Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Forfatterne takker alle medlemmer av Braakman lab, forbi og presentert for diskusjonene fruktbart og å utvikle metodene i denne artikkelen. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra både europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Nederland organisasjonen av vitenskapelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.

Alle radioaktivt reagenser og prosedyrer ble håndtert i samsvar med lokale Universitetet i Utrecht stråling regler og forskrifter.
1. pulse Chase
<ol><li>
Puls jakten på tilhenger celler Merk: Volumene gitt her er basert på 60 mm celle kultur retter. For 35 mm eller 100 mm retter, multiplisere volumene med 1/2 eller 2, henholdsvis. Denne protokollen bruker en puls tid 10 min og chase ganger 0, 15, 30, 60, 120 og 240 minutter. Disse kan endres avhengig av spesifikke pr...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Puls-jage metoder har vært avgjørende for utvikling av forskernes forståelse av protein folding i intakt celler. Mens vi har forsøkt å gi en metode som er generelt som mulig, har dette potensial for nesten ubegrensede varianter å studere ulike prosesser som oppstår under den folding, transport, og livet til proteiner i cellen.
Når du utfører en puls jage bruke tilhenger celler i retter, er det viktig å behandle hver rett det samme så mye som mulig, som en egen rett brukes for hvert ...

Folding av selv relativt enkel proteiner involverer mange ulike folding enzymer, molekylær chaperones og kovalente modifikasjoner1. En komplett rekonstituering av disse prosessene i vitro er praktisk talt umulig, gitt det store antallet ulike komponenter involvert. Det er svært ønskelig, derfor, å studere protein folding i vivoi live celler. Radioaktivt puls-jage teknikker være et kraftig verktøy for å studere syntese, folding, transport og nedbrytning av proteiner i sitt naturlige miljø.
Den metabolske merking av proteiner under en kort puls med 35S-merket metionin/cystein, etterfulgt av en jakt i fravær av en radioaktiv etikett, tillater spesifikk sporing av innbyggere nylig syntetisert proteiner i bredere mobilnettet miljøet. Deretter målet proteiner kan være isolert via immunoprecipitation og analysert via SDS-siden eller andre teknikker. For mange proteiner, er sin reise gjennom cellen preget av endringer som er synlige på SDS side gel. For eksempel er transport av glycosylated proteiner fra det endoplasmatiske retikulum (ER) til Golgi komplekset ofte ledsaget av modifikasjoner av N-koblede glykaner eller tillegg av O-koblede glykaner2,3. Disse endringene føre til store økninger i tilsynelatende molekylær masse, som kan sees av mobilitet endringer i SDS-side. Modning kan også merkes av proteolytisk cleavages, som signal-peptid spalting eller fjerning av pro-peptider, noe som resulterer i endringer i tilsynelatende molekylær massen som kan følges lett på SDS-side gel4. Radioaktivitet har betydelige fordeler fremfor sammenlignbare teknikker som gapestokk jager, hvor romanen proteinsyntese er forhindret, lengre behandlinger er giftig for celler og utelukker ikke flertallet av eldre, stabil proteiner fra den analyse, som noen proteiner har dager. Sammenligning av proteiner under både nonreducing og redusere forholdene tillater analyse av disulfide obligasjon formasjonen, et viktig skritt i folding av mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generell metode for analyse av proteinfolding og transport i intakt celler, med en radioaktiv puls-jage tilnærming. Mens å gi metoden som detaljert som mulig, protokollen har en nesten ubegrensede muligheter for tilpasning og vil tillate optimalisering å studere hver leserens spesifikke proteiner.
To alternative puls-jage protokoller, én for tilhenger celler (trinn 1.1 av protokollen presenteres her) og én for suspensjon celler (trinn 1.2 av protokollen presenteres her) er gitt. Betingelsene gis her er nok å visualisere et protein uttrykt med middels til høy-uttrykk nivåer. Hvis leseren arbeider med dårlig uttrykt proteiner eller ulike posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendig å forstørre parabolen eller celle nummer riktig.
For suspensjon puls chase, er chase prøver tatt på hvert tidspunkt alle tatt fra en enkelt rør av celler. Vask trinnene etter pulsen utelates; i stedet ytterligere hindres innlemmelse av 35S av fortynning med en høy overskudd av umerkede metionin og cystein.
Presentert protokollene bruk radioaktivt 35S-merket cystein og metionin for å følge mobilnettet protein-folding prosesser. Alle operasjoner med radioaktive reagenser bør utføres med passende forholdsregler å minimere eventuelle eksponering av operatøren og miljø for radioaktiv stråling og utføres i et utpekt laboratorium. Som puls-jakten merking teknikk er relativt ineffektiv kort puls ganger (< 15 min), mindre enn 1% av startbeløpet for radioaktivitet er innarbeidet i de nylig syntetisert proteinene. Etter anriking av målet protein via immunoprecipitation inneholder utvalget for SDS siden mindre enn 0.05% av startbeløpet for radioaktivitet.
Selv om de 35S metionin og cystein merking blanding har stabilisert seg, vil noen nedbryting, gir flyktige radioaktivt forbindelser, skje. For å beskytte forskeren og apparatet, bør forholdsregler tas. Forskeren må alltid følge lokale stråling sikkerhetsreglene og kan slites trekull sykepleie maske, foruten en labfrakk og (doble) hansker. Lager ampuller med 35S metionin og cystein bør alltid åpnes i avtrekksvifte, eller under en lokal aspirasjon punkt. Kjente laboratorium forurensning flekker er sentrifuger, Pipetter, vann bad, inkubatorer og shakers. Forurensning av disse områdene reduseres ved hjelp av pipette-spisser med filtere trekull, positiv-seglet microcentrifuge rør (se Tabell for materiale), akvariet trekull svamper vann bad, trekull filter Papers limt i puls-jage retter, trekull vakt i aspirasjon systemet, og plasseringen av retter som inneholder trekull korn i inkubatorer og lagercontainere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Radioaktivt puls-jage merking er et kraftig verktøy for å studere conformational modning, transport til deres funksjonelle mobilnettet plassering og nedbrytning av målet proteiner i levende celler. Med kort (puls) radiolabeling ganger (< 30 min) og strengt kontrollert chase ganger, er det mulig å merke bare en liten brøkdel av totale protein og følge sin folding. Kombinert med nonreducing/redusere SDS-polyakrylamid gel gelelektroforese (SDS-side) og immunoprecipitation med (konformasjon-spesifikk) antistoffer, kan folding prosesser undersøkes i stor detalj. Dette systemet har blitt brukt til å analysere folding av proteiner med en stor variasjon i egenskaper som løselig proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane protein, tungt N - og O-glycosylated proteiner og proteiner med og uten omfattende disulfide binding. Puls-jage metoder er grunnlaget for kinetic studier til en rekke tilleggsfunksjoner, inkludert co og posttranslational modifikasjoner, oligomerization og polymerisasjon, i hovedsak slik at analyse av et protein fra fødselen til døden. Puls-jage studier protein folding er komplementære andre biokjemiske og Biofysiske metoder for å studere proteiner i vitro økt midlertidig løsning og fysiologiske informasjon. Metodene som beskrives i dette papiret er tilpasset lett for å studere folding av nesten alle protein som kan uttrykkes i pattedyr eller insekt-cellen.

Sammenleggbar og sekresjon av HIV-1 gp120 fra en tilhenger puls chase er vist i figur 2. Nonreducing gel (celler NR i figuren) viser oksidativt folding av gp120. Umiddelbart etter pulsen merking av 5 min (0 min chase) gp120 vises som et diffus band høyere i gel, og som til jakten pågår, bandet overfører ned gel gjennom enda mer diffust folding mellomprodukter (IT) til akkumuleres i tett bandet (NT) som representerer innfødt kastet gp120. Dette skjer som ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Her beskriver vi en protokoll for en generell puls-jage metode som tillater kinetisk analyse av folding, transport- og nedbrytning av proteiner som skal følges i levende celler.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Den radioaktive pulsjakten ved hjelp av 35 S-merket metionin og cystein er fortsatt den eneste biokjemiske metodene for å undersøke proteinbiosyntese med tiden i levende celler. Proteinbiosyntese dekker både oversettelse, sammenlegging og montering, og menneskehandel og nedbrytning. Kombinere den radioaktive pulsjakten med analyse av co-og post-oversettelse protein modifikasjoner, som disulfid lim dannelse og acetylering gir en følsom og kvantitativ analyse for å undersøke proteinets tro med tiden.Godt fokus og eksperimentell håndtering er nødvendig for denne prosedyren. God forberedelse er avgjørende, som buffere, ditt radioaktive arbeidsområde og en klar tidsplan. Denne videoen gir en klar over skuldervisningen av den radioaktive pulsjaktprotokollen.Demonstrere prosedyren vil være Hui Ying Yeoh, en pHd kandidat fra vårt laboratorium. For å begynne denne prosedyren, frø transfect og kultur celler som beskrevet i tekstprotokollen. Før pulsjakten, inspiser cellene dine gjennom mikroskopet.Deretter vasker du oppvasken med to milliliter vaskebuffer. Og to milliliter sult medium til cellene og plassere oppvasken i en fuktet inkubator på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 15 minutter. Sørg for at pulsjakten er i orden.Overfør rettene til stativene i vannbadet, forvarmet til 37 grader Celsius. Pass på at oppvasken er i kontakt med vann, men ikke flyte. Deretter starter du en tidtaker.På 40 sekunder, aspirere sult medium. Bruk en mikropipet til å tegne opp 600 mikroliter pulsløsning. På nøyaktig ett minutt, legg forsiktig pulsløsningen til midten av parabolen.Gjenta denne prosessen med å fjerne sultmediet og legge til pulsløsningen for de resterende rettene med ett minutts intervaller. På nøyaktig 11 minutter og for alle følgende retter, i henhold til pulsjaktordningen, med unntak av den null minutters jaktprøven, legg til to milliliter jagemedium direkte til parabolen. Aspirer jaktmediet og bytt det ut med to milliliter friskt jaktmedium.Gjenta denne prosessen for alle gjenværende retter med ett minutts intervaller. Når timeren leser nøyaktig 16 minutter, legg til to militers av jage medium direkte til null minutters jage parabolen, på toppen av pulsmediet, for å stoppe merking. Umiddelbart aspirere mediet.Overfør parabolen til en avkjølt aluminiumsplate og tilsett to militers av iskald stoppbuffer. Overfør alle andre retter til en inkubator ved 37 grader Celsius. Overfør hver jagerett tilbake fra inkubatoren til vannbadet to minutter før slutten av hver jakttid.På nøyaktig jakttid for hver tallerken, aspirere jagemediet og overføre parabolen til en avkjølt aluminiumsplate. Tilsett to milliliter med iskald stoppbuffer. La alle retter stå på is og stoppbuffer til det er tid til å lyse cellene.Deretter aspirerer du stoppløsningen og vasker alle retter. Tre samtidig med to milliliter iskald stoppløsning. Aspirer stoppløsningen helt og tilsett 600 mikroliter lysisbuffer til to retter om gangen.Bruk en celleskraper til å skrape overflaten av parabolen grundig, men forsiktig for å blande lysatet. Overfør lysate fra hver tallerken til et friskt 1,5 milliliter mikro sentrifugerør. Sentrifuge ved 15.000 til 20.000 G ved fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet kjernene.For pulsjakten på suspensjonsceller samling fem millioner celler per gang punkt i en 50 milliliter rør. Utfør sultprosedyren som beskrevet i teksten. Etter sultprosedyren i vannbadet i 15 minutter, start timeren.På nøyaktig ett minutt, tilsett 275 mikrocuries av ufortynnet etikett direkte til røret som inneholder celler og virvle for å blande. På nøyaktig 11 minutter, legg til fire milliliter med jaktmedia for å stoppe merkingen. Og umiddelbart overføre en milliliter til en 15 milliliter rør på is som inneholder ni milliliter iskald stopp løsning for å stoppe merking.Gjenta denne prosessen med å overføre en milliliter jakt til et rør på is som inneholder ni milliliter stoppløsning for hvert påfølgende jakttidspunkt. Etter immunforekomst, aspirer den siste vasken helt. Re-suspendere perlene i 20 mikroliter te buffer og vortex.Legg til 20 mikroliter med to X-prøvebuffer uten reduksjonsmiddelet. Vortex prøvene og varm dem deretter på 95 grader Celsius i fem minutter. Vortex prøvene igjen.Sentrifuge ved 12 000 ganger G ved romtemperatur i ett minutt. Overfør 19 mikroliter av det ikke-reduserte supernatantet til et friskt mikrocentrifugerør som inneholder en mikroliter på 500 millimolar DDT. Om nødvendig sentrifuger prøven raskt slik at alle væsker er nederst.Og varme på 95 grader Celsius i fem minutter. La den reduserte prøven avkjøles og deretter virvel. Sentrifuge både de reduserte og ikke-reduserte prøvene ved 12 000 ganger G ved romtemperatur i ett minutt, og tilsett deretter 1,1 mikroliter av en molar NEM til alle prøvene.I denne studien brukes en radioaktiv pulsjakttilnærming til å analysere proteinfolding og transport i intakte celler. Folding og sekresjon av HIV en GP120 fra en tilhenger pulsjakt er vist her. Den ikke-reduserende gelen viser oksidativ sammenlegging av GP120.Umiddelbart etter pulsmerkingen vises det som et diffust bånd høyere i gelen. Etter hvert som jakten utvikler seg, migrerer bandet ned gelen gjennom enda mer diffuse foldeprodukter til den akkumuleres i det tette båndet som representerer opprinnelig brettet på GP120. Dette skjer etter hvert som dannelsen av disulfidbindinger øker proteinets kompakthet, noe som fører til at det migrerer raskere enn det fullt reduserte proteinet.På den reduserende gelen er disulfidbindingene og alle molekylene redusert og påvirker ikke mobiilty. Som sådan er forskjeller i mobilitet bare et resultat av endringer i molekylær masse. Skiftet over tid fra den reduserte signalpeptidonetonavet form til redusert signal peptid cleaved form representerer post-translasjonell signal peptid cleavage av GP120.Mobiliteten øker på grunn av tap av signalpeptidet som øker under jakten etter hvert som flere proteiner oppnår den innfødte folden og mister signalpeptidet. På både ikke-reduserende og reduserende gel begynner signalet å avta fra omtrent en time og utover på grunn av sekresjonen av GP120. Dette kan overvåkes ved å analysere mediet.Denne metoden gjelder for alle cellelinje, inkludert organoidcellemodeller. Men suksessen avhenger sterkt av uttrykksnivået av proteinet av interesse. Før du begynner denne prosedyren, merk oppvasken din og hold denne rekkefølgen gjennom hele eksperimentet.Sørg for at alt er forberedt før du legger til sultmedium. Dette er starten på eksperimentet. Og labtiden din er din venn, men kan være din største fiende når du ikke er forberedt.Bills jakt kan kombineres med begrenset proteolyse for å undersøke hele eiendommen av proteiner med tiden. Også ulike valgte frysere metoder vil tillate analyse av skyll eller rigormorization eller lade forskjeller. For å beskytte forskeren og apparatet må alle lokale strålingssikkerhetsregler overholdes.Og beskyttende tiltak bør tas i henhold til protokollen. Vær oppmerksom på at akrylamidet, som brukes til STH-siden din, er nevrotoksisk.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...