Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Авторы поблагодарить всех членов Braakman лаборатории, прошлое и настоящее время, за их плодотворные дискуссии и помочь в разработке методов, представленных в этой статье. Этот проект получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) N ° 235649 и Нидерланды организации научных исследований (NWO) под эхо программа N ° 711.012.008.

Все радиоактивные реагентов и процедуры были обработаны в соответствии с местными Утрехтского университета излучения правил и положений.
1. Пульс Чейз
<ol><li>
Чейз импульса для адэрентных клеток Примечание: Приведенные объемы основаны на 60 мм ячейку культуры б?...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые...

Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации1. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.
Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с 35S-меченых метионина/цистеина, затем Чейз в отсутствие радиоактивных метку, позволяет отслеживания населения вновь синтезируемых белков в широкой клеточного окружения. Затем целевых белков может быть изолированным через иммунопреципитации и проанализированы через SDS-PAGE или других методов. Для многих белков их путешествие через ячейку характеризуется изменениями, которые видны на геля SDS-PAGE. Например перевозки гликозилированного белков от эндоплазменный ретикулум (ER) в комплекс Гольджи часто сопровождается изменения N-связаны гликанов или добавлением гликаны, связанный с O2,3. Эти изменения вызывают значительное увеличение в очевидной молекулярной массы, которую можно увидеть изменения подвижности в SDS-PAGE. Созревания также может быть отмечен протеолитического расщепления, например сигнал пептид спайности или удаления pro пептиды, что привело к изменениям в очевидной молекулярной массы, которая может легко следовать на гель SDS-PAGE4. Радиоактивность имеет значительные преимущества перед сопоставимых методов, таких как циклогексимида погони, где предотвратить синтез новых белков, как длительного лечения токсичны для клеток и не исключает большинство старых, устойчивого состояния белков из анализ, как некоторые белки имеют периоды полураспада дней. Сравнение белков под оба nonreducing и уменьшение условий позволяет анализ формирования дисульфидными облигаций, важный шаг в сложенном многих выделительные протеины4,5,6, 7.
Здесь мы описываем общий метод для анализа сворачивание белков и транспорта в нетронутым клеток, используя подход радиоактивных пульс Чейз. Хотя мы стремились представить этот метод как как можно более подробно протокол имеет почти безграничным потенциалом для адаптации и позволит оптимизации для изучения специфических белков каждого читателя.
Предоставляются две альтернативные пульс Чейз протоколов, один для адэрентных клеток (шаг 1.1 протокола, представленные здесь) и один для подвески клеток (шаг 1.2 протокола, представленные здесь). Условия здесь являются достаточными для визуализации белок с средне высокий выражение уровня. Если читатель работает с слабо выраженной белки или различных рентгенологическое условий, таких как несколько immunoprecipitations, необходимо увеличить размер блюдо или мобильный телефон надлежащим образом.
Для подвески пульс Чейз Чейз проб, взятых в каждый момент времени все взяты из одной трубки клеток. Мыть шаги после импульса опущены; Вместо этого дальнейшее включение 35S предотвращается путем разбавления с высоким избыток немеченого метионина и цистеина.
Представлены протоколы используют радиоактивные 35S-меченых цистеина и метионина следовать клеточных процессов, сворачивание белков. Используя соответствующие защитные меры для сведения к минимуму любого воздействия оператора и окружающей среды, радиоактивного излучения и выполняться в назначенной лаборатории следует выполнять все операции с радиоактивными реагентов. Как пульс Чейз маркировки техника относительно неэффективными порой короткого импульса (< 15 мин), меньше, чем 1% от начальной суммы радиоактивности включена в вновь синтезируемых белков. После обогащения целевого белка через иммунопреципитация образец для SDS-PAGE содержит меньше чем 0,05% от суммы начального радиоактивности.
Хотя 35S метионина и цистеина, маркировки смеси стабилизируется, некоторые разложения, уступая летучих радиоактивных соединений, будет происходить. Чтобы защитить исследователь и аппарата, следует принять некоторые меры предосторожности. Исследователь всегда должен подчиняться правилам безопасности местных излучения и может носить уголь кормящих маски, кроме лаборатории пальто и перчатки (двойной). Складе флаконов с 35S метионина и цистеина всегда должен быть открыт в вытяжной шкаф или под местной стремление точки. Пятна загрязнения известных лабораторных центрифуг, пипетки, водяные бани, инкубаторы и шейкеры. С помощью пипетки советы с угольный фильтр, положительный печать microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалы), аквариум угольные губки в воды ванны, угольный фильтр документах склеены в пульс Чейз блюда, уменьшается загрязнение этих областей Древесный уголь гвардия в системы аспирации и размещение блюда, содержащие уголь зерна в инкубаторы и хранения контейнеров.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co - Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.

Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1 от Чейз адэрентных пульс показан на рисунке 2. Nonreducing гель (клетки NR на рисунке) показывает окислительного складывания gp120. Сразу же после импульса маркировки gp120 5 мин (0 мин Чейз) появляется как диффузные группа выше в гель, и п?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Радиоактивная пульсовая погоня с использованием 35 S-маркированного метионина и цистеина по-прежнему является единственным биохимическим методом исследования биосинтеза белка со временем в живых клетках. Биосинтез белка охватывает как перевод, складывание и сборку, так и торговлю и деградацию. Сочетание радиоактивного пульса погони с анализом совместного и после перевода белковых модификаций, таких как образование дисульфидных связей и ацетилирование обеспечивает чувствительный и количественный анализ для исследования веры белка со временем.Для этой процедуры требуется хорошая фокусировка и экспериментальная обработка. Хорошая подготовка имеет решающее значение, как буферы, ваше радиоактивное рабочее пространство, и четкий график. Это видео обеспечивает четкое представление через плечо радиоактивного протокола погони импульса.Демонстрация процедуры будет Хуэй Инг Yeoh, pHd кандидата из нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, семена трансфект и культуры клеток, как указано в текстовом протоколе. Перед пульсом погони, проверить ваши клетки через микроскоп.Затем мыть посуду с двумя миллилитров мыть буфера. И два миллилитров голодания среднего к клеткам и поместите посуду во влажный инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 15 минут. Убедитесь, что ваш пульс погони создан в порядке.Перенесите посуду на стеллажи на водяной бане, предварительно разогретой до 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что блюда находятся в контакте с водой, но не плавать. Затем запустите таймер.На 40 секунд, аспирировать голодание среды. Используя микро трубу, нарисуйте 600 микролитров импульсного раствора. Ровно в одну минуту аккуратно добавьте импульсный раствор в центр блюда.Повторите этот процесс удаления голодающей среды и добавления импульсного раствора для остальных блюд с интервалом в одну минуту. Ровно в 11 минут и для всех следующих блюд, в соответствии с схемой пульс погони, за исключением нулевой минуты погони образца, добавить два миллилитров погони среды непосредственно к блюду. Аспирировать погони среды и заменить его на два миллилитров свежей погони среды.Повторите этот процесс для всех оставшихся блюд с интервалом в одну минуту. Когда таймер читает ровно 16 минут, добавить два militers погони среды непосредственно к нулю минуту погони блюдо, в верхней части импульса среды, чтобы остановить маркировки. Немедленно аспирировать среду.Перенесите блюдо на охлажденной алюминиевой пластины и добавить два militers ледяной остановки буфера. Перенесите все остальные блюда в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Перенесите каждое блюдо погони обратно из инкубатора на водяную баню за две минуты до конца каждого времени погони.В точное время погони за каждым блюдом, аспирировать погони среды и передачи блюдо на охлажденной алюминиевой пластины. Добавьте два миллилитров буфера остановки ледяного холода. Оставьте все блюда на льду и остановите буфер до тех пор, пока не будет времени, чтобы подысать клетки.Затем аспирировать стоп-раствор и вымыть все блюда. Три одновременно с двумя миллилитров ледяной остановки раствора. Аспирировать стоп-раствор полностью и добавить 600 микролитров буфера лиза к двум блюдам одновременно.Используя клеточный скребок, тщательно соскреблите поверхность блюда, но аккуратно перемешайте лисат. Передача лизата с каждого блюда в свежую 1,5 миллилитровую микро центрифугу трубки. Центрифуга при 15 000-20 000 Г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут гранулировать ядра.Для пульса погони на суспензии клетки сбора пять миллионов клеток за время точки в одной 50 миллилитровой трубки. Выполните процедуру голодания, как описано в тексте. После процедуры голодания в водяной бане в течение 15 минут, запустите таймер.Ровно в одну минуту добавьте 275 микрокурий неразбавленной этикетки непосредственно в трубку, содержащую клетки, и вихрем, чтобы перемешать. Ровно через 11 минут добавьте четыре миллилитров средств погони, чтобы остановить маркировку. И немедленно перенесите один миллилитр в 15 миллилитровую трубку на льду, которая содержит девять миллилитров раствора ледяной остановки, чтобы остановить маркировку.Повторите этот процесс передачи одного миллилитров погони в трубку на льду, содержащую девять миллилитров стоп-раствора для каждой последующей точки времени погони. После иммунопреципиентации, аспирировать последнюю стирку полностью. Повторно приостанавливать бисер в 20 микролитров буфера TE и вихря.Добавьте 20 микролитров двух буферов образца X без уменьшаемого агента. Vortex образцы, а затем нагреть их при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Вихрь образцы снова.Центрифуга при температуре 12 000 Г при комнатной температуре в течение одной минуты. Перенесите 19 микролитров несоеленного супернатанта в свежую микроцентрифугную трубку, которая содержит один микролитр 500 миллимолярный ДДТ. При необходимости центрифуга образца быстро, так что все жидкости находятся на дне.И тепла при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Пусть уменьшенный образец остынет, а затем вихрь. Центрифуга как уменьшенных, так и неразмещенных образцов в 12 000 раз G при комнатной температуре в течение одной минуты, а затем добавить 1,1 микролитров одного молара NEM для всех образцов.В этом исследовании, радиоактивный импульс погони подход используется для анализа белка складывания и транспортировки в нетронутых клетках. Складной и секреции ВИЧ один GP120 от адепта пульс погони показано здесь. Не уменьшающийся гель показывает окислительное складывание GP120.Сразу же после маркировки пульса, он появляется как диффузная полоса выше в геле. По мере того как погоня прогрессирует, полоса мигрирует вниз с геля через даже более диффузные складывая промежуточные до тех пор пока она не аккумулирует в плотной полосе которая представляет родно сложенный на GP120. Это происходит по мере того, как образование дисульфидных связей повышает компактность белка, заставляя его мигрировать быстрее, чем полностью уменьшенный белок.На уменьшая гель, связи disulfide и все молекулы были уменьшены и не влияют на mobiilty. Таким образом, различия в подвижности являются лишь результатом изменений молекулярной массы. Сдвиг с течением времени от уменьшенного сигнала пептида нечистой форме к уменьшенной форме пептида сигнала расщепляется представляет собой пост-трансляционный сигнал пептидного расщепления GP120.Мобильность увеличивается из-за потери пептида сигнала, который увеличивается во время погони, как больше белков достичь родной раз и теряют свой сигнал пептида. Как на не уменьшаемый, так и на уменьшаемый гель, сигнал начинает уменьшаться примерно с одного часа из-за секреции GP120. Это можно контролировать путем анализа средств массовой информации.Этот метод применим к любой клеточной линии, включая органоидные клеточные модели. Но успех во многом зависит от уровня экспрессии белка интереса. Перед началом этой процедуры отметите посуду и держите этот порядок на протяжении всего эксперимента.Убедитесь, что все подготовлено перед добавлением голодания среды. Это начало эксперимента. И ваше лабораторное время ваш друг, но может быть вашим самым большим врагом, когда вы не готовы.Погоня Билла может быть объединена с ограниченным протеолиза, чтобы исследовать полное имущество белков со временем. Кроме того, различные выборные методы морозильных камер позволит анализ полоскания или строгости или заряда различия. Для защиты исследователя и аппарата необходимо соблюдать все местные правила радиационной безопасности.И защитные меры должны быть приняты в соответствии с протоколом. Обратите внимание, что ваш акриламид, используемый для вашей страницы STH является нейротоксическим.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Анализ Endocytic поглощения и ретроградным транспорта Trans Гольджи сеть с помощью функционализированных Nanobodies в культивируемых клеток

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...