Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

著者過去 Braakman ラボのすべてのメンバーに感謝し実りある議論のため、現在、この記事で紹介する手法の開発に役立ちます。このプロジェクトは、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) N ° 235649 の下で欧州研究評議会とオランダ組織の科学的研究 (NWO) エコー プログラム N ° 711.012.008 の下の両方から資金を受けています。

すべての放射性試薬およびプロシージャは、ユトレヒト大学放射線のローカル規則および規制に従った処理されました。
1. パルス追跡
<ol><li>
付着性のセルのためのパルス追跡 注: ここで指定されたボリュームは、60 mm 細胞培養皿に基づいています。35 mm または 100 mm の皿、1/2 または 2 をそれぞれのボリュームを掛けます。このプロトコルは、0、15、30、6...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

パルス追跡方法はそのままなセルのフォールディングの科学者の理解を深めるために不可欠されています。できるだけ一般的な方法を提供しようとしている我々 は、折りたたみ、トランスポート、および蛋白質の細胞内中に発生するさまざまなプロセスを研究するバリエーションはほぼ無限の可能性がありますこのアプローチ。
料理の付着性細胞を用いたパルス追跡を?...

比較的単純なタンパク質の折り畳み多くの折り畳み式の異なる酵素、分子シャペロンと共有結合の変更1が含まれます。膨大な数に関与するさまざまなコンポーネントでは、このこれらのプロセスの in vitroの完全な再構築は実質的に不可能です。したがって、生細胞の生体内でフォールディングの研究に非常に望ましいです。放射性パルス追跡技術は、合成、折りたたみ、トランスポート、および彼らの自然環境におけるタンパク質の分解を勉強するための強力なツールを証明します。
新陳代謝35S] メチオニン ・ システインと短パルス中に蛋白質の分類、放射性ラベルのない状態でチェイスに続いて、新生タンパク質の細胞より広い環境の人口の特定の追跡ができます。ターゲット蛋白質分離を介して免疫沈降をすることができ、経由でSDS のページまたはその他の手法を分析します。多くのタンパク質の SDS ページのゲルの表示変更がセルを介して彼らの旅はマークされます。たとえば、ゴルジ体小胞体 (ER) から糖タンパク質の輸送はしばしば N リンク糖鎖の変更または o-結合糖鎖2,3の追加を伴います。これらの変更は、SDS ページの移動変化によって見ることができる明白な分子量の大きい増加を引き起こします。信号ペプチド胸の谷間などの pro-ペプチドの SDS ページのゲルの4に簡単に続くことができる分子の質量変化により除去の蛋白質分解開裂によって成熟を付けることもできます。放射能はシクロヘキシミド追うなど同等の技術でかなりのメリット新規タンパク質合成ができない長い治療細胞に有毒であるから古い、定常状態のタンパク質の大部分を排除しないと、分析、いくつかのタンパク質の半減期日があります。パンピングの両方の下で蛋白質の比較、ジスルフィド結合形成、多く分泌蛋白質4,5,6,の折り畳み過程における重要なステップの解析条件を減らすことができます7。
ここで放射性パルス追跡方法を使用してタンパク質の折り畳みとそのまま細胞内輸送の分析の一般的な方法を説明します。としてメソッドを提供している間で、プロトコル、可能な限り詳細な適応能力のほぼ無限の可能性を持って、各リーダーの特定蛋白質を研究する最適化できるようになります。
2 つの代替パルス追跡プロトコル、付着性のセル (ここで提示されたプロトコルの手順 1.1) のいずれかと懸濁細胞 (ここで提示されたプロトコルの手順 1.2) の 1 つを提供しています。ここでは、媒体式レベルで表現される蛋白質を可視化するための十分な条件が記載されて。リーダーが使用して不十分に表現された蛋白質または複数の immunoprecipitations などの閉口条件場合皿のサイズを増やすか、携帯番号を適切に必要です。
懸濁液パルス追跡の各時点で追跡サンプルがセルの単管から取得されます。洗浄の手順後、パルスは省略されます。代わりに、さらに35S の設立は、ラベル付けされていないメチオニンとシステインの高い過剰希釈によって防がれます。
示されたプロトコルは細胞の蛋白質折りたたみのプロセスに従うこと放射性35S ラベル システインとメチオニンを使用します。放射性試薬の操作は、オペレーターと放射性放射環境の任意の露出を最小限にし、指定のラボで実行する適切な保護措置を使用して実行する必要があります。パルス追跡として標識法は比較的非効率的短パルス時 (< 15 分)、新生タンパク質に組み込まれている開始放射能量の 1% 未満。免疫沈降を介してターゲットのタンパク質の濃縮、SDS ページのサンプルには放射能の開始量の 0.05% 未満が含まれています。
35S メチオニンとシステインの分類の組合せが安定、揮発性の放射性化合物をもたらすいくつかの分解が発生します。研究者と装置を保護するためにいくつかの注意が取られなければ必要があります。研究者は局所放射線安全規則に従う必要があります常に、マスク、白衣、手袋 (ダブル) ほかを看護炭を着ることがあります。35S メチオニンとシステインのストックのバイアルは、発煙のフードまたはローカル吸引ポイントの下で常に開いてください。知られている実験室汚染スポットは、シェーカー、インキュベーター、水浴ピペット遠心分離機です。活性炭フィルター、肯定的なシール マイクロ遠心チューブ用 (材料の表を参照してください)、水風呂、炭濾紙パルス追跡皿に接着で水族館炭スポンジ ピペット チップを使用して、これらの地域の汚染が減少します。吸引システムとインキュベーターや貯蔵容器に炭の粒を含んでいる皿の配置で炭のガード。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

放射性パルス追跡ラベル構造の成熟、彼らの機能細胞の場所、生きているセルのターゲット蛋白質の分解輸送を研究するための強力なツールです。Radiolabeling 時間 (パルス) を使用して (< 30 分) チェイス回が厳重とフォールディングに従う総蛋白プールの小さい一部分だけをラベルすることが可能です。パンピング/削減 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と (コンホメーション特異) 抗体で免疫沈降と組み合わせると、プロセスを折りたたみは非常に詳細に調べることができます。このシステムは、分析の可溶性タンパク質、単一および複数パスの膜貫通タンパク質、大きく N と O 糖タンパク質などの性質の巨大な変化とタンパク質とタンパク質豊富なジスルフィドと折りたたみに使用されています接合。パルス追跡方法は、co、翻訳後修飾、重合と重合、基本的に誕生から死への蛋白質の分析が可能などの追加機能の範囲に速度論の根拠です。タンパク質の折り畳みのパルス追跡研究は増加の時間分解能と生理学的情報を提供することによって体外タンパク質研究のため他の生化学的および生物物理学的方法で補完されます。本稿に記載されている方法は哺乳動物または昆虫細胞システムで表現できるあらゆる蛋白質ほとんどのフォールディング研究に簡単に合わせられます。

折りたたみと付着性パルス追跡から HIV 1 gp120 の分泌は、図 2に示すです。Gp120 の酸化的フォールディング パンピング ゲル (セル NR の図) を示しています。パルス入力後すぐに 5 分 (0 分チェイス) gp120 のラベリング ゲルでより高いびまん性バンドとして表示され、チェイスが進むにつれてバンドはゲルによってダウン移行, さらたみ中間体 (IT) そ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

ここで折りたたみ、トランスポート、および生きているセルで続かれるべき蛋白質の分解の速度論的解析を可能にする一般的なパルス追跡法のためのプロトコルについて述べる。

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

35 S標識メチオニンとシステインを使用した放射性パルスチェイスは、依然として生細胞における時間とともにタンパク質生合成を調査する唯一の生化学的方法です。タンパク質の生合成は、翻訳、折りたたみ、組み立て、人身売買と劣化の両方をカバーしています。放射性パルス追跡と、ジスルフィド結合形成およびアセチル化などの共翻訳後タンパク質修飾の分析と組み合わせることで、タンパク質の信仰を時間とともに調査するための敏感で定量的なアッセイが得られます。この手順では、良い焦点と実験的な処理が必要です。バッファー、放射性ワークスペース、明確なスケジュールなど、良い準備が不可欠です。このビデオは放射性脈拍追跡プロトコルの肩の上に明確な説明を提供する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のpHd候補であるHui Ying Yeohです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、トランスフェクト細胞および培養細胞をシードします。パルスチェイスの前に、顕微鏡を通して細胞を検査してください。次に、2ミリリットルの洗浄バッファーで皿を洗います。そして、細胞に飢餓培地の2ミリリットルと15分間5%の二酸化炭素と摂氏37度で加湿インキュベーターに料理を置きます。パルスチェイスのセットアップが整っていることを確認してください。水浴場のラックに皿を移し、摂氏37度に事前に温めます。食器が水と接触していることを確認しますが、浮かび上がらないようにしてください。次に、タイマーを開始します。40秒で、飢餓培地を吸引する。マイクロピペットを使用して、600マイクロリットルのパルス溶液を引き出します。ちょうど1分で、皿の中央にパルス溶液を静かに加えます。飢餓培地を取り除き、残りのディッシュのパルス溶液を1分間隔で追加するこのプロセスを繰り返します。ちょうど11分とすべての次の料理のために、パルスチェイススキームによると、ゼロ分チェイスサンプルを除いて、皿に直接チェイスメディアの2ミリリットルを追加します。チェイスメディアを吸引し、新鮮なチェイスメディアの2ミリリットルに置き換えます。残りの皿すべてに対してこのプロセスを 1 分間隔で繰り返します。タイマーが正確に16分を読むとき、パルスメディアの上にゼロ分チェイスディッシュにチェイスメディアの2つのミリターを直接追加して、ラベリングを停止します。すぐに培地を吸引する。冷却されたアルミニウム板に皿を移し、氷の冷たい停止バッファーの2つのミリターを追加します。他のすべての料理を摂氏37度のインキュベーターに移します。各チェイスディッシュをインキュベーターから各チェイス時間の終了の2分前にウォーターバスに戻します。各皿の正確なチェイスタイムで、チェイスメディアを吸引し、冷却されたアルミニウム板に皿を移します。氷冷停止バッファーの 2 ミリリットルを追加します。.すべての皿を氷の上に置き、細胞をライスする時間があるまで緩衝液を停止します。その後、停止溶液を吸引し、すべての皿を洗います。氷冷停止溶液の2ミリリットルと同時に3つ。停止溶液を完全に吸引し、一度に2つの皿に600マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。セルスクレーパーを使用して、皿の表面を十分に削り取りますが、そっとlysateを混ぜます。各皿から新鮮な1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにリセートを移します。遠心分離機は、15,000〜20,000Gで4°Cで10分間、核をペレットする。サスペンション細胞のパルスチェイス用に1つの50ミリリットルチューブ内のタイムポイントあたり500万個の細胞を収集する。テキストの説明に従って、飢餓処理を実行します。水浴で15分間の飢餓手順の後、タイマーを開始します。ちょうど1分で、細胞を含むチューブに直接希釈されていないラベルの275マイクロキュリーを追加し、混合するために渦巻きます。ちょうど11分で、ラベリングを停止するためにチェイスメディアの4ミリリットルを追加します。そしてすぐに9ミリリットルの氷冷停止溶液を含む氷上の15ミリリットルのチューブに1ミリリットルを移して、ラベリングを止めます。連続するチェイスタイムポイントごとに9ミリリットルの停止溶液を含む氷上のチューブに1ミリリットルのチェイスを移すこのプロセスを繰り返します。免疫沈降後、最後の洗浄を完全に吸引する。20マイクロリットルのTEバッファーと渦でビーズを再懸濁します。20マイクロリットルの2つのXサンプルバッファーを還元剤なしで追加します。サンプルを渦を出し、摂氏95度で5分間加熱します。再びサンプルを渦。室温で12,000倍Gで1分間遠心分離機を用いた。500ミリモルDDTの1マイクロリットルを含む新鮮なマイクロ遠心チューブに、非減塩上清の19マイクロリットルを移します。必要に応じて、すべての液体が底部になるようにサンプルを素早く遠心分離します。そして、摂氏95度で5分間加熱します。減らされたサンプルを冷やし、次に渦を冷まします。遠心分離機は、1分間室温で12,000倍Gで減少したサンプルと非還元サンプルの両方を1分間、1.1マイクロリットルの1モルNEMをすべてのサンプルに加えます。本研究では、放射性パルスチェイスアプローチを用いて、タンパク質のフォールディングを分析し、無傷の細胞内で輸送する。付着パルスチェイスからのHIV 1 GP120の折りたたみと分泌をここに示す。非還元ゲルは、GP120の酸化フォールディングを示す。パルス標識の直後に、ゲルの中で拡散バンドとして表示されます。追跡が進むにつれて、バンドはGP120でネイティブに折り畳まれたことを表すタイトなバンドに蓄積するまで、さらに拡散フォールディング中間体を通してゲルを下に移動します。これは、二硫化物結合の形成がタンパク質のコンパクト性を高め、完全に減少したタンパク質よりも速く移行する原因となると起こります。還元ゲルでは、ジスルフィド結合とすべての分子が還元され、モビイルティに影響を与えない。したがって、移動性の違いは、分子質量の変化の結果に過ぎません。減少したシグナルペプチドの切断形態から還元シグナルペプチド切断形態への経時シフトは、GP120のトランスレーショナルシグナルペプチド切断を表す。より多くのタンパク質がネイティブフォールドを達成し、そのシグナルペプチドを失うように、チェイス中に増加するシグナルペプチドの損失のために移動度が増加します。非還元および還元ゲルの両方で、GP120の分泌により、信号は約1時間以降に減少し始めます。メディアを分析することで監視できます。この方法は、オルガノイド細胞モデルを含む任意の細胞株に適用可能である。しかし、成功は、目的のタンパク質の発現レベルに大きく依存します。この手順を開始する前に、料理に印を付け、実験を通してこの順序を維持してください。飢餓培地を追加する前に、すべてが準備されていることを確認してください。これが実験の始まりです。そして、あなたのラボの時間はあなたの友人ですが、あなたが準備ができていないときにあなたの最大の敵になることができます。ビルの追跡は、時間とともにタンパク質の完全な財産を調査するために限られたタンパク質分解と組み合わせることができます。また、選択された異なる冷凍庫の方法では、すすいまたは厳格化または電荷差の分析が可能になります。研究者と装置を保護するために、すべての地域の放射線安全規則に従わなければなりません。そして、保護措置はプロトコルに従って取られるべきです。あなたのSTHページに使用されるアクリルアミドは神経毒性であることに注意してください。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...