Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

De auteurs wil erkennen de hersenen van de New York Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel en Dr. Etty Cortés, voor hun hulp bij het snijden en het behoud van de bevroren menselijk brein weefselmonsters voor deze experimenten. De auteurs wil erkennen de personen die gul gedoneerd hun hersenen voor de voortdurende onderzoek in essentiële Tremor. Dr. Faust en Dr. Martuscello wil erkennen van Columbia University afdeling pathologie en celbiologie voor hun voortdurende steun en kern onderzoekruimte. De auteurs wil erkennen NIH R01 NS088257 Louis/Faust) voor de financiering van onderzoek voor dit project. LCM beelden werden uitgevoerd in de Confocal en gespecialiseerd microscopie gedeelde Resource van de Herbert Irving uitgebreide Cancer Center aan de Columbia University, ondersteund door de NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). De auteurs wil Theresa Swayne en Laura Munteanu erkennen voor hun voortdurende steun met gespecialiseerde microscopie.

Alle menselijke specimens die in dit protocol wordt gebruikt met geïnformeerde toestemming hebben verkregen en zijn goedgekeurd door de interne Review Board (IRB) aan Columbia University en aan Yale University.
Opmerking: Het geheel van dit protocol moet volgen strikte RNA behandeling richtlijnen, waarbij een gehandschoende hand altijd wordt gebruikt, alle oppervlakken worden gereinigd met een RNase waterbasis en alle werken materialen RNA/DNA/Nuclease gratis zijn.
<p cla...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerd is speciaal aangepast om een RVS aanpak in het visualiseren van morfologisch verschillende weefsels voor UV-LCM. Deze methode is ontworpen om te maximaliseren RNA integriteit voor latere directe RNA sequencing, met behoud van een hoger beveiligingsniveau van weefsel visualisatie. Het vermogen om te onderscheiden van de verschillende soorten cellen voor het vastleggen, maken de zuiverste bevolking van cellen mogelijk, is van essentieel belang voor het begrijpen van de verschillende Molecula...

Laser vangt microdissection (LCM) is een waardevolle onderzoeksinstrument waarmee de scheiding van pathologisch relevante cellen voor moleculair gedreven evaluatie achteraf. Het gebruik van moleculaire analyses in deze specimens van heterogene weefsel en de correlatie met pathologische en klinische gegevens is een noodzakelijke stap bij de beoordeling van de translationeel betekenis van biologisch onderzoek1. Bij het analyseren van gen expressie gegevens uit RNA, het gebruik van bevroren weefselsecties wordt sterk aanbevolen omdat het zorgt voor uitstekende kwaliteit van RNA evenals hoeveelheid2gemaximaliseerd. Het is goed opgezet dat hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA essentieel voor zinvolle gegevens van RNA sequencing3 zijn. Wanneer met RNA uit vers bevroren post mortem weefsel voor LCM, is aantasting van het RNA echter een grote uitdaging, aangezien het vindt onmiddellijk plaats bij overlijden en de omvang ervan is bemiddeld door verschillende factoren die samenhangen met het weefsel collectie methode4,5 . Bovendien is de aantasting van het RNA verergerd wanneer kleuring technieken nodig zijn om te herkennen van de histologische details en identificatie van de cel. Gespecialiseerd kleuring technieken, zoals de haematoxyline en eosine, Nissl vlek, immunofluorescentie en immunohistochemistry zijn behulpzaam bij het differentiëren van cellen van omliggende stroma maar hebben aangetoond dat degraderen van RNA en transcript expressie wijzigen profielen6. Ons laboratorium heeft daarom een RVS protocol specifiek ontworpen om te bewaren van RNA in post mortem menselijk cerebellum voor de toepassing van RNA sequencing na LCM Purkinje neuronen Isolatievan gemaakt.
Bij de verwerking van vers bevroren weefsel voor LCM, kan de methode fixatie variabel beïnvloeden zowel RNA en weefsel integriteit. Formaline fixatie is standaard voor morfologische behoud, maar oorzaken die dwarsbinding kunnen fragment van RNA en interfereren met RNA amplificatie7. Ethanol fixatie is een beter alternatief voor RNA isolatie, want het is een coagulative fixatief die niet toe cross-linking1 brengt er. Ter verhoging van de visualisatie van weefsel morfologie, is xyleen de beste keuze, zoals het lipiden uit het weefsel verwijdert. Echter, er zijn bekende beperkingen wanneer met behulp van xyleen in LCM, zoals de weefsels kunnen uitdrogen en broos waardoor weefsel fragmentatie op laser vastleggen7geworden. Xyleen is ook een vluchtige toxine en correct moet worden behandeld in een zuurkast. Xyleen heeft echter aangetoond dat weefsel visualisatie ook behoud van RNA integriteit8verbeteren. Daarom is ons protocol gecentreerd rond het gebruik van 70% ethanol fixatie en ethanol uitdroging, gevolgd door xyleen broedtijd morfologische duidelijkheid.
Het is belangrijk op te merken van de verschillende soorten microdissection laser gebaseerde systemen, zoals ze verschillen in snelheid, precisie en kwaliteit van RNA is gebleken. De infrarood (IR) laser vastleggen van microdissection en het ultraviolette (UV) microbeam microdissection lasersystemen waren beide roman LCM-platforms die ontstaan bijna gelijktijdig8. De IR-LCM-systeem maakt gebruik van een "contact systeem" met behulp van een transparante kunststof film rechtstreeks op de weefselsectie geplaatst, en cellen van belang zich selectief aan de film door gerichte pulsen van een IR-laser. U kunt ook is de UV-LCM-systeem een "contactloze systeem" waarbij een gerichte laserstraal weg de cellen of de regio's van belang in het weefsel snijdt; afhankelijk van de configuratie in twee momenteel beschikbare commerciële platforms die gebruik maken van ofwel een omgekeerde of rechtop Microscoop ontwerp, weefsel is verworven in een collectie apparaat door een laser-geïnduceerde druk golf die het tegen de zwaartekracht katapulten of weefsel is verzameld door de zwaartekracht, respectievelijk. Belangrijke voordelen van het UV-LCM-systeem zijn snellere cel acquisitie, verontreiniging-gratis-collectie met de contactloze aanpak en nauwkeuriger dissectie als gevolg van een veel kleinere laser beam diameter9. Dit protocol werd speciaal ontworpen voor een UV-LCM-systeem en is niet getest in een IR-LCM-systeem. In het ontwerp van het systeem van beide UV-LCM, wanneer accumuleren cellen in het GLB van de verzameling, het gebruik van een dekglaasje aan die verbetert de is cellulaire duidelijkheid tijdens microscopie niet geschikt, zoals de cellen zou kunnen aangaan van het GLB van de collectie. Daarom, om weefsel visualisatie te verbeteren, we testten het gebruik voor dekkende verzameling caps, die zijn ontworpen om te fungeren als een dekglaasje aan voor microscopische visualisatie in UV-LCM systemen, tegen vloeistof gevulde collectie caps. Vloeistof gevulde collectie caps kunnen lastig zijn, als de vloeistof onderworpen aan verdamping is en moet regelmatig worden vervangen terwijl het werken bij en met de Microscoop. Tijd wordt een belangrijke factor voor de stabiliteit van het RNA, zoals het vastgelegde weefsel onmiddellijk7 lost.
Ons laboratorium studies de postmortem neuropathologic veranderingen in het cerebellum van patiënten met essentiële tremor (ET) en verwante neurodegeneratieve aandoeningen van het cerebellum. We hebben bewezen morfologische veranderingen gecentreerd op Purkinje-cellen die het onderscheiden van ET gevallen ten opzichte van de besturingselementen, met inbegrip van een verminderd aantal Purkinje cellen, verhoogd dendritische regressie en een verscheidenheid van axonale veranderingen, leidt ons om te postuleren dat Purkinje cel degeneratie is een biologische functie van de kern in ET pathogenese10,11,12,13. Transcriptionele profilering is gebruikt in vele neurologische ziekten te verkennen van de onderliggende moleculaire basis van degeneratieve cellulaire veranderingen. Echter transcriptionele profielen uit heterogene monsters, zoals weefsel hersengebieden, kunnen effectually maskeren de uitdrukking van lage overvloed transcripten en/of verminderen de detectie van moleculaire veranderingen die alleen in een kleine populatie van waarin dit probleem optreedt optreden cellen, zoals Purkinje cellen in de cerebellaire cortex. Bijvoorbeeld, Purkinje cellen zijn enorm in de minderheid door de overvloedige submodule cellen in de cerebellaire cortex door ongeveer 1:3000; dus effectief richten vereist hun transcriptome specifieke isolatie van deze neuronen. De cerebellaire cortex is afgebakend door verschillende lagen die in de celdichtheid en celgrootte verschillen. Deze cellulaire architectuur is ideaal om te visualiseren in een monster van de vers bevroren weefsel zonder kleurstof bevattende kleuring reagentia. In theorie kan dit protocol ook worden toegepast op andere weefseltypes (HLA) die soortgelijke onderscheidend weefsel hebben organisatie.
Dit protocol werd ontworpen om werk speciaal voor Purkinje cel visualisatie in het cerebellum van menselijke post-mortem. Er zijn talrijke protocollen voor de fixatie, visualisatie en RNA behoud van vele soorten weefsels ten behoeve van zowel IR - en UV-LCM kleuring. Wanneer overweegt een proefopzet voor UV-LCM, moeten individuen hun protocol om het beste passen bij de behoeften en eisen van de begin- en einddatum van de materialen op maat. Hier combineren we vele aspecten van verschillende LCM protocollen om te zorgen voor een verbeterde methode voor het visualiseren van Purkinje cellen in het post mortem menselijk cerebellum zonder de noodzaak van kleurstof bevattende kleuring reagentia voor te bereiden op kwalitatief hoogwaardige RNA transcriptome sequencing.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Laser vangt microdissection (LCM) is een voordelig hulpmiddel waarmee voor de collectie van cytologically en/of fenotypische relevante cellen of gebieden uit heterogene weefsels. Opgenomen product kan worden gebruikt in een verscheidenheid van moleculaire methoden voor eiwitten, DNA of RNA isolatie. Behoud van RNA van menselijke postmortem hersenweefsel is echter vooral een uitdaging. Standaard visualisatietechnieken voor LCM vereisen histologische of immunohistochemische kleuring procedures die verder kunnen degraderen RNA. Dus, we ontwierpen een RVS protocol voor visualisatie in LCM met het beoogde doel van het behoud van de integriteit van het RNA in post mortem menselijk hersenweefsel. Het Purkinje-cel van het cerebellum is een goede kandidaat voor RVS visualisatie, vanwege zijn omvang en karakteristieke locatie. De cerebellaire cortex heeft duidelijke lagen die in celdichtheid verschillen, waardoor ze een goede archetype te identificeren onder hoge vergroting microscopie. Purkinje cellen zijn grote neuronen, gelegen tussen de submodule cellaag, oftewel een dichtbevolkte cellulair netwerk van kleine neuronen, en de moleculaire laag, die is schaars in cel organen. Vanwege deze architectuur is het gebruik van roestvast staal visualisatie haalbaar. Andere orgaan of cel systemen die dit fenotype na te bootsen zou ook geschikt. Het RVS protocol is ontworpen voor vers bevroren weefsel herstellen met ethanol en verwijderen van lipiden met xyleen voor verbeterde morfologische visualisatie onder de lichte microscopie van hoge vergroting. Dit protocol houdt geen rekening met andere methoden fixatie en is speciaal ontworpen voor vers bevroren weefselsteekproeven gevangen met behulp van een ultraviolet (UV)-LCM systeem. Hier presenteren we een volledige protocol voor segmenteren en tot vaststelling van vers bevroren post mortem menselijk cerebellaire weefsel en zuivering van RNA van Purkinje cellen geïsoleerd door UV-LCM, met behoud van RNA kwaliteit voor latere RNA-sequencing. In onze handen, dit protocol uitzonderlijke niveau van cellulaire visualisatie zonder de noodzaak voor kleurstoffen produceert en levert RNA met hoge RNA integriteit nummers (≥8) zo nodig voor transcriptionele profiling experimenten.

Dit protocol detailleert de stappen voor het voorbereiden van vers bevroren post mortem menselijk hersenweefsel voor UV-LCM. Grondig specificaties en aantekeningen worden gegeven voor het snijden van de cryostaat, als het kan moeilijk zijn om te snijden vers bevroren hersenweefsel met een hoge mate van precisie. Het belangrijkste punt om te overwegen is dat vers bevroren weefsel extreem koude is en vereist een aanzienlijke hoeveelheid tijd om te acclimatiseren aan de warmere temperatuur v...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Dit protocol maakt gebruik van een vlek-vrije benadering om te visualiseren en te isoleren Purkinje cellen in vers bevroren weefsel van menselijke post mortem cerebellum via laser vangt microdissection. Het doel van dit protocol is het genereren van voldoende hoeveelheden van hoogwaardige RNA voor RNA-sequencing.

Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Dit protocol is belangrijk, omdat het gebruik maakt van een vlek-vrije visualisatie methode in plaats van kleurstof-gebaseerde visualisatie op post-mortem menselijk hersenweefsel, die helpt behouden RNA integriteit. Het behoud van RNA is een groot voordeel in dit protocol, omdat het nuttig is, niet alleen in postmortem menselijk hersenweefsel, maar ook andere weefseltypen, met een hoge RNase-activiteit. Om te beginnen, verwijder het weefsel uit de vriezer en plaats het op droog ijs voor transport naar de cryostat.Plaats de schone borstels, de chuck en het weefsel gedurende ten minste 20 minuten in de cryostat, zodat ze de optimale temperatuur kunnen bereiken. Voor cryostats met dubbele kamers en specimen-holding temperaturen, stel de objecttemperatuur op min 16 graden Celsius en de kamertemperatuur op min 18 graden Celsius. Stel de sectiedikte van de cryostat in op 14 micrometer en de trimdikte op 30 micrometer.Maak vervolgens het podium schoon met een één-op-één mengsel van RNase-ontsmetingsmiddel en 70% ethanol, om bevriezing te voorkomen. Verkrijg een nieuw, wegwerp cryostat mes en maak het schoon met RNase decontaminator. Plaats het gereinigde mes in de bladhouder op het podium.Maak vervolgens de anti-rolplaat schoon met de RNase-ontsmettingsmiddel. Bevestig de gereinigde plaat aan het podium en wacht minstens 20 minuten tot het mes en de anti-rolplaat op de temperatuur van de cryostat zijn neergeschoten. Snijd eerst een klein stukje weefsel voor doorsnijding, om ervoor te zorgen dat de sectie ongeveer 95% cerebellar cortex is.Breng het resterende weefsel terug naar droogijs, of een vriezer, bij min 80 graden Celsius. Begin vervolgens langzaam oct op de top van de chuck toe te voegen met een langzame, cirkelvormige beweging. Bouw lagen OTC op totdat er een mount van ongeveer drie millimeter hoog is die de chuck bedekt.Wanneer de OCT gedeeltelijk bevroren is, maar nog wat vloeistof in het midden heeft, plaats de weefsels bovenop de berg. Laat het weefsel zitten op de top van de OKT voor een tot twee minuten totdat het volledig is bevroren. Breng vervolgens de chuck met de bevroren OKT en weefsel in de cryostat snijarm.Pas het weefsel zo aan dat het gelijk is met het snijmes en laat het weefsel 20 minuten in de snijarm zitten om zich aan te passen aan de nieuwe temperatuur. De meest kritieke stap is het toestaan van het weefsel om te acclimatiseren in de cryostat snijarm zo lang als nodig is. Als weefsel snippers, purkinje cel visualisatie zal zeer moeilijk zijn.Ik raad aan om kleinere, dunnere stukjes weefsel te gebruiken, zodat het weefsel sneller kan acclimatiseren. Beweeg hierna het weefsel langzaam dichter bij het mes. Zodra het weefsel het blad heeft bereikt, begint het trimmen proces.Trim het weefsel twee tot drie keer, totdat de cortex lagen zichtbaar zijn. Plaats en lijn vervolgens de anti-rolplaat net boven het cryostatblad. Snijd vier tot zes secties die 14 micrometer dik zijn, vaststellend dat goed gesneden secties plat onder de anti-roll plaat zal zijn.Lijn de snijsecties horizontaal over de cryostatfase uit. Hoek een dia op te halen alle van de weefselstukken tegelijk. Direct na het doorsnee van het weefsel, plaats de dia in de schuifhouder met 70% ethanol op ijs gedurende twee minuten.Breng de glijbaan gedurende 45 seconden met 95% ethanol op ijs naar een schuifhouder. Plaats vervolgens de schuif in de schuifhouder met 100% ethanol bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Dompel de glijbaan drie keer in de schuifhouder met xyleen nummer één bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de glijbaan in de schuifhouder met xyleen twee op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Zet de glijbanen in een schone rookkap en laat ze minstens 30 minuten aan de lucht drogen. Als u de glijbanen opslaat, plaatst u elk van beide in een aparte buis van 50 milliliter en plaatst u de buizen maximaal zeven dagen in een vriezer bij min 80 graden Celsius.Gebruik eerst RNase-ontsmetingsmiddel om het microscooppodium en de cap collection arm schoon te maken. Plaats met gehandschoende handen de glijbaan op de microscoop en een 500 microliter ondoorzichtige dop in de collectiearm. Bij een lage vergroting, lijn de ondoorzichtige dop over de cerebellar weefsel, ervoor te zorgen dat de dop bedekt het hele gebied dat is gevisualiseerd in het oogstuk.Gebruik een doelstelling van vijf tot 10 keer om de cerebellar-lagen te visualiseren. Plaats de cursor over de sectie waar moleculaire laag en granuale cellaag elkaar kruisen. Ga naar een 40 keer vergroting en visualiseer de purkinjecellen.Begin ze dan vast te leggen. Om te beginnen RNA collectie na de microdissection, voeg 50 microliter van cel lyse buffer aan de ondoorzichtige dop met de dop naar boven. Sluit de buis voorzichtig over de dop en ga verder met de verzameling zoals beschreven in het tekstprotocol.In dit protocol wordt vers, bevroren, postmortem, menselijk hersenweefsel voorbereid op UV-laserafvang microdissection. Na cryostat's sectioning in de toegewezen tekentijd, zijn de cellulaire lagen van het cerebellum gemakkelijk zichtbaar met vijf keer en 10 keer objectieve lenzen. Zoals hier te zien, een goede xyleen incubatie zorgt ervoor dat het weefsel donkerder en beter afbakent cellulaire lagen dan ethanol alleen.Bij het snijden op de laser capture microscoop, de 40 keer objectieve lens is nodig om ervoor te zorgen het vastleggen van alleen purkinje cellen en niet het omliggende weefsel. Zoals hier te zien, een goede incubatie in xyleen produceert een hoge kwaliteit morfologisch intact beeld in vergelijking met ethanol fixatie alleen. De cover slip vermogen van een ondoorzichtige dop wordt vervolgens getest, terwijl andere protocollen gebruik maken van een vloeistof gevulde dop, deze caps kunnen verminderen weefsel visualisatie en veroorzaken het resulterende beeld te worden korrelig en iriserend onder de microscoop.Visualisatie door middel van een ondoorzichtige dop resulteert echter in het gladgemaakte weefseluiterlijk dat zachter en scherper van vorm is. Representatieve beelden van uitgesneden purkinje cellen op een laag vermogen en op hoog vermogen tonen nauwkeurige verwijdering van alleen de purkinje cel lichaam. Hierna wordt Rnase van hoge kwaliteit verkregen voor latere RNA-sequencing.Zes representatieve monsters ondergingen RNA-extractie en werden opnieuw opgetrokken in 14 microliter rnase-vrij water en alle zes monsters produceerden RNA-integriteitsnummers van hoge kwaliteit die gelijk zijn aan of groter zijn dan acht. Het belangrijkste om te onthouden is dat weefsel kwaliteit is alles. Zelfs snijden en schuiven zal dit protocol maken of breken.Na deze procedure kan elke methode die RNA of DNA onderzoekt worden uitgevoerd, met name we onderzoeken ons RNA op differentiële genexpressie, maar ook andere vragen met betrekking tot genregulatie kunnen worden onderzocht. Deze methode kan worden toegepast op elk weefseltype dat specifieke afgebakende morfologie heeft die het gebruik van antigeen of kleurstofspecifieke reagentia niet vereist voor de identificatie van cellen van belang. We hopen dat deze techniek ons zal helpen begrijpen van de genetica van essentiële tremor en andere ziekten die een tremor fenotype hebben.De gevaarlijkste chemische stof die in dit protocol wordt gebruikt is xyleen. Het moet goed worden behandeld in een rookkap, goed verwijderd, en glijbanen moeten worden toegestaan om voldoende te drogen totdat ze in een open ruimte worden gebruikt. Bovendien, bij het werken met menselijke monsters, biohazardous afval beheer, en veiligheid moet worden gebruikt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...