Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Die Autoren möchten The New York Brain Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel und Dr. Etty Cortés, für ihre Hilfe beim Schneiden und Erhaltung der gefrorenen menschlichen Gehirns Gewebeproben für diese Experimente bestätigen. Die Autoren möchten die Individuen zu würdigen, die ihr Gehirn für die anhaltende Forschung in essentieller Tremor großzügigerweise. Dr. Faust und Dr. Martuscello möchte, Columbia Universität Institut für Pathologie und Zellbiologie für ihre anhaltende Unterstützung und Kern Forschungsraum anzuerkennen. Die Autoren möchten NIH R01 NS088257 Louis/Faust anerkennen) für die Forschungsförderung für dieses Projekt. LCM-Bilder wurden in der Confocal durchgeführt und spezialisiert Mikroskopie Shared Resource Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University, unterstützt von NIH gewähren #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Die Autoren möchten Theresa Swayne und Laura Munteanu für ihre anhaltende Unterstützung mit spezialisierten Mikroskopie anerkennen.

Alle humanen Proben, die in diesem Protokoll genutzt mit Einwilligung gewonnen wurden und durch die internen Review Board (IRB) an der Columbia University und der Yale University genehmigt worden.
Hinweis: Die Gesamtheit dieses Protokolls sollte folgen strengen RNA Umgang mit Richtlinien, wobei eine behandschuhte Hand wird immer verwendet, alle Flächen mit einer RNase Dekontaminator gereinigt werden und alle Arbeitsmaterialien RNA/DNA/Nuklease frei sind.
<p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Die hier vorgestellten Protokoll ist speziell geändert, um einen rostfreien Ansatz bei der Visualisierung von morphologisch unterschiedlichen Gewebes für UV-LCM. Diese Methode soll die Integrität der RNA für die anschließende direkte RNA Sequenzierung, unter Beibehaltung einer Steigerung des Niveaus der Gewebe Visualisierung zu maximieren. Die Fähigkeit, verschiedene Zelltypen für Erfassung, erstellen die reinste Population von Zellen möglich ist, zu unterscheiden ist wichtig für das Verständnis der unterschied...

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung1. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge2maximiert. Es wurde auch festgestellt, dass hohe Qualität und Quantität der RNA Voraussetzung für aussagekräftige Daten aus RNA Sequenzierung3 sind. Jedoch ist bei Verwendung von RNA aus frisch gefrorenen Post Mortem Gewebe für LCM RNA-Abbau eine große Herausforderung, da es sofort nach Tod tritt und seine Ausdehnung wird durch verschiedene Faktoren im Zusammenhang mit dem Gewebe Sammlung Methode4,5 vermittelt . Darüber hinaus ist RNA-Abbau noch verschärft, wenn befleckenden Techniken erforderlich sind, um histologische Details und Zelle Identifikation zu erkennen. Spezialisiert, Färbetechniken wie Hämatoxylin und Eosin, Nissl Fleck, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry sind hilfreich bei der Differenzierung von Zellen aus umgebenden Stroma aber haben gezeigt, dass RNA abgebaut und Protokoll-Ausdruck ändern Profile-6. Daher hat unser Labor ein Edelstahl Protokoll speziell für RNA in Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn für die Zwecke der RNA Sequenzierung nach LCM Isolierung des Purkinje Neuronen erhalten erstellt.
Bei der Verarbeitung von frischen gefrorenen Gewebes für LCM, beeinflussen die Befestigungsmethode variabel RNA und Gewebe Integrität. Formalin-Fixierung ist standard für morphologische Erhaltung, aber Ursachen Vernetzung, die möglicherweise fragment RNA und RNA Amplifikation7stören. Ethanol-Fixierung ist eine bessere Alternative zur RNA-Isolierung, wie es ein coagulative Fixiermittel, die nicht vernetzende1induziert wird. Um die Darstellung der Morphologie der Gewebe zu erhöhen, ist Xylol die beste Wahl, da es Fette aus dem Gewebe entfernt. Allerdings gibt es Grenzen bekannte bei Xylol in LCM, wie das Gewebe können austrocknen und spröde verursacht Gewebe Fragmentierung auf Laser Capture7geworden. Xylol ist auch ein flüchtiger Toxin und muss in einer Dampfhaube richtig behandelt werden. Xylol ist dennoch nachweislich um Gewebe Visualisierung Beibehaltung auch RNA Integrität8zu verbessern. Daher konzentriert sich unser Protokoll auf die Verwendung von 70 % Ethanol Fixierung und Ethanol Dehydrierung, gefolgt von Xylol Inkubation für morphologische Klarheit.
Es ist wichtig, die verschiedenen Arten von lasergestützten Mikrodissektion Systeme, beachten, wie sie gezeigt haben, unterscheiden sich in Geschwindigkeit, Präzision und RNS-Qualität. Infrarot (IR) Laser capture Mikrodissektion und ultravioletten (UV) Laser Microbeam Microdissection Systeme waren beide neuartigen LCM-Plattformen, die fast gleichzeitig8entstanden. Die IR-LCM-System nutzt eine "Kontakte-System" mit einer transparenten thermoplastischen Folie direkt auf das Gewebe-Abschnitt platziert, und Zellen von Interesse gezielt einhalten des Films durch gezielte Impulse aus einem IR-Laser. Alternativ ist das UV-LCM-System ein "non-Contact-System", wobei ein fokussierten Laserstrahl entfernt die Zellen oder Regions of Interest im Gewebe schneidet; abhängig von der Konfiguration in zwei derzeit verfügbaren kommerziellen Plattformen, die entweder eine invertierte oder aufrechte Mikroskop-Design verwenden, Gewebe wird in einer Sammelvorrichtung durch eine Laser-induzierte Druckwelle, die es gegen die Schwerkraft katapultiert erworben oder Gewebe ist gesammelt durch die Schwerkraft, beziehungsweise. Wesentliche Vorteile des UV-LCM-Systems zählt schneller Zelle Erwerb, kontaminationsfrei Sammlung mit dem berührungslosen Ansatz und genauere Zergliederung durch eine viel kleinere Laser Beam Durchmesser9. Dieses Protokoll wurde speziell für ein UV-LCM-System und nicht in einem IR-LCM-System getestet wurde. In beiden UV-LCM-System-Design wenn Anhäufung Zellen in die Sammlung-Kappe, die Verwendung von einem Deckgläschen, die verbessert ist zellulären Klarheit während Mikroskopie nicht geeignet, da die Zellen nicht in der Lage, die Sammlung GAP einzugehen wäre. Daher haben wir getestet um Gewebe Visualisierung zu erhöhen, die Verwendung von undurchsichtigen Sammlung Caps, die als ein Deckglas für mikroskopische Visualisierung in UV-LCM-Systeme gegen Flüssigkeit gefüllte Sammlung Kappen dienen sollen. Flüssigkeit gefüllten Sammlung Kappen können schwierig sein, da die Flüssigkeit unterliegt der Verdunstung und häufig während der Arbeit am Mikroskop ausgewechselt werden. Zeit ist ein wichtiger Faktor für RNA-Stabilität, wie das aufgenommene Gewebe sofort7auflöst.
Unser Labor untersucht die Post-mortem neuropathischem Änderungen in das Kleinhirn von Patienten mit essentiellem Tremor (ET) und verwandte neurodegenerativen Erkrankungen des Kleinhirns. Wir haben gezeigt, dass morphologische Veränderungen auf Purkinje-Zellen, die ET Fällen im Vergleich zu Kontrollen, einschließlich einer reduzierten Anzahl von Purkinje-Zellen unterscheiden zentriert dendritischen Regression und eine Vielzahl von axonale Veränderungen führt uns zu postulieren, dass Purkinje Zelldegeneration ist eine biologische Kernfunktion ET Pathogenese10,11,12,13. Transkriptionelle Profilierung wurde in viele neurologische Erkrankungen eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekulare Grundlagen der degenerativen Zellveränderungen zu erkunden. Doch transcriptional Profile aus heterogenen Proben, wie Gewebe Hirnregionen, können wirksam Maske den Ausdruck der niedrigen Fülle Transkripte und/oder vermindern die Erkennung von molekularen Veränderungen, die nur in eine kleine Population von betroffenen auftreten Zellen, wie Purkinje-Zellen im Kleinhirn Kortex. Beispielsweise sind der Purkinje-Zellen erheblich durch die reichlich Granulat-Zellen im Kleinhirn Cortex von ca. 1:3000 Unterzahl; so effektiv auf erfordert ihre Transkriptom spezielle Isolierung dieser Neuronen. Zerebelläre Kortex ist durch unterschiedliche Schichten abgegrenzt, die in Zelle Dichte und Größe der Zellen unterscheiden. Diese zellulären Architektur ist ideal, um in eine Tiefkühlfrische Gewebeprobe ohne Farbstoff-haltigen Färbung Reagenzien zu visualisieren. In der Theorie könnte dieses Protokoll auch angewendet werden, auf anderen Gewebetypen, die ähnlich markanten Gewebe haben Organisation.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um speziell für Purkinje Zelle Visualisierung im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn zu arbeiten. Zahlreiche Protokolle gibt es für die Befestigung, Visualisierung und RNA Erhaltung vieler Arten von Geweben für die Zwecke der beiden IR und UV-LCM Färbung. Wenn ein experimentelles Design für UV-LCM erwägen, sollten Einzelpersonen ihr Protokoll passen am besten die Bedürfnisse und Anforderungen von beginnend und endend Materialien anpassen. Hier verbinden wir viele Aspekte der verschiedenen LCM-Protokolle ermöglichen eine verbesserte Methode zur Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-ohne die Notwendigkeit des Farbstoffes mit Färbung Reagenzien, qualitativ hochwertige RNA Transkriptom vorzubereiten Sequenzierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Laser Capture Microdissection (LCM) ist ein Vorteil, die für die Sammlung von zytologisch und/oder phänotypisch relevanten Zellen oder Regionen von heterogenen Gewebe ermöglicht. Erfasste Produkt kann verwendet werden, in einer Vielzahl von molekularen Methoden für Protein, DNA oder RNA isoliert. Erhaltung der RNA aus Post-mortem Gehirngewebe ist jedoch eine besondere Herausforderung. Immunhistochemische Färbung Verfahren, die weiter verschlechtern RNA oder Standard Visualisierungstechniken für LCM erfordern histologische. Daher haben wir ein Edelstahl-Protokoll zur Visualisierung in LCM mit dem Verwendungszweck der Erhaltung der Integrität der RNA in Post-Mortem Gehirngewebe entwickelt. Die Purkinje-Zelle des Kleinhirns ist ein guter Kandidat für Edelstahl-Visualisierung, aufgrund seiner Größe und charakteristischen Lage. Die zerebelläre Kortex besteht aus unterschiedlichen Schichten, die sich in Zelldichte unterscheiden, so dass sie eine gute Archetyp, unter starker Vergrößerung Mikroskopieren zu identifizieren. Purkinje-Zellen sind große Neuronen liegt zwischen Granulat Zellschicht, die dicht Mobilfunknetz kleinen Neuronen, und die molekulare Schicht, die in Zellkörpern spärlich ist. Wegen dieser Architektur ist der Einsatz von Edelstahl Visualisierung möglich. Geeignet wäre auch andere Organ oder eine Zelle Systeme, die diesen Phänotyp zu imitieren. Das Edelstahl-Protokoll soll fix Tiefkühlfrische Gewebe mit Ethanol und Lipide mit Xylol für verbesserte morphologische Visualisierung unter hoher Vergrößerung Lichtmikroskopie zu entfernen. Dieses Protokoll nicht für andere Fixierung Methoden berücksichtigt und ist speziell für Tiefkühlfrische Gewebeproben mit einer ultravioletten (UV) erfasst-LCM-System. Hier präsentieren wir Ihnen eine vollständige Protokoll für schneiden und Festsetzung von frisch gefrorenen Post-Mortem-zerebelläre Gewebe und Reinigung der RNA von Purkinje-Zellen, die durch UV-LCM, unter Beibehaltung der RNS-Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung isoliert. In unseren Händen dieses Protokoll produziert außergewöhnliches Maß an zellulären Visualisierung ohne Reagenzien Färbung und RNA mit hoher RNA Integrität Zahlen (≥8) ergibt, Bedarf für transkriptionelle Profilerstellung Experimente.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die Zubereitung von frisch gefrorenen Post-Mortem-menschlichen Hirngewebe für UV-LCM. Gründliche technische Daten und Anmerkungen sind für Kryostat schneiden, angegeben, da es frisch gefrorenen Hirngewebe mit einem hohen Maß an Präzision schneiden schwierig sein kann. Der wichtigste Punkt ist, dass frisches gefrorenes Gewebe extrem kalt ist und eine erhebliche Menge an Zeit erfordert, um auf die wärmere Temperatur von einem Kryostat zu a...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Dieses Protokoll verwendet einen fleckenfreie Ansatz zu visualisieren und Purkinje-Zellen im Tiefkühlfrische Gewebe von Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn per Laser Capture Microdissection zu isolieren. Der Zweck dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die RNA-Sequenzierung zu generieren.

Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine fleckenfreie Visualisierungsmethode anstelle einer farbbasierten Visualisierung auf post-mortem menschlichem Gehirngewebe verwendet, die dazu beiträgt, die Integrität der RNA zu erhalten. Die Konservierung von RNA ist ein großer Vorteil in diesem Protokoll, da es nützlich ist, nicht nur im post-mortem menschlichen Gehirngewebe, sondern auch in anderen Gewebetypen, mit hoher RNase-Aktivität. Um zu beginnen, entfernen Sie das Gewebe aus dem Gefrierschrank und legen Sie es auf Trockeneis für den Transport zum Kryostat.Legen Sie die sauberen Bürsten, das Futter und das Gewebe mindestens 20 Minuten in den Kryostat, damit sie die optimale Temperatur erreichen können. Für Kryostate mit zwei Kammern und Probenhaltetemperaturen stellen Sie die Objekttemperatur auf minus 16 Grad Celsius und die Kammertemperatur auf minus 18 Grad Celsius ein. Stellen Sie die Schnittdicke des Kryostats auf 14 Mikrometer und die Trimmdicke auf 30 Mikrometer ein.Als nächstes reinigen Sie die Stufe mit einer Eins-zu-eins-Mischung aus RNase-Dekontaminator und 70%Ethanol, um das Einfrieren zu verhindern. Besorgen Sie sich eine neue Einweg-Kryostatklinge und reinigen Sie sie mit dem RNase-Dekontaminator. Legen Sie die gereinigte Klinge in den Klingenhalter auf die Bühne.Reinigen Sie dann die Anti-Roll-Platte mit dem RNase-Dekontaminator. Befestigen Sie die gereinigte Platte an der Bühne und warten Sie mindestens 20 Minuten, bis die Klinge und die Anti-Roll-Platte auf die Temperatur des Kryostats herunterkommen. Schneiden Sie zunächst ein kleines Stück Gewebe für die Schnitte, um sicherzustellen, dass der Abschnitt etwa 95% Kleinhirnkortex ist.Das restliche Gewebe entweder in Trockeneis oder in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius zurückgeben. Als nächstes beginnen Sie langsam OCT auf dem Futter mit einer langsamen, kreisförmigen Bewegung hinzufügen. Bauen Sie Schichten von OTC auf, bis eine etwa drei Millimeter hohe Halterung das Futter bedeckt.Wenn das OCT teilweise eingefroren ist, aber noch etwas Flüssigkeit in der Mitte hat, legen Sie das Gewebe auf die Halterung. Lassen Sie das Gewebe ein bis zwei Minuten auf dem OCT sitzen, bis es vollständig eingefroren ist. Dann das Futter mit dem gefrorenen OCT und Gewebe in den Kryostatschneidarm übertragen.Stellen Sie das Gewebe so ein, dass es mit der Schneidklinge bündig ist, und lassen Sie das Gewebe 20 Minuten im Schneidarm sitzen, um sich an die neue Temperatur anzupassen. Der kritischste Schritt besteht darin, das Gewebe so lange wie nötig im Kryostat-Schneidarm zu akklimatisieren. Wenn Gewebe zerkleinert wird, wird die Visualisierung von Purkinje-Zellen sehr schwierig sein.Ich empfehle die Verwendung kleinerer, dünnerer Gewebestücke, damit sich das Gewebe schneller akklimatisieren kann. Danach bewegen Sie das Gewebe langsam näher an die Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, beginnen Sie den Trimmprozess.Schneiden Sie das Gewebe zwei- bis dreimal, bis die Kortexschichten sichtbar sind. Als nächstes platzieren und richten Sie die Anti-Roll-Platte direkt über der Kryostatklinge aus. Schneiden Sie vier bis sechs Abschnitte, die 14 Mikrometer dick sind, und beachten Sie, dass richtig geschnittene Abschnitte unter der Anti-Roll-Platte flach sein werden.Richten Sie die Schnittabschnitte horizontal über die Kryostatstufe aus. Winkeln Sie eine Folie, um alle Gewebeteile gleichzeitig aufzunehmen. Unmittelbar nach dem Teilen des Gewebes die Rutsche mit 70% Ethanol zwei Minuten lang in den Schiebehalter legen.Übertragen Sie die Rutsche 45 Sekunden lang auf einen Schiebehalter mit 95% Ethanol auf Eis. Als nächstes legen Sie die Rutsche in den Schiebehalter mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Tauchen Sie die Rutsche dreimal in den Diahalter mit Xylol Nummer eins bei Raumtemperatur.Legen Sie dann die Rutsche fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in den Diahalter mit Xylol zwei. Halten Sie die Rutschen in einer sauberen Dunstabzugshaube hoch und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten an der Luft trocknen. Wenn Sie die Dias lagern, legen Sie sie jeweils in ein separates 50-Milliliter-Rohr und legen Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für bis zu sieben Tage in einen Gefrierschrank.Verwenden Sie zunächst den RNase-Dekontaminator, um die Mikroskopstufe und den Kappensammelarm zu reinigen. Mit handschuhen legen Sie das Dia auf das Mikroskop und eine 500 Mikroliter opake Kappe im Sammelarm. Richten Sie bei geringer Vergrößerung die undurchsichtige Kappe über das Kleinhirngewebe aus, um zu versichern, dass die Kappe den gesamten Bereich bedeckt, der im Augenstück visualisiert wird.Verwenden Sie ein fünfmal- bis zehnfaches Objektiv, um die Kleinhirnschichten zu visualisieren. Platzieren Sie den Cursor über dem Abschnitt, in dem sich molekulare Schicht und Granual Zellschicht schneiden. Wechseln Sie zu einer 40-fachen Vergrößerung und visualisieren Sie die Purkinje-Zellen.Beginnen Sie dann, sie einzufangen. Um die RNA-Sammlung nach der Mikrodissektion zu beginnen, fügen Sie 50 Mikroliter Zelllysepuffer zur opaken Kappe mit nach oben gerichteter Kappe hinzu. Schließen Sie die Röhre vorsichtig über die Kappe, und fahren Sie mit der Sammlung fort, wie im Textprotokoll beschrieben.In diesem Protokoll wird frisches, gefrorenes, post-mortem, menschliches Hirngewebe für die UV-LasererfassungMikrosektion vorbereitet. Nach der Kryostat-Sektion in der zugeteilten Zeichnungszeit sind die zellulären Schichten des Kleinhirns mit fünf- und zehnfachen Objektiven gut sichtbar. Wie hier gesehen, führt die richtige Xylol-Inkubation dazu, dass das Gewebe dunkler wird und die zellulären Schichten besser abgrenzt als Ethanol allein.Beim Schneiden am Laseraufnahmemikroskop wird die 40-fache Objektivlinse benötigt, um sicherzustellen, dass nur Purkinje-Zellen und nicht das umgebende Gewebe erfasst werden. Wie hier zu sehen, erzeugt die richtige Inkubation in Xylol ein qualitativ hochwertiges morphologisch intaktes Bild im Vergleich zur Ethanolfixierung allein. Die Deckschlupkfähigkeit einer opaken Kappe wird dann getestet, während andere Protokolle eine flüssigkeitsgefüllte Kappe verwenden, diese Kappen können die Gewebevisualisierung reduzieren und dazu führen, dass das resultierende Bild unter dem Mikroskop granular und schillernd ist.Die Visualisierung durch eine undurchsichtige Kappe führt jedoch zu einem geglätteten Gewebebild, das weicher und schärfer ist. Repräsentative Bilder von verbrauchenden Purkinje-Zellen bei geringer Leistung und bei hoher Leistung zeigen eine präzise Entfernung nur des Purkinje-Zellkörpers. Danach wird eine hochwertige Rnase für die nachfolgende RNA-Sequenzierung erhalten.Sechs repräsentative Proben wurden einer RNA-Extraktion unterzogen und in 14 Mikroliter Rnase-freiem Wasser resuspendiert, und alle sechs Proben produzierten hochwertige RNA mit RNA-Integritätszahlen von bis zu acht. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass Gewebequalität alles ist. Auch Schneiden und Schieben Platzierung wird dieses Protokoll machen oder brechen.Nach diesem Verfahren könnte jede Methode, die RNA oder DNA untersucht, durchgeführt werden, insbesondere wir untersuchen unsere RNA auf Differentialgenexpression, aber auch andere Fragen zur Genregulation könnten untersucht werden. Diese Methode könnte auf jeden Gewebetyp angewendet werden, der eine spezifische abgegrenzte Morphologie hat, die nicht die Verwendung von Antigen- oder farbstoffspezifischen Reagenzien zur Identifizierung von von Von interesseen Zellen erfordert. Wir hoffen, dass diese Technik uns helfen wird, die Genetik von essentiellen Zittern und anderen Krankheiten zu verstehen, die einen Zittern-Phänotyp haben.Die gefährlichste Chemikalie, die in diesem Protokoll verwendet wird, ist Xylol. Es sollte ordnungsgemäß in einer Dunstabzugshaube behandelt, ordnungsgemäß entsorgt werden, und Rutschen sollten ausreichend trocknen dürfen, bis sie in einem offenen Raum verwendet werden. Darüber hinaus sollten bei der Arbeit mit menschlichen Proben biogefährliche Abfallentsorgung und Sicherheit genutzt werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...