर, सीधे डिश में चेस माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें। चेस माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे नए चेस माध्यम के दो मिलीलीटर के साथ बदलें।एक मिनट के अंतराल पर सभी शेष व्यंजनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। जब टाइमर ठीक 16 मिनट पढ़ता है, तो लेबलिंग को रोकने के लिए, पल्स मीडियम के शीर्ष पर, सीधे शून्य मिनट चेस डिश में चेस मीडियम के दो मिलिटर्स जोड़ें। तुरंत माध्यम को आकांक्षी करें।एक ठंडा एल्यूमीनियम प्लेट के लिए पकवान हस्तांतरण और बर्फ ठंडे स्टॉप बफर के दो militers जोड़ें । अन्य सभी व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। प्रत्येक चेस डिश को प्रत्येक चेस समय के अंत से दो मिनट पहले जल स्नान करने के लिए इनक्यूबेटर से वापस स्थानांतरित करें।प्रत्येक पकवान के लिए सटीक पीछा समय पर, पीछा माध्यम आकांक्षी और एक ठंडा एल्यूमीनियम प्लेट के लिए पकवान हस्तांतरण । बर्फ कोल्ड स्टॉप बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें। बर्फ पर सभी व्यंजन छोड़ दें और बफर को तब तक रोकें जब तक कि कोशिकाओं को lyse करने का समय न हो।फिर स्टॉप समाधान को एस्पिरेट करें और सभी व्यंजन धोएं। बर्फ ठंड बंद समाधान के दो मिलीलीटर के साथ एक ही समय में तीन । स्टॉप सॉल्यूशन को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और एक बार में दो व्यंजनों में लाइसिस बफर के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, पकवान की सतह को अच्छी तरह से कुरेदें, लेकिन धीरे-धीरे lysate मिश्रण करने के लिए। प्रत्येक डिश से 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 15, 000 से 20, 000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र नाभिक गोली।निलंबन कोशिकाओं पर पल्स चेस के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में प्रति टाइम पॉइंट पांच मिलियन कोशिकाओं को संग्रहित किया जाता है। पाठ में वर्णित भुखमरी प्रक्रिया का प्रदर्शन करें। 15 मिनट के लिए पानी स्नान में भुखमरी प्रक्रिया के बाद, टाइमर शुरू करें।ठीक एक मिनट में, कोशिकाओं और मिश्रण करने के लिए भंवर युक्त ट्यूब के लिए सीधे बिना पतला लेबल के २७५ microcuries जोड़ें । ठीक 11 मिनट में, लेबलिंग को रोकने के लिए चेस मीडिया के चार मिलीलीटर जोड़ें। और तुरंत बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक मिलीलीटर स्थानांतरित करें जिसमें लेबलिंग को रोकने के लिए बर्फ कोल्ड स्टॉप समाधान के नौ मिलीलीटर शामिल हैं।प्रत्येक लगातार पीछा समय बिंदु के लिए बंद समाधान के नौ मिलीलीटर युक्त बर्फ पर एक ट्यूब के लिए चेस के एक मिलीलीटर स्थानांतरित करने की इस प्रक्रिया को दोहराएं। इम्यूनोप्रिपिटेशन के बाद, अंतिम धोने को पूरी तरह से एस्पिरेट करें। टीई बफर और भंवर के 20 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें।कम करने वाले एजेंट के बिना दो एक्स नमूना बफर के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर नमूनों और फिर पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गर्म। भंवर नमूनों फिर से।एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज। एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में गैर-कम सुपरनेट के 19 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें जिसमें 500 मिलीमोलर डीडीटी का एक माइक्रोलीटर होता है। यदि आवश्यक हो, तो नमूना को जल्दी से अपकेंद्री करें ताकि सभी तरल पदार्थ नीचे हों।और पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । कम सैंपल को ठंडा होने दें और फिर भंवर। एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12, 000 बार जी पर कम और गैर-कम नमूनों दोनों को अपकेंद्रित्र करें, और फिर सभी नमूनों में एक मोलर एनईएम के 1.1 माइक्रोलीटर जोड़ें।इस अध्ययन में, एक रेडियोधर्मी पल्स चेस दृष्टिकोण बरकरार कोशिकाओं में प्रोटीन तह और परिवहन का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक अनुयायी पल्स चेस से एचआईवी एक GP120 की तह और स्राव यहां दिखाया गया है । नॉन-कमिंग जेल GP120 के ऑक्सीडेटिव फोल्डिंग को दिखाता है।पल्स लेबलिंग के तुरंत बाद, यह जेल में एक फैलाना बैंड के रूप में दिखाई देता है। जैसे-जैसे पीछा बढ़ता है, बैंड जेल को और भी अधिक फैलाना तह मध्यवर्ती के माध्यम से स्थानांतरित कर देता है जब तक कि यह तंग बैंड में जमा नहीं होता है जो मूल रूप से GP120 पर मुड़ा हुआ प्रतिनिधित्व करता है। ऐसा इसलिए होता है क्योंकि डिसल्फाइड बॉन्ड्स के बनने से प्रोटीन की कॉम्पैक्टनेस बढ़ जाती है, जिससे यह पूरी तरह से कम प्रोटीन की तुलना में तेजी से माइग्रेट हो जाता है।कम जेल पर, डिसल्फाइड बांड और सभी अणुओं को कम कर दिया गया है और मोबिल्टी को प्रभावित नहीं करते हैं। इस प्रकार, गतिशीलता में अंतर केवल आणविक द्रव्यमान में परिवर्तन का परिणाम है । कम सिग्नल पेप्टाइड अंकलवित फॉर्म से कम सिग्नल पेप्टाइड क्लीव्ड फॉर्म में समय के साथ बदलाव GP120 के पोस्ट-ट्रांसलेशनल सिग्नल पेप्टाइड क्लीवेज का प्रतिनिधित्व करता है।सिग्नल पेप्टाइड के नुकसान के कारण गतिशीलता बढ़ जाती है जो पीछा के दौरान बढ़ जाती है क्योंकि अधिक प्रोटीन देशी गुना प्राप्त करते हैं और अपने सिग्नल पेप्टाइड खो देते हैं। दोनों को कम करने और जेल को कम करने पर, संकेत GP120 के स्राव के कारण लगभग एक घंटे के बाद से कम करने के लिए शुरू होता है । मीडिया का विश्लेषण कर इसकी निगरानी की जा सकती है।यह विधि ऑर्गेनॉइड सेल मॉडल सहित किसी भी सेल लाइन पर लागू होती है। लेकिन सफलता बहुत ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है । इस प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, अपने व्यंजनों को चिह्नित करें और पूरे प्रयोग में इस आदेश को रखें।सुनिश्चित करें कि भुखमरी माध्यम जोड़ने से पहले सब कुछ तैयार है। यह प्रयोग की शुरुआत है। और अपने प्रयोगशाला समय अपने दोस्त है, लेकिन अपने सबसे बड़े दुश्मन हो सकता है जब आप तैयार नहीं कर रहे हैं ।बिल का पीछा सीमित प्रोटेओलिसिस के साथ जोड़ा जा सकता है समय के साथ प्रोटीन की पूरी संपत्ति की जांच । इसके अलावा अलग निर्वाचित फ्रीजर तरीकों कुल्ला या कठोरता या शुल्क मतभेदों के विश्लेषण की अनुमति होगी । शोधकर्ता और तंत्र की रक्षा के लिए, सभी स्थानीय विकिरण सुरक्षा नियमों का पालन किया जाना चाहिए ।और प्रोटोकॉल के अनुसार सुरक्षात्मक उपाय किए जाने चाहिए। ध्यान दें कि आपके एसटीटीएच पेज के लिए उपयोग किया जाने वाला आपका एक्रिलैमाइड न्यूरोटॉक्सिक है।

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

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Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

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Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

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