Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Yazarlar geçmiş Braakman Lab, tüm üye teşekkür ve, onların verimli tartışmalar için mevcut ve bu makalede sunulan yöntemleri geliştirmede yardımcı. Bu proje Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) N ° 235649 altında ve Hollanda organizasyon, bilimsel araştırma (NWO) ECHO programı N ° 711.012.008 altında fon aldı.

Tüm radyoaktif reaktifler ve yordamlar yerel Utrecht Üniversitesi radyasyon kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde ele.
1. darbe Chase
<ol><li>
Nabız Chase yapışık hücreleri için Not: burada verilen birimleri 60 mm hücre kültür yemekleri üzerinde temel alır. 35 mm veya 100 mm yemekleri için birimleri tarafından 1/2 ya da 2, sırasıyla çarpın. Bu iletişim kuralı 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 min 10 dk ve chase kez darbe zamanı kullanır. Bunlar belirli...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.
Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak m?...

Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon1içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.
Metabolik 35S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir etiket yokluğunda bir kovalamaca ardından, daha geniş hücresel ortamında yeni sentezlenmiş protein bir nüfusun belirli izlenmesini sağlar. Sonra hedef proteinler ve üzerinden SDS-sayfası veya diğer tekniklerle analiz izole yolu ile immunoprecipitation olabilir. Çoğu protein için onların yolculuk boyunca hücre SDS-sayfa jel üzerinde görülebilen değişiklikler tarafından işaretlenir. Örneğin, taşıma glikozile proteinlerin endoplazmik retikulum (ER) üzerinden Golgi kompleksi kez glukanlardir N bağlı değişiklikler veya ek O bağlantılı glukanlardir2,3tarafından eşlik ediyor. Bu değişiklikler büyük artışlar SDS-sayfa hareketlilik değişiklikler görülebilir belirgin molekül ağırlığı neden. Olgunlaşma, sinyal peptid bölünme veya pro-peptidler, değişiklikleri kolayca SDS-sayfa jel4üzerinde takip edilmesi belirgin molekül ağırlığı sonuçlanan kaldırılması gibi proteolitik kesim tarafından da işaretlenebilir. Radyoaktivite vardır sikloheksimit çarpma gibi karşılaştırılabilir teknikleri üzerinde önemli avantajlar olarak daha uzun tedaviler hücrelere zehirlidir ve büyük, kararlı durum proteinler çoğunluğu dışlamayın nerede roman protein sentezi, engellenir Analizi, bazı proteinler yarım-gün canlıdır. Proteinler nonreducing her ikisi de altında karşılaştırılması ve koşulları azaltmak sağlar analiz disülfit bağı oluşumu, birçok salgı proteinler4,5,6, katlanır önemli bir adım 7.
Burada biz bir radyoaktif nabız-chase yaklaşım kullanarak protein katlanması ve sağlam olan hücrelerde taşıma analizi için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi olarak sağlamak amaçlanmıştır iken mümkün olduğunca ayrıntılı protokol adaptasyon için neredeyse sınırsız bir potansiyele sahiptir ve optimizasyon her okuyucunun spesifik proteinlerin çalışmaya izin verir.
İki alternatif darbe-chase protokol, bir yapışık hücreleri (adım 1.1 burada sunulan Protokolü) ve süspansiyon hücreleri (adım 1.2 burada sunulan Protokolü) için sağlanır. Koşulun sağlanması halinde burada orta-yüksek ifade düzeyleri ile ifade edilen bir protein görselleştirmek yeterli vardır. Eğer okuyucu kötü ifade proteinler veya birden çok immunoprecipitations gibi çeşitli posttreatment koşulları ile çalışma çanak boyutunu artırın veya uygun şekilde sayı hücre gereklidir.
Süspansiyon darbe chase için her zaman noktada alınan chase örnekler tüm hücreleri tek bir tüp alınır. Darbe ihmal sonra yıkama adımları; Bunun yerine, daha fazla 35S birleşmesiyle etiketlenmemiş metionin ve sistein yüksek bir fazlalığı ile seyreltme tarafından engellenir.
Hücresel protein katlanması işlemlerini takip için radyoaktif 35S etiketli sistein ve metionin sunulan iletişim kurallarını kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri herhangi bir operatör ve radyoaktif Radyasyon ortamına maruz en aza indirmek ve belirlenmiş bir laboratuarda gerçekleştirilen uygun koruyucu önlemleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Nabız-chase teknik etiketleme kısa darbe zamanlarda nispeten verimsiz (< 15dk), radyoaktivite başlangıç miktarı % 1'i yeni sentezlenmiş protein dahil daha az. Üzerinden hedef protein immunoprecipitation zenginleştirme sonra radyoaktivite başlangıç miktarı daha az % 0.05 SDS-sayfa için örnek içerir.
35S metionin ve mix etiketleme sistein stabilize rağmen bazı ayrıştırma radyoaktif uçucu bileşikler, verimli, ortaya çıkar. Araştırmacı ve aparatı korumak için bazı önlemler alınmalıdır. Araştırmacı her zaman yerel radyasyon güvenlik kurallarına itaat etmelisin ve maske, önlük ve eldiven (Çift Kişilik) yanı sıra hemşirelik kömür olabilir. Hisse senedi şişeleri 35S metionin ve sistein ile her zaman bir duman başlıklı veya yerel aspirasyon noktası altında açılmalıdır. Bilinen laboratuvar kirlenme Santrifüjler Pipetler, su hamamlar, kuluçka ve shakers noktalardır. Bu alanların kirlenme pipet ipuçlarını kullanarak bir kömür filtre, pozitif-mühür microcentrifuge tüpler ( Tablo malzemelerigörmek), akvaryum kömür sünger nabız-chase yemekleri yapıştırılmış su banyoları, kömür filtre gazetelerde azalır, aspirasyon sistemi ve bulaşık kuluçka ve saklama kapları kömür tahıl içeren yerleşimini kömür muhafız.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.

Katlama ve HIV-1 gp120 bir yapisan darbe chase üzerinden salgılanmasını Şekil 2' de gösterildiği. Nonreducing jel (şekilde hücreleri NR) oksidatif gp120 katlama gösterir. Nabız hemen sonra 5 dk (0 dak chase) gp120 etiketleme diffüz grup jel içinde daha yüksek olarak görünür ve chase ilerledikçe grup jel ile aşağı daha da sıkı grup (NT) birikir kadar ara ürün (BT) katlanır yayılmış geçirir Yerel olarak katlanmış gp120 temsil ede...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

35 S etiketli metiyonin ve sistein kullanılarak yapılan radyoaktif darbe takibi, canlı hücrelerde zamanla protein biyosentezini araştırmak için hala tek biyokimyasal yöntemdir. Protein biyosentezi hem çeviri, katlama ve montaj, hem de insan ticareti ve bozulmayı kapsar. Radyoaktif darbe kovalamacasının disülfür bağı oluşumu ve asetilasyon gibi ortak ve post-çeviri sonrası protein modifikasyonlarının analizi ile birleştirilmesi, proteinin inancını zamanla araştırmak için hassas ve nicel bir tahlil sağlar.Bu işlem için iyi bir odaklanma ve deneysel kullanım gereklidir. İyi hazırlık tamponlar, radyoaktif çalışma alanı ve net bir program gibi çok önemlidir. Bu video radyoaktif darbe kovalamaca protokolüomuz görünümü üzerinde net sağlar.Prosedürü gösteren Hui Ying Yeoh, bizim laboratuvar bir pHd adayı olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, tohum transfect ve kültür hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi. Nabız takibinden önce, hücrelerini mikroskoptan inceleyin.Daha sonra, yıkama tampon iki mililitre ile bulaşıkları yıkayın. Ve hücrelere iki mililitre açlık orta ve 15 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bulaşıkları yerleştirin. Nabız takibinizin düzenli olduğundan emin olun.37 santigrat dereceönceden ısıtılmış su banyosunda raflara bulaşıkları aktarın. Bulaşıkların suyla temas halinde olduğundan emin olun, ancak yüzme. O zaman bir zamanlayıcı başlatın.40 saniye, açlık ortamını aspire edin. Bir mikro pipet kullanarak, 600 mikrolitre darbe çözeltisi çizin. Tam bir dakika, yavaşça çanak merkezine darbe çözeltisi ekleyin.Açlık ortamını ortadan kaldırmak ve kalan yemekler için darbe çözeltisini bir dakika aralıklarla ekleyerek bu işlemi tekrarlayın. Tam olarak 11 dakika ve tüm aşağıdaki yemekler için, nabız kovalamaca düzenine göre, sıfır dakika kovalamaca örneği dışında, doğrudan çanak kovalama orta iki mililitre ekleyin. Kovalama aracını aspire edin ve iki mililitre taze kovalamaca ortamı ile değiştirin.Kalan tüm yemekler için bu işlemi bir dakika aralıklarla tekrarlayın. Zamanlayıcı tam olarak 16 dakika okuduğunda, etiketlemeyi durdurmak için doğrudan sıfır dakika kovalamaca kabına iki militer kovalamaca aracı ekleyin. Hemen orta aspire.Bir soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın ve buz soğuk stop tampon iki milis ekleyin. Diğer tüm tabakları 37 derecedebir kuvöze aktarın. Her kovalamaca yemeğini kuvözden su banyosuna aktarın.Her yemek için tam kovalamaca zamanında, kovalama orta aspire ve soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın. Buz soğuk dur tampon iki mililitre ekleyin. Tüm tabakları buzüzerinde bırakın ve hücreleri lyse zaman kadar tampon durdurmak.Sonra stop çözeltisi aspire ve tüm bulaşıkları yıkayın. Üç aynı anda iki mililitre buz gibi soğuk dur çözeltisi. Durdurma çözeltisini tamamen aspire edin ve bir seferde iki tabak için 600 mikrolitre lysis tampon ekleyin.Bir hücre kazıyıcı kullanarak, iyice çanak yüzeyini kazıyın, ama yavaşça lysate karıştırmak için. Her tabaktan taze 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. 15, 000-20, 000 G'de 4 derece santigrat derecede çekirdekleri 10 dakika boyunca santrifüj edin.Süspansiyon hücreleri üzerinde nabız kovalamaca için bir 50 mililitrelik tüp zaman noktası başına beş milyon hücre toplama. Metinde açıklandığı gibi açlık yordamını gerçekleştirin. 15 dakika boyunca su banyosunda açlık işleminden sonra, zamanlayıcı başlatın.Tam bir dakika, doğrudan hücreleri içeren tüp ve karıştırmak için girdap seyreltilmemiş etiket 275 mikrocuries ekleyin. Tam olarak 11 dakika, etiketlemedurdurmak için dört mililitre kovalamaca ortamı ekleyin. Ve hemen etiketlemedurdurmak için buz dokuz mililitre buz soğuk stop çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüp için bir mililitre aktarın.Birbirini izleyen her kovalamaca zaman noktası için dokuz mililitre stop çözeltisi içeren bir tüpe bir mililitre kovalamaca aktarma işlemini tekrarlayın. İmmünyağıştan sonra son yıkamayı tamamen aspire edin. TE tampon ve girdap 20 mikrolitre boncuk yeniden askıya.Azaltma maddesi olmadan iki X örnek arabellek 20 mikrolitre ekleyin. Örnekleri girdap ve sonra 95 derecede beş dakika ısıtın. Örnekleri tekrar girdap.Bir dakika oda sıcaklığında 12, 000 kez G santrifüj. 19 mikrolitre azaltılmış olmayan supernatant'ı 500 milimolar DDT'lik bir mikrolitre içeren taze bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse, numuneyi hızlı bir şekilde santrifüj edin, böylece tüm sıvılar en altta yer alabilsin.Ve 95 derecede 5 dakika ısı. Azaltılmış örnek soğumasını bekleyin ve sonra girdap. Oda sıcaklığında 12,000 kat G'de hem azaltılmış hem de indirgenmeyen numuneleri bir dakika lığına santrifüj edin ve tüm numunelere bir azı nemu nem 1.1 mikrolitre ekleyin.Bu çalışmada, bozulmamış hücrelerde protein katlama ve taşıma analiz etmek için radyoaktif darbe kovalamaca yaklaşımı kullanılır. Bir yapışkan nabız kovalamaca HIV bir GP120 katlama ve salgılanması burada gösterilmiştir. Non-azaltıcı jel GP120 oksidatif katlama gösterir.Darbe etiketleme hemen sonra, jel daha yüksek bir diffüz bant olarak görünür. Kovalamaca ilerledikçe, grup gp120'de yerel olarak katlanmış temsil eden sıkı bantta birikene kadar jelden daha da yaygın katlanır ara maddelerle aşağı yaslanır. Bu disülfit bağlarıoluşumu proteinin kompaktlığını artırır gibi oluşur, tam azaltılmış protein daha hızlı göç neden.Azaltıcı jelüzerinde, disülfit bağları ve tüm moleküller azaltılmış ve mobiilty etkilemez. Bu nedenle, hareketlilik farklılıkları sadece moleküler kütledeki değişikliklerin sonucu. Azaltılmış sinyal peptid amcaaved formu azaltılmış sinyal peptid yarık formu zaman içinde kayma GP120 post-translational sinyal peptit dekolte temsil eder.Daha fazla protein yerli kıvrım ulaşmak ve sinyal peptid kaybetmek gibi kovalamaca sırasında artar sinyal peptid kaybı nedeniyle hareketlilik artar. Hem azaltmayan hem de azaltıcı jelde, GP120 salgısına bağlı olarak sinyal yaklaşık bir saatten itibaren azalmaya başlar. Bu, ortam analiz edilerek izlenebilir.Bu yöntem organoid hücre modelleri de dahil olmak üzere herhangi bir hücre hattı için geçerlidir. Ama başarı büyük ölçüde ilgi protein ifade düzeyine bağlıdır. Bu yordamı başlamadan önce, bulaşıkları işaretleyin ve deney boyunca bu siparişi koruyun.Açlık orta eklemeden önce her şeyi hazır olduğundan emin olun. Bu deneyin başlangıcı. Ve laboratuar zamanın arkadaşın, ama hazır olmadığın zaman en büyük düşmanın olabilir.Bill'in kovalamacası, proteinlerin zamanla dolu malvarlığını araştırmak için sınırlı proteolysis ile birleştirilebilir. Ayrıca farklı seçilmiş dondurucular yöntemleri durulama veya rigormorization veya şarj farklılıkları analizi sağlayacaktır. Araştırmacıyı ve cihazı korumak için tüm yerel radyasyon güvenliği kurallarına uyulmalıdır.Ve koruyucu önlemler protokole göre alınmalıdır. STH sayfanız için kullanılan akrilamidin nörotoksik olduğunu unutmayın.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...