Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Författarna tackar alla medlemmar för Braakman lab, förbi och närvarande för deras fruktbara diskussioner och hjälp i att utveckla de metoder som presenteras i denna artikel. Detta projekt har beviljats medel från både Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 och Nederländerna organisation av vetenskaplig forskning (NWO) under den ECHO-programmet N ° 711.012.008.

Alla radioaktiva reagenser och förfaranden har hanterats i enlighet med lokala Utrecht universitet strålning regler och föreskrifter.
1. pulse Chase
<ol><li>
Pulse Chase för vidhäftande celler Obs: De volymer som ges här är baserade på 60 mm cell kultur rätter. För 35 mm eller 100 mm rätter, multiplicera volymerna med 1/2 eller 2, respektive. Detta protokoll används en puls tid 10 min och chase gånger 0, 15, 30, 60, 120 och 240 min. Dessa kan varieras beroend...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Puls-chase metoder har varit avgörande för utvecklingen av forskarnas förståelse av protein vikning i intakta celler. Medan vi har försökt att ge en metod som är lika allmän som möjligt, har detta tillvägagångssätt potentialen för nästan obegränsade variationer att studera olika processer som inträffar under vikningen, transport, och livet av proteiner inuti cellen.
När du utför en puls chase med vidhäftande celler i rätter, är det viktigt att behandla varje maträtt som d...

Vikningen av även relativt enkla proteiner innebär många olika fällbara enzymer, molekylär chaperones och kovalenta modifieringar1. En komplett beredning av dessa processer i vitro är praktiskt taget omöjligt, med tanke på det stora antalet olika komponenter inblandade. Det är därför önskvärt, att studera protein vikning i vivo, i levande celler. Radioaktiva puls-chase tekniker bevisa ett kraftfullt verktyg för att studera den syntes, vikning, transport och nedbrytning av proteiner i deras naturliga miljö.
Den metabola märkning av proteiner under en kort puls med 35S-märkt metionin/cystein, följt av en jakt i avsaknad av en radioaktiv märkning, tillåter spårning av antalet nyligen syntetiserade proteiner i den breda cellulära miljön. Sedan målproteiner kan vara isolerade via immunoprecipitation och analyseras via SDS-PAGE eller andra tekniker. För många proteiner präglas deras resa genom cellen av ändringar som är synliga på SDS-PAGE gel. Exempelvis åtföljs transport av glykosylerat proteiner från endoplasmatiska retiklet (ER) till Golgi komplexet ofta av ändringar av N-länkade glycans eller tillägg av O-länkade glycans2,3. Dessa ändringar orsaka stora ökningar i det uppenbara molekylära samlas, som kan ses av rörlighet förändringar i SDS-PAGE. Mognaden kan också markeras genom proteolytisk klyvning, såsom signal-peptid klyvning eller avlägsnande av pro-peptider, vilket resulterar i förändringar i den uppenbara molekylära massa som enkelt kan följas på SDS-PAGE gel4. Radioaktiviteten har betydande fördelar jämfört med jämförbara tekniker såsom Kungliga Automobilklubben jakter, där romanen proteinsyntesen förhindras, som längre behandlingar är giftiga för celler och utesluter inte majoriteten av äldre, steady state proteiner från den analys, som vissa proteiner har halveringstider dagar. Jämförelse av proteiner under både nonreducing och minska villkor tillåter analys av disulfide bond bildandet, ett viktigt steg i vikningen av många sekretoriska proteiner4,5,6, 7.
Här beskrivs en allmän metod för analys av proteinveckning och transport i intakta celler, med hjälp av radioaktiva puls-chase tillvägagångssättet. Medan vi har syftar till att ge metoden som detaljerat som möjligt, protokollet har en nästan obegränsad potential för anpassningsförmåga och tillåter optimering att studera varje läsarens specifika proteiner.
Två alternativa puls-chase protokoll, en för vidhäftande celler (steg 1.1 av protokollet presenteras här) och en för suspension celler (steg 1.2 i protokollet presenteras här) tillhandahålls. Villkor som anges här är tillräckliga för att visualisera ett protein som uttrycks med medelhög - till hög-uttryck nivåer. Om läsaren arbetar med dåligt uttryckta proteiner eller olika posttreatment villkor, såsom flera immunoprecipitations, är det nödvändigt att öka storleken på skålen eller mobiltelefonnummer på lämpligt sätt.
För suspension puls chase tas chase proverna vid varje tidpunkt från en enda slang av celler. Tvätta stegen efter pulsen är utelämnade; i stället ytterligare förhindras inkorporering av 35S genom utspädning med en hög överskott av omärkta metionin och cystein.
De presenteras protokoll använder radioaktiva 35S-märkt cystein och metionin följa cellulära proteinveckning processer. All verksamhet med radioaktiv reagenserna bör utföras med lämpliga skyddsåtgärder för att minimera all exponering av operatören och miljön för radioaktiv strålning och utföras i ett laboratorium som utsetts. Som puls-chase märkning teknik är relativt ineffektiv kort puls tider (< 15 min), mindre än 1% av grundbelopp för radioaktivitet är införlivad i de nyligen syntetiserade proteinerna. Efter anrikningen av den mål protein via immunoprecipitation innehåller provet för SDS-PAGE mindre än 0,05% av grundbelopp för radioaktivitet.
Även om de 35S metionin och cystein märkning mix stabiliseras, kommer att vissa nedbrytning, framställning av flyktiga radioaktiva föreningar, uppstå. För att skydda forskaren och apparaten, bör vissa försiktighetsåtgärder vidtas. Forskaren bör alltid följa säkerhetsbestämmelser som lokal strålning och kan bära en kolteckning som omvårdnad mask, förutom en labbrock och (dubbel) handskar. Beståndet injektionsflaskor med 35S metionin och cystein bör alltid öppnas i dragskåp eller i en lokal aspiration punkt. Kända laboratorium kontaminering fläckar är centrifuger, pipetter, vattenbad, inkubatorer och shakers. Kontaminering av dessa områden minskas med pipettspetsar med ett kolfilter, positiv-seal mikrocentrifugrör (se Tabell för material), akvarium träkol svampar i vatten bad, träkol filtrerpapper limmade i puls-chase maträtter, träkol vakt i systemets aspiration och placeringen av rätter som innehåller träkol spannmål i inkubatorer och förvaringskärl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Radioaktiva puls-chase märkning är ett kraftfullt verktyg för att studera den konfirmerande mognaden, transport till deras funktionella cellulära plats och nedbrytningen av målet proteiner i levande celler. Genom att använda kort (puls) radiolabeling gånger (< 30 min) och hårt kontrollerad chase gånger, det är möjligt att märka endast en bråkdel av den totala protein poolen och följa dess vikning. Kombination med nonreducing eller minska SDS-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och immunoprecipitation med (konformation-specifik) antikroppar, kan fällbara processer undersökas i detalj. Detta system har använts för att analysera den vikningen av proteiner med en stor variation i egenskaper såsom lösliga proteiner, enkel- och multi-pass transmembrana proteiner, tungt N - och O-glykosylerad proteiner och proteiner med och utan omfattande disulfid limning. Puls-chase metoder är grunden för kinetiska studier i en rad ytterligare funktioner, inklusive co - och posttranslationalen modifieringar, oligomerisering och polymerisation, i huvudsak tillåter analys av ett protein från födseln till döden. Puls-chase studier på proteinveckning kompletterar med andra biokemiska och biofysikaliska metoder för att studera proteiner i vitro genom att ge ökad temporal upplösning och fysiologisk information. Metoderna som beskrivs i detta dokument anpassas lätt för att studera den vikningen av nästan något protein som kan uttryckas i däggdjur eller insekt-cell system.

Den fällbara och utsöndringen av HIV-1 gp120 från en vidhäftande puls chase visas i figur 2. Nonreducing gelen (celler NR i figuren) visar den oxidativa vikningen av gp120. Omedelbart efter pulsen märkning av 5 min (0 min chase) gp120 visas som ett diffust band som är högre i gel och som chase fortskrider, bandet migrerar ner gelen genom ännu mer diffust fällbara intermediärer (IT) tills det ackumuleras i trånga bandet (NT) som representerar inföd...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Här beskriver vi ett protokoll för en allmän puls-chase-metod som tillåter den kinetiska analysen av vikning, transport och nedbrytning av proteiner som skall följas i levande celler.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Den radioaktiva pulsjakten med hjälp av 35 S-märkt metionin och cystein är fortfarande de enda biokemiska metoderna för att undersöka proteinbiosyntes med tid i levande celler. Proteinbiosyntesen omfattar både översättning, vikning och montering samt trafficking och nedbrytning. Att kombinera den radioaktiva pulsjakten med analys av proteinmodifieringar av co- och post-translation, såsom disulfidbindningsbildning och acetylering ger en känslig och kvantitativ analys för att undersöka proteinets tro med tiden.För detta förfarande krävs god fokusering och experimentell hantering. Bra förberedelser är avgörande, som buffertar, din radioaktiva arbetsyta, och ett tydligt schema. Denna video ger en tydlig över axeln syn på den radioaktiva puls chase protokollet.Demonstrera förfarandet kommer att Hui Ying Yeoh, en pHd kandidat från vårt laboratorium. Till att börja detta förfarande, utsäde transfekt och celler kultur som beskrivs i textprotokollet. Innan pulsjakten, inspektera dina celler genom mikroskopet.Därefter diska med två milliliter tvättbuffert. Och två milliliter av svält medium till cellerna och placera disken i en befuktad inkubator på 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 15 minuter. Se till att din pulsjakt som ställts in är i ordning.Överför disken till racken i vattenbadet, förvarna till 37 grader Celsius. Se till att disken är i kontakt med vatten, men flyta inte. Starta sedan en timer.Vid 40 sekunder, aspirera svältmediet. Med hjälp av en mikro pipet, utarbeta 600 mikroliter av pulslösning. Vid exakt en minut, tillsätt försiktigt pulslösningen till mitten av skålen.Upprepa denna process för att ta bort svältmediet och lägga till pulslösningen för de återstående rätterna med en minuts mellanrum. Vid exakt 11 minuter och för alla följande rätter, enligt pulsjakt systemet, med undantag för noll minuters jakt prov, tillsätt två milliliter jaga medium direkt till skålen. Aspirera jaga medium och ersätta den med två milliliter av färsk chase medium.Upprepa denna process för alla återstående rätter med en minuts intervall. När timern läser exakt 16 minuter, tillsätt två militers av chase medium direkt till noll minuters jakt skålen, ovanpå pulsen medium, för att stoppa märkning. Omedelbart aspirera mediet.Överför skålen till en kyld aluminiumplatta och tillsätt två militers av iskallt stopp buffert. Överför alla andra rätter till en inkubator vid 37 grader Celsius. Överför varje chase maträtt tillbaka från inkubatorn till vattenbadet två minuter före slutet av varje chase tid.På den exakta chase tid för varje maträtt, aspirera jaga medium och överföra skålen till en kyld aluminiumplatta. Tillsätt två milliliter iskall stoppbuffert. Lämna alla rätter på is och stoppa buffert tills det finns tid att lysa cellerna.Därefter aspirera stopplösningen och diska alla diskar. Tre samtidigt med två milliliter iskall stopplösning. Aspirera stopplösningen helt och tillsätt 600 mikroliter av lysbuffert till två rätter åt gången.Med hjälp av en cell skrapa, skrapa ytan av skålen ordentligt, men försiktigt för att blanda lysate. Överför lysate från varje maträtt till en färsk 1,5 milliliter mikro centrifugrör. Centrifugera vid 15, 000 till 20, 000 G vid fyra grader Celsius i 10 minuter för att pelleta kärnorna.För pulsjakten på upphängningsceller insamling fem miljoner celler per gång i en 50 milliliter tub. Utför svältproceduren enligt beskrivningen i texten. Efter svältproceduren i vattenbadet i 15 minuter, starta timern.Vid exakt en minut, tillsätt 275 mikrokurier av outspädd etikett direkt till röret som innehåller celler och snurra för att blanda. Vid exakt 11 minuter, tillsätt fyra milliliter jaga media för att stoppa märkningen. Och omedelbart överföra en milliliter till en 15 milliliter rör på is som innehåller nio milliliter iskallt stopp lösning för att stoppa märkning.Upprepa denna process för att överföra en milliliter av jaga till ett rör på is som innehåller nio milliliter stopplösning för varje på varandra följande chase tidspunkt. Efter immunoprecipitationen aspirera den sista tvätten helt. Åter avbryta pärlorna i 20 mikroliter av TE buffert och virvel.Lägg till 20 mikroliter av två X-provbuffert utan reduktionsmedlet. Vortexa proverna och värm dem sedan i 95 grader Celsius i fem minuter. Vortexa proverna igen.Centrifugera vid 12, 000 gånger G vid rumstemperatur i en minut. Överför 19 mikroliter av den icke-reducerade supernatanten till ett färskt mikrocentrifugrör som innehåller en mikroliter på 500 millimolar DDT. Om det behövs, centrifugera provet snabbt så att alla vätskor är i botten.Och värme vid 95 grader Celsius i fem minuter. Låt det reducerade provet svalna och sedan virvel. Centrifugera både de reducerade och icke-reducerade proverna vid 12 000 gånger G vid rumstemperatur i en minut, och tillsätt sedan 1,1 mikroliter av en molar NEM till alla proverna.I denna studie används en metod för radioaktiv pulsjakt för att analysera proteinveckning och transport i intakta celler. Den vikning och utsöndring av HIV en GP120 från en anhängare puls jakt visas här. Den icke-reducerande gelen visar den oxidativa vikningen av GP120.Omedelbart efter pulsmärkningen visas den som ett diffust band högre i gelen. Under jaktens gång migrerar bandet ner gelen genom ännu mer diffusa vikför intermediärer tills det ackumuleras i det snäva bandet som representerar inbyggt viks på GP120. Detta sker som bildandet av disulfidbindningar ökar kompaktiteten hos proteinet, vilket gör att det migrerar snabbare än det helt reducerade proteinet.På den reducerande gelen har disulfidbindningarna och alla molekyler reducerats och påverkar inte mobiilty. Som sådan är skillnader i rörlighet endast resultatet av förändringar i molekylmassan. Skiftet över tiden från den reducerade signalpeptidterördärvad form till den reducerade signalpeptid cleaved formen representerar post-translational signal peptid klyvning av GP120.Rörligheten ökar på grund av förlusten av signalpeptid som ökar under jakten som fler proteiner uppnå den infödda gånger och förlorar sin signal peptid. På både den icke-reducerande och reducerande gelen börjar signalen minska från ungefär en timme och framåt på grund av utsöndring av GP120. Detta kan övervakas genom att analysera mediet.Denna metod är tillämplig på alla cellinje, inklusive organoida cellmodeller. Men framgången beror stort på uttrycksnivån av proteinet av intresse. Innan du börjar denna procedur, markera dina rätter och hålla denna ordning under hela experimentet.Se till att allt är förberett innan du lägger till svältmedium. Det här är början på experimentet. Och din labbtid är din vän, men kan vara din största fiende när du inte är förberedd.Bills jakt kan kombineras med begränsad proteolys för att undersöka den fulla dödsboet av proteiner med tiden. Också olika valda frysar metoder kommer att möjliggöra analys av sköljning eller rigormorization eller skillnader laddning. För att skydda forskaren och apparaten måste alla lokala strålsäkerhetsregler följas.Och skyddsåtgärder bör vidtas enligt protokollet. Observera att din akrylamid, som används för din STH-sida är neurotoxisk.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...