Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר בנק בניו-יורק המוח, ד ר ז'אן פול Vonsattel, ד ר אטי קורטס, לסיוע שלהם ב חיתוך ושימור דגימות רקמה את המוח האנושי קפוא לניסויים אלה. המחברים רוצה להכיר את האנשים אשר תרם בנדיבות את המוח שלהם למחקר המשך לתוך רעד חיוני. ד ר פאוסט, ד ר Martuscello רוצה להכיר מחלקת פתולוגיה של אוניברסיטת קולומביה, ביולוגיה של התא על תמיכתם המתמשכת הליבה מחקר שטח. המחברים רוצה להכיר NIH R01 NS088257 לואי/פאוסט...) למימון מחקר עבור פרוייקט זה. תמונות LCM בוצעו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). המחברים רוצה להכיר תרזה Swayne, לורה מונטאנו לסיוע המשך שלהם עם מיקרוסקופ מיוחד.

כל הדגימות אדם מנוצל פרוטוקול זה הושגו עם הסכמה מדעת, אושרו על ידי פנימיות סקירה לוח (IRB) באוניברסיטת קולומביה, אוניברסיטת ייל.
הערה: מכלול של פרוטוקול זה צריך לעקוב קפדנית RNA טיפול הנחיות, לפיה יד בכפפה משמש תמיד, כל המשטחים מנוקים עם decontaminator RNase כל עובד שחומרים RNA/DNA/נ...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

פרוטוקול המובאת כאן במיוחד משתנים להיות בגישה אל חלד ב להמחיש רקמות מורפולוגית נפרדות עבור UV-LCM שיטה זו נועדה להגדיל RNA שלמות עוקבות רצפי RNA ישיר, תוך שמירה על רמת משופרת של רקמות ויזואליזציה. היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים עבור לכידה, כדי ליצור את האוכלוסייה הטהור של תאים אפשרי, חיוני לה?...

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי רב ערך מחקר המאפשרת הפרדת תאים באופן פתולוגי רלוונטי להערכת מולקולרי מונע עוקבות. השימוש של ניתוחים מולקולריים אלו דגימות רקמה הטרוגנית, המתאם עם נתונים פתולוגית וקלינית הוא צעד שנדרש לצורך הערכת המשמעות translational של המחקר הביולוגי1. בעת ניתוח נתוני ביטוי גנים RNA, השימוש של מקטעי רקמת קפוא מומלץ מאוד שכן היא מאפשרת עבור איכות מעולה של RNA וכן מוגדל כמות2. זה הוכח גם כי באיכות גבוהה והן את כמות ה-RNA הם חיוניים עבור נתונים משמעותיים בין רצפי הרנ א3. עם זאת, בעת שימוש RNA מרקמות טריים קפואים פוסט-מורטם עבור הפונקציה LCM, השפלה RNA הוא אתגר גדול, כמו זה מתרחש מיד עם מותו את מימדיו מתווך על ידי גורמים שונים הקשורים עם רקמת אוסף שיטה4,5 . יתר על כן, ה-RNA השפלה היא מתעצמת כאשר טכניקות צביעת נדרשים לזהות פרטים היסטולוגית וזיהוי התא. התמחה מכתים טכניקות, hematoxylin & אאוזין, הכתם Nissl, immunofluorescence ו אימונוהיסטוכימיה מועילים ב המבדילים תאים של משתית שמסביב אבל הוכחו לבזות RNA ולשנות התעתיק ביטוי פרופילים6. לכן, המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול נירוסטה שתוכננה במיוחד כדי לשמר RNA המח האנושי פוסט-מורטם למטרות של רצפי RNA לאחר LCM בידוד של נוירונים Purkinje.
עיבוד רקמה קפוא טרי עבור הפונקציה LCM, שיטת קיבוע יכול להשפיע variably RNA וגם רקמות תקינות. קיבוע פורמלין הוא תקן לשימור מורפולוגי, אך גורם cross-linking זה ייתכן קטע RNA ומשבשים RNA הגברה7. קיבוע אתנול הוא חלופה טובה יותר לבידוד RNA, כפי שהוא מקבע coagulative זה לא לגרום cross-linking1. כדי לשפר את החזיית מורפולוגיה רקמות, קסילן היא הבחירה הטובה ביותר, כאשר הוא מסיר שומנים מן הרקמה. עם זאת, שם מוכרים מגבלות כאשר ניצול קסילן ב LCM, כמו הרקמות יכול להתייבש ולהיות שביר-גרימת רקמות פיצול על לייזר לכידת7. קסילן גם רעלן נדיפים, חייבים להיות מטופלים כראוי בשכונה fume. למרות זאת, קסילן הוכח כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה תוך גם שמירה על תקינות רנ א8. לכן, פרוטוקול שלנו סובבת, השימוש של 70% אתנול קיבוע והתייבשות אתנול, ואחריו קסילן הדגירה עבור בהירות מורפולוגי.
חשוב לציין סוגים שונים של מערכות microdissection מבוססת לייזר, כפי הם הוכחו נבדלים מהירות, דיוק ואיכות RNA. הלייזר האינפרא-אדום (IR) ללכוד microdissection ומערכות אולטרה סגול (UV) לייזר microbeam microdissection היו שתי פלטפורמות LCM הרומן שצצו כמעט במקביל8. מערכת אינפרא-אדום-LCM מעסיקה "מערכת קשר" באמצעות סרט גומי סינתטי אשר בהתקשותו שקוף וממוקם על סעיף רקמות, תאים עניין באופן סלקטיבי לדבוק הסרט על-ידי פולסים ממוקד של לייזר אינפרא-אדום. לחלופין, מערכת UV-LCM היא "מערכת ללא מגע" לפיה קרן לייזר ממוקדת חותך את התאים או אזורים של עניין בתוך הרקמה; בהתאם לתצורת ב שתי פלטפורמות מסחריות זמין כעת המשתמשות או עיצוב מיקרוסקופ הפוכה או זקוף, רקמות נרכש מכשיר אוסף ע י גל הלחץ לייזר המושרה זה משפד אותו נגד כוח המשיכה או רקמה אסף על-ידי כוח הכבידה, בהתאמה. יתרונות משמעותיים של מערכת UV-LCM כוללים רכישת תא מהר יותר, ללא זיהום אוסף עם גישה ללא מגע, ניתוח מדויק יותר בשל הרבה יותר קטן לייזר קרן בקוטר9. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור מערכת UV-LCM, לא נבדק בכל מערכת אינפרא-אדום-LCM. גם עיצוב מערכת UV-LCM, כאשר תאים צבירת לתוך הכיפה איסוף, שימוש coverslip זה משפר את בהירות הסלולר במהלך מיקרוסקופ אינו מתאים, כמו התאים לא יוכל להיכנס לתוך הכיפה אוסף. לכן, כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה, בדקנו את השימוש של אוסף אטום caps, אשר נועדו לשמש coverslip להמחשת מיקרוסקופיים מערכות UV-LCM, נגד נוזלי אוסף מלא בקבוקים. אוסף מילוי נוזלי כמוסות עשויה להיות מאתגרת, הנוזל כפוף אידוי, יש להחליפם בתדירות גבוהה תוך כדי עבודה על המיקרוסקופ. הזמן הופך להיות גורם חשוב ליציבות RNA, כפי הרקמה שנתפסו לבישום7.
המעבדה שלנו מחקרים השינויים neuropathologic לאחר המוות הקטן בחולים עם רעד חיוני (ET) והפרעות הקשורות ניווניות של הצרבלום. הראו שינויים מורפולוגיות שבמרכזה תאי Purkinje להבחין בין המקרים ET לעומת פקדים, כולל מספר מופחת של תאי Purkinje, גדל רגרסיה דנדריטים וכן מגוון של שינויים עצב, מוביל אותנו בקביעתו Purkinje הזה ניוון תאים היא תכונה וחיסונים הליבה ET פתוגנזה10,11,12,13. פרופיל תעתיק שימש למחלות רבות נוירולוגיים לחקור את הבסיס המולקולרי שבבסיס של שינויים ניווניים הסלולר. עם זאת, פרופילים תעתיק מדגימות הטרוגנית, כגון אזורים רקמת המוח, ניתן לאשש להסוות את הביטוי של הפרוטוקולים שפע נמוכה ו/או לצמצם את הגילוי של השינויים המולקולריים המתרחשים רק אוכלוסיה קטנה של המושפע תאים, כגון תאי Purkinje בקליפת אסטרוציטומה. למשל, תאי Purkinje במידה רבה יותר על ידי תאים גרגר שופע בקליפת אסטרוציטומה מאת; 1:. כ 3000 לפיכך, למקד בצורה יעילה transcriptome שלהם דורשת בידוד ספציפי של נוירונים אלה. קליפת אסטרוציטומה תחום שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, גודל התא. ארכיטקטורה זו הסלולר הוא אידיאלי כדי לדמיין דגימת רקמה קפוא טרי ללא ריאגנטים מכתימים המכילים צבען. בתיאוריה, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם סוגים אחרים, רקמות כי יש רקמת הייחודי דומה בארגון.
פרוטוקול זה תוכנן לעבוד במיוחד עבור תאי Purkinje הדמיית המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן. פרוטוקולים רבים קיימות עבור הקיבעון, צביעת ויזואליזציה ושימור RNA סוגים רבים של רקמות למטרות של שני IR - ו UV-LCM. כשהוא מהרהר בעל עיצוב ניסיוני עבור UV-LCM, אנשים צריך להתאים נהלים שתתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים ואת הדרישות של להתחלה וסיום חומרים. כאן, אנו משלבים היבטים רבים של פרוטוקולים שונים LCM כדי לספק שיטה משופרת להמחשת תאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם ללא צורך לצבוע המכיל נוגדנים מכתימים להתכונן RNA באיכות גבוהה transcriptome . רצף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי יתרון זה מאפשר עבור האוסף של תאים cytologically או phenotypically רלוונטי או אזורים של רקמות heterogenous. המוצר שנתפסו ניתן להשתמש במגוון של שיטות מולקולריות חלבון, בידוד ה-DNA או RNA. אולם, שימור של RNA מרקמות המוח האנושי לאחר המוות הוא מאתגר במיוחד. טכניקות להדמיה סטנדרטי עבור הפונקציה LCM דורשים היסטולוגית או שגרות מכתימים immunohistochemical אשר יכול לקדם לבזות RNA. לכן, תיכננו פרוטוקול נירוסטה עבור הפריט החזותי LCM עם הייעוד של שמירה על תקינות RNA ברקמת המוח האנושי פוסט-מורטם. התא Purkinje של המוח הקטן הוא מועמד טוב ויזואליזציה אל חלד, עקב בגודל ובמיקום אופיינית. קליפת אסטרוציטומה יש שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, הפיכתם של ארכיטיפ טוב לזיהוי תחת בהגדלה מיקרוסקופית. תאי Purkinje הם נוירונים גדול ממוקם בין השכבה תא גרגר, שהינה רשת סלולרית בצפיפות של נוירונים קטן, השכבה המולקולרית, אשר הוא דליל בגוף התא. בגלל זה אדריכלות, השימוש של ויזואליזציה נירוסטה הוא ריאלי. מערכות אחרות איברים או תא המחקים פנוטיפ זה יהיה גם מתאים. פרוטוקול נירוסטה נועד לתקן רקמת קפוא טרי עם אתנול ולהסיר שומנים עם קסילן להמחשת מורפולוגי משופרת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה. פרוטוקול זה אינו חשבון בשביל שיטות קיבוע אחרות, היא תוכננה במיוחד עבור דגימות רקמה מוקפאות שנלכדה באמצעות של אולטרה סגול (UV)-מערכת LCM. כאן, אנו מציגים עבור חלוקתה ותיקון רקמות אנושיות אסטרוציטומה טריים קפואים פוסט-מורטם וטיהור של RNA מתאי Purkinje מבודדת על ידי UV-LCM, תוך שמירה על איכות ה-RNA עבור ה-RNA עוקבות-רצף פרוטוקול מלא. בידיים שלנו, פרוטוקול זה מייצר רמות יוצאות דופן של ויזואליזציה הסלולר ללא צורך מכתים ריאגנטים ותשואות RNA במספרים גבוהים RNA תקינות (≥8) לפי הצורך לניסויים פרופיל תעתיק.

פרוטוקול זה מפרט את השלבים להכנת רקמת המוח האנושי טריים קפואים פוסט-מורטם UV-LCM. מפרט יסודית וביאורים ניתנים לחיתוך cryostat, כפי שהוא יכול להיות קשה לחתוך את רקמת המוח קפוא טרי עם רמה גבוהה של דיוק. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון הוא כי רקמת קפוא טרי הוא קר מאוד ודורש כמות ...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

פרוטוקול זה משתמש בגישה העיניינים להמחיש, בידוד תאי Purkinje ברקמת קפוא טרי מן המח האנושי פוסט-מורטם באמצעות לייזר ללכוד microdissection. המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA.

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי, כי הוא משתמש בשיטת הדמיה ללא כתמים במקום הדמיה מבוססת צבע על רקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אשר מסייע לשמור על שלמות RNA. שימור RNA הוא יתרון גדול בפרוטוקול זה, כפי שהוא שימושי, לא רק ברקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אלא גם סוגים אחרים של רקמות, עם פעילות RNase גבוהה. כדי להתחיל, להסיר את הרקמה מהמקפיא ולהחיל אותו על קרח יבש להובלה ל cryostat.מניחים את המברשות הנקיות, הצ'אק והרקמות בהקפאה למשך 20 דקות לפחות, כדי לאפשר להם להגיע לטמפרטורה האופטימלית. עבור קריוסטאטים עם תאים כפולים וטמפרטורות מחזיקות דגימה, הגדר את טמפרטורת האובייקט למינוס 16 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת התא למינוס 18 מעלות צלזיוס. הגדר את עובי החלק של ההקפאה ל-14 מיקרומטר ואת עובי הקיצוץ ל-30 מיקרומטר.לאחר מכן, לנקות את הבמה עם תערובת של אחד לאחד של Decontaminator RNase ו 70% אתנול, כדי למנוע הקפאה. להשיג להב קריוסטט חדש, חד פעמי ולנקות אותו עם decontaminator RNase. מניחים את הלהב הנקי במחזיק הלהב על הבמה.לאחר מכן, לנקות את צלחת נגד רול עם Decontaminator RNase. חבר את הצלחת ניקה לבמה ולחכות לפחות 20 דקות עבור הלהב ואת צלחת נגד רול לרדת לטמפרטורה של קריוסטט. ראשית, לחתוך חתיכה קטנה של רקמה עבור חתך, לוודא כי החלק הוא כ 95% קליפת המוח הקטן.מחזירים את הרקמה הנותרת לקרח יבש, או למקפיא, במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התחילו לאט להוסיף OCT על גבי הצ'אק בהילוך איטי ועגול. לבנות שכבות של OTC עד שיש הר כשלושה מילימטרים גבוה מכסה את צ'אק.כאשר OCT קפוא חלקית, אבל עדיין יש קצת נוזל במרכז, מניחים את הרקמות על גבי ההר. תן לרקמה לשבת על גבי OCT במשך 1 עד 2 דקות עד שהוא קפוא לחלוטין. לאחר מכן, להעביר את צ'אק עם OCT קפוא ורקמות לזרוע חיתוך קריוסטט.התאימו את הרקמה כך שהיא תישטף עם להב החיתוך ותנו לרקמה לשבת בזרוע החיתוך במשך 20 דקות כדי להסתגל לטמפרטורה החדשה. הצעד הקריטי ביותר הוא לאפשר לרקמה להתאקלם בזרוע חיתוך ההקפאה כל עוד יש צורך. אם רקמות לגזרים, הדמיה של תא purkinje יהיה קשה מאוד.אני ממליץ להשתמש בפיסות רקמה קטנות ודקה יותר, כדי לאפשר לרקמה להתאקלם מהר יותר. לאחר מכן, לאט לאט להזיז את הרקמה קרוב יותר ללהב. ברגע שהרקמות הגיעו ללהב, התחילו בתהליך הקיצוץ.חותכים את הרקמה פעמיים עד שלוש פעמים, עד ששכבות קליפת המוח נראות לעין. לאחר מכן, מניחים ומיישרים את צלחת האנטי-רול ממש מעל להב ההקפאה. חותכים ארבעה עד שישה חלקים בעובי 14 מיקרומטר, ומצים כי חלקים חתוכים כראוי יהיו שטוחים מתחת לצלחת האנטי רול.יישר את המקטעים החתוכים אופקית לאורך שלב ההקפאה. זווית שקופית להרים את כל חתיכות הרקמה בו זמנית. מיד לאחר חתך הרקמה, מניחים את השקופית במחזיק השקופית עם 70% אתנול על הקרח במשך שתי דקות.העבר את השקופית למחזיק שקופית עם 95%אתנול על קרח למשך 45 שניות. לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם 100% אתנול בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. טובלים את השקופית שלוש פעמים במחזיק השקופית המכיל קסילן מספר אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם קסילן 2 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לעמוד את השקופיות למעלה ברדס אדים נקי ולתת להם אוויר יבש לפחות 30 דקות. אם מאחסנים את השקופיות, מניחים כל אחד לתוך צינור נפרד 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות לתוך מקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שבעה ימים.ראשית, השתמשו במפרק RNase לניקוי שלב המיקרוסקופ וזרוע איסוף הכובעים. עם ידיים כפפות, מניחים את המגלשה על המיקרוסקופ וכובע אטום 500 מיקרוליטר בזרוע האיסוף. בהגדלה נמוכה, ליישר את הכובע אטום על הרקמה המוחית, לסמוך על כך הכובע מכסה את האזור כולו כי הוא דמיינו את פיסת העין.השתמש במטרה חמש פעמים עד 10 פעמים כדי לדמיין את השכבות המוח הקטן. מקם את הסמן מעל המקטע שבו שכבה מולקולרית ושכבת תא גרנית מצטלבים. עבור להגדלה של פי 40 והדמי את תאי הפורקיניה.לאחר מכן, להתחיל ללכוד אותם. כדי להתחיל באיסוף RNA לאחר המיקרו-דיסקטמנט, הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר תותבת התא למכסה אטום כשהכובע פונה כלפי מעלה. סגור בזהירות את הצינור מעל המכסה והמשך עם האוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט.בפרוטוקול זה, טרי, קפוא, לאחר המוות, רקמת המוח האנושית מוכנה למיקרו-דיסקטקט לכידת לייזר UV. לאחר הניתוק של cryostat בזמן הציור המוקצב, השכבות התאיות של המוח הקטן נראות בקלות עם חמש פעמים ו 10 פעמים עדשות אובייקטיביות. כפי שניתן לראות כאן, דגירה קסילן נכונה גורמת לרקמה להיות כהה יותר ומתואם טוב יותר שכבות הסלולר מאשר אתנול לבד.בעת חיתוך במיקרוסקופ לכידת לייזר, העדשה אובייקטיבית 40 פעמים נדרש כדי להבטיח לכידת רק תאים purkinje ולא הרקמה שמסביב. כפי שניתן לראות כאן, הדגירה הנכונה בקסילן מייצרת תמונה איכותית ללא פגע מורפולוגית בהשוואה ל קיבוע אתנול בלבד. יכולת החלקת הכיסוי של כובע אטום נבדקת לאחר מכן בעוד פרוטוקולים אחרים משתמשים בכובע מלא בנוזלים, כובעים אלה יכולים להפחית את הדמיית הרקמות ולגרום לתמונה המתקבלת להיות גרגירית וססגונית מתחת למיקרוסקופ.עם זאת, הדמיה באמצעות כובע אטום גורמת למראה הרקמה החלקה כי הוא רך וחד יותר בצורה. תמונות מייצגות של תאי purkinje excised בהפקת כוח נמוך ובעוצמה גבוהה להראות הסרה מדויקת של רק את גוף התא purkinje. לאחר מכן, Rnase באיכות גבוהה מתקבל עבור רצף RNA הבאים.שש דגימות מייצגות עברו מיצוי RNA ונוסו מחדש ב-14 מיקרוליטרים של מים נטולי Rnase וכל שש הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם מספרי תקינות RNA השווים או גדולים משמונה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי איכות הרקמות היא הכל. אפילו חיתוך ומיקום שקופית יעשו או ישברו פרוטוקול זה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כל שיטה החוקרת RNA או DNA, במיוחד אנו בודקים את ה- RNA שלנו לביטוי גנים דיפרנציאלי, אך שאלות אחרות לגבי ויסות גנים יכולות להיחקר גם כן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג רקמה שיש לו מורפולוגיה ספציפית קווית שאינה דורשת שימוש באנטיגן או בריאגנטים ספציפיים לצבוע לזיהוי תאים מעניינים. אנו מקווים כי טכניקה זו תעזור לנו להבין את הגנטיקה של רעד חיוני ומחלות אחרות שיש להם פנוטיפ רעד.הכימיקל המסוכן ביותר המשמש בפרוטוקול זה הוא קסילן. זה צריך להיות מטופל כראוי ברדס אדים, להיפטר כראוי, שקופיות צריך להיות מותר להתייבש כראוי עד לשימוש בשטח פתוח. בנוסף, בעת עבודה עם דגימות אנושיות, ניהול פסולת biohazardous, ובטיחות יש לנצל.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...