Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Les auteurs aimerait le cerveau de la New York Bank, Dr Jean Paul Vonsattel et Dr Etty Cortés, pour leur aide dans le découpage et préserver les échantillons de tissu de cerveau humain congelé pour ces expériences. Les auteurs tiennent à remercier les personnes qui ont généreusement fait don de leur cerveau pour la recherche continue dans le tremblement essentiel. Dr. Faust et Dr Martuscello aimerait remercier Columbia University département de pathologie et biologie cellulaire pour leur soutien continu et un espace de recherche de base. Les auteurs aimerait remercier NIH R01 NS088257 Louis/Faust) pour financer la recherche pour ce projet. Images de LCM ont été réalisés dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Les auteurs aimerait Theresa Swayne et Laura Munteanu pour leur assistance continue avec la microscopie spécialisée.

Tous les échantillons humains utilisés dans le présent protocole ont été obtenus avec le consentement éclairé et ont été approuvés par l’interne Review Board (IRB) de Columbia University et l’Université de Yale.
Remarque : L’intégralité du présent protocole doit suivre RNA stricte gestion des lignes directrices, auquel cas une main gantée est toujours utilisée, toutes les surfaces sont nettoyées avec un décontaminant RNase et tous les documents de trav...

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	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. 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Le protocole présenté ici est spécialement modifié pour être une approche inox en visualisant les tissus morphologiquement distinctes pour UV-LCM. Cette méthode est conçue pour maximiser l’intégrité RNA pour ultérieur séquençage direct de RNA, tout en conservant un niveau de visualisation des tissus. La capacité de distinguer les différents types de cellules pour la capture, pour créer la plus pure population de cellules possible, est indispensable pour comprendre les différents profils moléculaires da...

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un précieux outil de recherche qui permet de séparer les cellules pathologiquement pertinentes pour les évaluations subséquentes moléculairement entraînée. L’utilisation des analyses moléculaires dans ces échantillons de tissus hétérogènes et la corrélation avec les données cliniques et pathologiques est une étape nécessaire pour évaluer l’importance translationnelle de la recherche biologique1. Lors de l’analyse des données d’expression de gène de l’ARN, l’utilisation de coupes de tissus congelés est hautement recommandée car il permet l’excellente qualité de l’ARN ainsi que maximiser la quantité2. Il a été bien établi que la qualité et la quantité d’ARN sont essentiels pour des données significatives de RNA séquençage3. Toutefois, lorsque vous utilisez RNA de tissus frais congelés post mortem pour LCM, dégradation de l’ARN est un défi majeur, car il se produit immédiatement après la mort et son étendue est médiée par des facteurs divers associés avec les tissus collection méthode4,5 . En outre, dégradation de l’ARN est exacerbée lorsque des techniques de coloration sont nécessaires pour reconnaître les détails histologiques et l’identification de la cellule. Spécialisée de coloration des techniques telles que l’hématoxyline et éosine, teinté de Nissl, immunofluorescence et l’immunohistochimie sont utiles pour différencier les cellules du stroma environnant, mais auraient dû être divulgués à dégrader RNA et modifier l’expression de la transcription 6de profils. Par conséquent, notre laboratoire a créé un protocole en acier inoxydable spécialement conçu pour préserver les RNA dans post mortem cervelet humain aux fins de séquençage de RNA après isolement de LCM des neurones de Purkinje.
Dans le traitement des tissus congelés frais pour LCM, la méthode de fixation peut affecter variablement d’intégrité d’ARN et de tissus. Fixation de formol est standard pour la préservation morphologique, mais causes réticulation qui peuvent fragmenter RNA et nuire à la RNA amplification7. Fixation de l’éthanol est une meilleure alternative pour les ARN, comme c’est un fixateur coagulantes qui n’induit pas de réticulation1. Afin d’améliorer la visualisation de la morphologie tissulaire, xylène est le meilleur choix, car il supprime des lipides dans les tissus. Cependant, il existe connus des limitations lors de l’utilisation de xylène dans LCM, car les tissus peuvent sécher et devenir cassant causant fragmentation de tissu sur laser capture7. Xylène est aussi une toxine volatile et doit être manipulé correctement sous une hotte. Néanmoins, le xylène a été démontré pour améliorer la visualisation des tissus tout en préservant l’intégrité de RNA8. Par conséquent, notre protocole est centrée autour de l’utilisation de la fixation de l’éthanol 70 % et de déshydratation de l’éthanol, suivie d’incubation xylène pour plus de clarté morphologiques.
Il est important de noter les différents types de systèmes de microdissection laser-basé, comme ils auraient dû être divulgués diffèrent en vitesse, précision et qualité de RNA. Laser infrarouge (IR) capture microdissection et les systèmes microdissection des microfaisceaux de laser ultraviolets (UV) étaient les deux plates-formes de LCM nouveaux qui ont émergé, presque en même temps,8. Le système IR-LCM emploie un « système de contact » à l’aide d’un film thermoplastique transparent placé directement sur la section de tissus et cellules d’intérêt sélectivement adhèrent au film par impulsions ciblées d’un laser IR. Alternativement, le système UV-LCM est un « système de non-contact » par laquelle un faisceau laser focalisé coupe loin des cellules ou des régions d’intérêt dans le tissu ; Selon la configuration à deux plates-formes commerciales actuellement disponibles qui utilisent soit un design microscope inversé ou redressée, tissu est acquis dans un dispositif de collecte par une onde de pression induite par laser qu’il propulse contre la gravité ou le tissu est recueillis par gravité, respectivement. Des avantages significatifs du système UV-LCM incluent accélérer l’acquisition cellulaire, collection sans contamination avec l’approche sans contact et une dissection plus précise grâce à un beaucoup plus petit laser faisceau de diamètre9. Ce protocole a été spécialement conçu pour un système UV-LCM et n’a pas été testé dans un système IR-LCM. Soit design du système UV-LCM, lorsque les cellules s’accumulent dans le capuchon de la collection, l’utilisation d’une lamelle qui améliore la clarté cellulaire au cours de la microscopie ne convient pas, car les cellules seraient incapables d’entrer dans le plafond de la collection. Par conséquent, pour améliorer la visualisation des tissus, nous avons testé l’utilisation de bouchons collection Opaque, qui sont conçus pour agir comme un lamelle couvre-objet pour visualisation microscopique dans les systèmes UV-LCM, contre casquettes collection remplie liquide. Casquettes de la collection remplie liquide peuvent être difficile, car le liquide est soumise à l’évaporation et doit être remplacé fréquemment alors qu’il travaillait au microscope. Le temps devient un facteur important pour la stabilité du RNA, comme le tissu capturé dissout immédiatement7.
Notre laboratoire étudie les changements neuropathologique post-mortem dans le cervelet des patients atteints de tremblement essentiel (he) et neurodégénératives apparentées du cervelet. Nous avons démontré de modifications morphologiques centrées sur des cellules de Purkinje qui distinguent ET cas par rapport aux contrôles, y compris un réduction du nombre de cellules de Purkinje, a augmenté de régression dendritique et une variété de changements axonales, qui nous conduit à postuler que Purkinje dégénérescence des cellules est une fonctionnalité de base biologique ET pathogenèse10,11,12,13. Transcription de profilage a été utilisé dans de nombreuses maladies neurologiques pour explorer les bases moléculaires sous-jacents des changements cellulaires dégénératifs. Cependant, profils transcriptionnelles des échantillons hétérogènes, tels que des régions de tissus du cerveau, peuvent effectivement masquer l’expression de transcriptions de faible abondance et/ou diminuer la détection des changements moléculaires qui se produisent uniquement dans une petite population de touchés cellules, telles que les cellules de Purkinje du cortex cérébelleux. Par exemple, des cellules de Purkinje sont largement dépassés en nombre par les cellules de granules abondante dans le cortex cérébelleux par environ 1 : 3000 ; ainsi, pour cibler efficacement leur transcriptome exige l’isolation spécifique de ces neurones. Le cortex cérébelleux est délimité par des couches distinctes qui diffèrent dans la densité cellulaire et la taille des cellules. Cette architecture cellulaire est idéale pour visualiser dans un échantillon de tissus frais congelés sans réactifs de coloration contenant du colorant. En théorie, ce protocole pourrait également être appliqué à d’autres types de tissus qui ont même tissu distinctif organisation.
Ce protocole a été conçu pour fonctionner spécifiquement pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem. Plusieurs protocoles existent pour la fixation, la coloration de la visualisation et la préservation de RNA de nombreux types de tissus aux fins des deux IR et UV-LCM. Lorsque l'on envisage un plan expérimental pour UV-LCM, individus devraient adapter leur protocole au mieux les besoins et exigences de début et de fin des matériaux. Ici, nous combinons plusieurs aspects de différents protocoles de LCM pour fournir une méthode améliorée pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post mortem sans avoir besoin de colorant contenant des réactifs de coloration pour préparer l’ARN de haute qualité pour transcriptome séquençage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un outil avantageux qui permet la collecte de cellules cytologiquement et/ou phénotypiquement pertinentes ou régions de tissus hétérogènes. Produit capturé peut être utilisé dans une variété de méthodes moléculaires pour les protéines, isolement d’ADN ou d’ARN. Cependant, la préservation de l’ARN de tissus post-mortem de cerveau humain est particulièrement difficile. Techniques de visualisation standard pour LCM nécessitent histologique ou méthodes de coloration immunohistochimique qui peuvent encore dégradent RNA. Par conséquent, nous avons conçu un protocole en acier inoxydable pour la visualisation dans LCM avec le but de préserver l’intégrité du RNA dans le tissu de cerveau humain post-mortem. Les cellules de Purkinje du cervelet est un bon candidat pour une visualisation en acier inoxydable, en raison de sa taille et sa localisation caractéristique. Le cortex cérébelleux a couches distinctes qui diffèrent dans la densité des cellules, ce qui les rend un bon archétype d’identifier sous microscope grossissement élevé. Les cellules de Purkinje sont grands neurones situées entre la couche de cellules de granules, qui est un réseau cellulaire dense de petits neurones, et la couche moléculaire, ce qui est rare dans les corps cellulaires. Grâce à cette architecture, l’utilisation de la visualisation en acier inoxydable est faisable. Autres systèmes d’organe ou cellule qui imitent ce phénotype conviendraient également. Le protocole en acier inoxydable est conçu pour corriger les tissus frais congelés avec de l’éthanol et supprimer les lipides avec xylène pour meilleure visualisation morphologique sous microscopie optique grossissement élevé. Ce protocole ne tient pas compte d’autres méthodes de fixation et est spécialement conçu pour les échantillons de tissus frais congelés capturées à l’aide d’un rayonnement ultraviolet (UV)-système de LCM. Nous présentons ici un protocole complet pour sectionnement et fixation tissu cérébelleux humain congelé frais post mortem et purification de l’ARN des cellules de Purkinje isolées par UV-LCM, tout en préservant la qualité de RNA pour RNA-sequencing ultérieur. Dans nos mains, ce protocole produit des niveaux exceptionnels de visualisation cellulaire sans besoin de réactifs de coloration et rendements RNA avec des nombres élevés de l’intégrité des RNA (≥8) selon les besoins pour des expériences de profilage transcriptionnels.

Ce protocole détaille les étapes pour la préparation des tissus cérébraux humains congelés frais post mortem pour UV-LCM. Annotations et spécifications approfondies sont données pour la découpe du cryostat, comme il peut être difficile de couper le tissu cérébral congelées fraîches avec un degré élevé de précision. Le point le plus important à considérer est que les tissus frais congelés est extrêmement froid et nécessite une quantité importante de temps pour s’a...

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A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Ce protocole utilise une approche sans tache de visualiser et d’isoler les cellules de Purkinje dans les tissus frais congelés de cervelet humain post-mortem par microdissection de saisie de laser. Ce protocole vise à produire des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour RNA-sequencing.

Un protocole en acier inoxydable pour l’ARN haute qualité laser capturer des cellules de Microdissected Purkinje du cervelet humain Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Ce protocole est significatif, parce qu’il utilise une méthode de visualisation sans taches au lieu de la visualisation basée sur le colorant sur le tissu cérébral humain post mortem, qui aide à préserver l’intégrité de l’ARN. La préservation de l’ARN est un grand avantage dans ce protocole, car il est utile, non seulement dans le tissu cérébral humain post mortem, mais aussi d’autres types de tissus, avec une activité rnase élevée. Pour commencer, retirez le tissu du congélateur et placez-le sur de la glace sèche pour le transporter au cryostat.Placez les brosses propres, le mandrin et le tissu dans le cryostat pendant au moins 20 minutes, pour leur permettre d’atteindre la température optimale. Pour les cryostats avec des chambres doubles et des températures de détention de spécimens, réglez la température de l’objet à moins 16 degrés Celsius et la température de la chambre à moins 18 degrés Celsius. Réglez l’épaisseur de la section du cryostat à 14 micromètres et l’épaisseur de la garniture à 30 micromètres.Ensuite, nettoyez la scène avec un mélange de décontamination RNase et 70% d’éthanol, pour éviter le gel. Obtenez une nouvelle lame de cryostat jetable et nettoyez-la avec un décontamineur RNase. Placez la lame nettoyée dans le porte-lame sur la scène.Ensuite, nettoyez la plaque anti-roulis avec le décontamineur RNase. Attachez la plaque nettoyée à la scène et attendez au moins 20 minutes que la lame et la plaque anti-roulis descendent à la température du cryostat. Tout d’abord, couper un petit morceau de tissu pour la section, en s’assurant que la section est d’environ 95% cortex cerebellar.Remettre le reste du tissu soit à la glace sèche, soit au congélateur, à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, commencez lentement à ajouter oct sur le dessus du mandrin avec un lent, mouvement circulaire. Accumulez des couches d’OTC jusqu’à ce qu’il y ait une monture d’environ trois millimètres de haut couvrant le mandrin.Lorsque l’OCT est partiellement congelé, mais a encore un peu de liquide au centre, placez les tissus sur le dessus de la monture. Laisser reposer le tissu sur le dessus de l’OCT pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé. Ensuite, transférez le mandrin avec l’OCT congelé et le tissu dans le bras de coupe cryostat.Ajustez le tissu de façon à ce qu’il soit rincé avec la lame de coupe et laissez le tissu reposer dans le bras de coupe pendant 20 minutes pour s’adapter à la nouvelle température. L’étape la plus critique est de permettre au tissu de s’acclimater dans le bras de coupe cryostat aussi longtemps que nécessaire. Si les tissus déchiquetent, la visualisation cellulaire purkinje sera très difficile.Je recommande d’utiliser des tissus plus petits et plus minces pour permettre au tissu de s’acclimater plus rapidement. Après cela, déplacez lentement le tissu plus près de la lame. Une fois que le tissu a atteint la lame, commencer le processus de coupe.Couper le tissu deux à trois fois, jusqu’à ce que les couches du cortex soient visibles. Ensuite, placez et alignez la plaque anti-roulis juste au-dessus de la lame cryostat. Coupez quatre à six sections de 14 micromètres d’épaisseur, en notant que les sections correctement coupées seront à plat sous la plaque anti-roulis.Alignez les sections coupées horizontalement sur le stade cryostat. Inclinez une glissière pour ramasser tous les morceaux de tissu simultanément. Immédiatement après avoir sectionner le tissu, placez la lame dans le porte-lame avec 70 % d’éthanol sur la glace pendant deux minutes.Transférez la glissade sur un support de glissière avec 95 % d’éthanol sur la glace pendant 45 secondes. Ensuite, placez la lame dans le support de diapositives avec 100% d’éthanol à température ambiante pendant deux minutes. Trempez la glissière trois fois dans le porte-glissière contenant du xylène numéro un à température ambiante.Ensuite, placez la glissière dans le support de diapositives avec du xylène deux à température ambiante pendant cinq minutes. Tenez les glissières dans un capot de fumée propre et laissez-les sécher à l’air pendant au moins 30 minutes. Si vous stockez les glissières, placez-les dans un tube séparé de 50 millilitres et placez les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant une période d’une période d’une période de sept jours.Tout d’abord, utilisez le décontamineur RNase pour nettoyer l’étape du microscope et le bras de collecte du bouchon. Avec les mains gantées, placez la lame sur le microscope et un bouchon opaque de 500 microlitres dans le bras de collecte. Lors d’un grossissement faible, aligner le capuchon opaque sur le tissu cerebellar, en s’assurant que le bouchon couvre toute la zone qui est visualisée dans le morceau d’oeil.Utilisez un objectif de cinq à dix fois pour visualiser les couches cerebellar. Placez le curseur sur la section où se croisent la couche moléculaire et la couche granuale des cellules. Passez à un grossissement 40 fois et visualisez les cellules purkinje.Ensuite, commencez à les capturer. Pour commencer la collecte de l’ARN après la microdissection, ajouter 50 microlitres de tampon de lyse cellulaire au bouchon opaque avec le bouchon orienté vers le haut. Fermez soigneusement le tube au-dessus du bouchon et procédez à la collecte comme indiqué dans le protocole de texte.Dans ce protocole, frais, congelé, post mortem, tissu cérébral humain est préparé pour la microdissection de capture laser UV. Après la section cryostat dans le temps de dessin alloué, les couches cellulaires du cervelet sont facilement visibles avec cinq fois et 10 fois des lentilles objectives. Comme on le voit ici, l’incubation appropriée du xylène fait que le tissu devient plus foncé et délimite mieux les couches cellulaires que l’éthanol seul.Lors de la coupe au microscope de capture laser, la lentille 40 fois objectif est nécessaire pour assurer la capture que les cellules purkinje et non pas le tissu environnant. Comme on le voit ici, l’incubation appropriée dans le xylène produit une image morphologiquement intacte de haute qualité par rapport à la seule fixation de l’éthanol. La capacité de glissement de couverture d’un capuchon opaque est ensuite testée tandis que d’autres protocoles utilisent un bouchon rempli de liquide, ces bouchons peuvent réduire la visualisation des tissus et provoquer l’image résultante d’être granulaire et irisé sous le microscope.Cependant, la visualisation à travers un capuchon opaque entraîne l’apparence lisse des tissus qui est plus doux et plus nette dans la forme. Des images représentatives de cellules purkinje excisées à faible puissance et à haute puissance montrent l’enlèvement précis du corps cellulaire purkinje. Après cela, rnase de haute qualité est obtenu pour le séquençage ultérieur de l’ARN.Six échantillons représentatifs ont subi l’extraction d’ARN et ont été résuspendus dans 14 microlitres d’eau sans arn et les six échantillons ont produit l’ARN de haute qualité avec des nombres d’intégrité d’ARN égaux ou supérieurs à huit. La chose la plus importante à retenir est que la qualité des tissus est tout. Même la coupe et le placement de diapositives feront ou rompront ce protocole.À la suite de cette procédure, toute méthode qui étudie l’ARN ou l’ADN pourrait être effectuée, en particulier nous sondons notre ARN pour l’expression différentielle des gènes, mais d’autres questions concernant la régulation des gènes pourraient également être étudiées. Cette méthode pourrait être appliquée à tout type de tissu qui a une morphologie délimitée spécifique qui ne nécessite pas l’utilisation d’antigènes ou de réagens spécifiques à la teinture pour l’identification des cellules d’intérêt. Nous espérons que cette technique nous aidera à comprendre la génétique des tremblements essentiels et d’autres maladies qui ont un phénotype tremblement.Le produit chimique le plus dangereux utilisé dans ce protocole est le xylène. Il doit être manipulé correctement dans un capot de fumée, éliminé correctement, et les glissières devraient être autorisées à sécher adéquatement jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans un espace ouvert. En outre, lorsque vous travaillez avec des échantillons humains, la gestion des déchets biodangereux et la sécurité devraient être utilisées.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

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Recherche

Neurosciences

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

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Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

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Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

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A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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