Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Gli autori desidera ringraziare la New York Brain Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel e Dr. Etty Cortés, per la loro assistenza in taglio e conservare i campioni di tessuto di cervello umano congelato per questi esperimenti. Gli autori desidera ringraziare gli individui che hanno generosamente donato il loro cervello per la continua ricerca nel tremore essenziale. Dr. Faust e Dr. Martuscello desidera ringraziare Columbia University Dipartimento di patologia e biologia delle cellule per il loro continuo supporto e spazio di ricerca di base. Gli autori desidera ringraziare NIH R01 NS088257 Louis/Faust) finanziamenti per la ricerca per questo progetto. Immagini di LCM sono stati effettuati nel confocale e specializzata di microscopia Shared Resource di Herbert Irving Comprehensive Cancer Center presso la Columbia University, supportato da NIH concedere #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Gli autori desidera ringraziare Theresa Swayne e Laura Munteanu per la loro assistenza continuata con microscopia specializzata.

Tutti i campioni umani utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti con il consenso informato e sono stati approvati da interno Review Board (IRB) alla Columbia University e Università di Yale.
Nota: La totalità del presente protocollo deve seguire RNA rigoroso gestione delle linee guida, per cui una mano guantata viene sempre utilizzata, tutte le superfici vengono pulite con una decontaminazione di RNAsi e tutti i materiali di lavoro sono RNA/DNA/nucleasi gratis....

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Il protocollo presentato qui è specificamente modificato per essere un approccio inox nel visualizzare tessuti morfologicamente distinte per UV-LCM. Questo metodo è progettato per massimizzare l'integrità di RNA per successivo sequenziamento diretto di RNA, pur mantenendo un livello avanzato di visualizzazione del tessuto. La capacità di distinguere diversi tipi di cellule per la cattura, per creare la popolazione più pura delle cellule possibili, è essenziale per la comprensione di diversi profili molecolari in te...

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento di ricerca di valore che consente la separazione delle cellule patologicamente rilevanti per la valutazione molecolare guidata successiva. L'uso delle analisi molecolari in questi campioni di tessuto eterogeneo e la correlazione con dati clinici e patologici è un passo necessario nel valutare l'importanza traslazionale della ricerca biologica1. Quando si analizzano i dati di espressione genica da RNA, l'uso di sezioni di tessuto congelato è altamente consigliato in quanto consente di eccellente qualità di RNA così come ingrandita quantità2. È stata ben stabilita che alta qualità e la quantità di RNA sono essenziali per dati significativi da RNA sequenza3. Tuttavia, quando si utilizza RNA dal tessuto fresco congelato post mortem per LCM, degradazione del RNA è una sfida importante, come si verifica immediatamente dopo la morte e la sua estensione è mediata da vari fattori connessi con il tessuto collezione metodo4,5 . Inoltre, degradazione del RNA è aggravata quando tecniche di colorazione sono necessari per riconoscere dettagli istologici e l'identificazione delle cellule. Specializzata macchiatura tecniche come l'ematossilina ed eosina, di Nissl, immunofluorescenza e immunoistochimica sono utili nella differenziazione delle cellule dallo stroma circostante ma hanno dimostrati di degradare il mRNA e alterare l'espressione di trascrizione profili6. Di conseguenza, il nostro laboratorio ha creato un protocollo inox specificamente progettato per preservare il RNA in cervelletto umano post mortem ai fini del sequenziamento di RNA dopo l'isolamento di LCM di neuroni di Purkinje.
Nell'elaborazione di tessuto congelato fresco per LCM, il metodo di fissazione variabilmente può influenzare l'integrità del tessuto e del RNA. Fissazione in formalina è standard per conservazione morfologica, ma cause cross-linking che possono frammentare RNA e interferire con l'amplificazione di RNA7. Fissazione dell'etanolo è un'alternativa migliore per l'isolamento di RNA, come è un fissativo coagulante che non induce la reticolazione1. Per migliorare la visualizzazione della morfologia del tessuto, xilene è la scelta migliore, in quanto rimuove i lipidi dal tessuto. Tuttavia, ci sono note alcune limitazioni quando si utilizza xilene in LCM, come i tessuti possono asciugarsi e diventare fragili che causano frammentazione del tessuto su laser capture7. Xilene è anche una tossina volatile e deve essere gestito correttamente in una cappa aspirante. Tuttavia, xilene è stato indicato per migliorare la visualizzazione del tessuto preservando anche RNA integrità8. Di conseguenza, il nostro protocollo centri intorno all'uso della fissazione dell'etanolo 70% ed etanolo disidratazione, seguita da incubazione di xilene per chiarezza morfologica.
È importante notare i diversi tipi di sistemi basati sul laser microdissection, come essi hanno dimostrati di differiscono in velocità, precisione e qualità di RNA. Il laser infrarosso (IR) capture microdissection e i sistemi di raggi ultravioletti (UV) laser microbeam microdissection erano entrambe le piattaforme LCM romanzo emerse quasi contemporaneamente8. Il sistema IR-LCM si avvale di un "sistema di contatto" utilizzando una pellicola termoplastica trasparente collocata direttamente sulla sezione di tessuto, e celle di interesse selettivamente aderiscano la pellicola da impulsi focalizzati da un laser a infrarossi. In alternativa, il sistema UV-LCM è un sistema"senza contatto", per cui un raggio laser focalizzato taglia via le cellule o le regioni di interesse nel tessuto; a seconda della configurazione in due piattaforme commerciali attualmente disponibili che utilizzano entrambi un design microscopio invertito o in posizione verticale, tessuto viene acquisito in un dispositivo di raccolta da un'onda di pressione indotta da laser che si catapulta contro la gravità o il tessuto è raccolti dalla forza di gravità, rispettivamente. Vantaggi del sistema UV-LCM includono acquisizione delle cellule più veloce, privo di contaminazione insieme con l'approccio di non-contatto e più precisa dissezione dovuto un molto più piccolo laser fascio diametro9. Questo protocollo è stato specificamente progettato per un sistema UV-LCM e non è stato testato in un sistema di IR-LCM. Nella progettazione di sistema o UV-LCM, quando cellule accumula nella PAC raccolta, l'uso di un vetrino coprioggetto che migliora la chiarezza cellulare durante la microscopia non è adatto, come le cellule sarebbe in grado di entrare nella PAC collezione. Di conseguenza, per migliorare la visualizzazione del tessuto, abbiamo testato l'uso di tappi insieme opaco, che sono progettati per fungere da un vetrino coprioggetto per visualizzazione microscopica in sistemi UV-LCM, contro tappi di raccolta del liquido riempito. Tappi di raccolta del liquido riempito possono essere difficile, come il liquido è soggetta a evaporazione e dovrà essere sostituito frequentemente mentre si lavora al microscopio. Tempo diventa un fattore importante per la stabilità del RNA, mentre il tessuto catturato si dissolve immediatamente7.
Il nostro laboratorio studia i cambiamenti neuropathologic post mortem nel cervelletto dei pazienti con tremore essenziale (ET) e disordini neurodegenerative correlate del cervelletto. Abbiamo dimostrato i cambiamenti morfologici centrati sulle cellule di Purkinje che distinguono ET casi contro i comandi, tra cui un numero ridotto di cellule di Purkinje, aumentato dendritiche regressione e una varietà di cambiamenti axonal, che ci porta a postulare che Purkinje degenerazione delle cellule è una caratteristica biologica di core ET patogenesi10,11,12,13. Profiling trascrizionale è stato utilizzato in molte malattie neurologiche per esplorare la base molecolare sottostante dei cambiamenti cellulari degeneranti. Tuttavia, profili trascrizionali da campioni eterogenei, quali regioni del tessuto di cervello, efficacemente possono mascherare l'espressione delle trascrizioni di abbondanza bassa e/o diminuire la rilevazione dei cambiamenti molecolari che si verificano solo in una piccola popolazione di interessati cellule, come le cellule di Purkinje nella corteccia cerebellare. Per esempio, cellule di Purkinje sono grave inferiorità numerica da parte delle cellule del granello abbondante nella corteccia cerebellare di circa 1: 3000; così, efficacemente destinazione loro transcriptome richiede l'isolamento specifico di questi neuroni. La corteccia cerebellare è delineata da strati distinti che differiscono nella densità delle cellule e la dimensione della cella. Questa architettura cellulare è ideale per visualizzare in un campione di tessuto fresco congelato senza tintura-contenente i reagenti di colorazione. In teoria, questo protocollo potrebbe essere applicato anche ad altri tipi di tessuto che hanno tessuto distintivo simile organizzazione.
Questo protocollo è stato progettato per lavorare in modo specifico per la visualizzazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem. Esistono numerosi protocolli per la fissazione, colorazione, visualizzazione e conservazione di RNA di molti tipi di tessuti ai fini di entrambi LCM IR e UV. Quando contemplando un disegno sperimentale per UV-LCM, gli individui dovrebbero adattare loro protocollo per adattarsi al meglio le esigenze e i requisiti di inizio e fine di materiali. Qui, uniamo molti aspetti dei diversi protocolli di LCM per fornire un metodo avanzato per la visualizzazione di cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem senza dover preparare il RNA di alta qualità per il trascrittoma di colorante contenente i reagenti di colorazione sequenziamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento vantaggioso che consente la raccolta di cellule citologicamente e/o fenotipico pertinenti o regioni da tessuti eterogenei. Prodotto acquisito può essere utilizzato in una varietà di metodi molecolari per le proteine, DNA o RNA isolamento. Tuttavia, la conservazione di RNA dal tessuto post mortem del cervello umano è particolarmente impegnativi. Tecniche di visualizzazione standard per LCM richiedono istologico o procedure di macchiatura immunohistochemical che possono ulteriormente degradano il mRNA. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo inox per visualizzazione in LCM con lo scopo di preservare l'integrità di RNA nel tessuto cerebrale umano post mortem. Delle cellule di Purkinje del cervelletto è un buon candidato per la visualizzazione di acciaio inox, grazie alla sua dimensione e la posizione caratteristica. La corteccia cerebellare ha livelli distinti che differiscono nella densità delle cellule, che li rende un buono archetipo per identificare al microscopio ad alto ingrandimento. Cellule di Purkinje sono grandi neuroni situati tra lo strato delle cellule del granello, che è una rete densamente cellulare dei neuroni piccoli, e lo strato molecolare, che è sparso in corpi cellulari. A causa di questa architettura, l'utilizzo di acciaio inox visualizzazione è fattibile. Altri sistemi dell'organo o cellula che imitano questo fenotipo sarebbe anche adatti. Il protocollo di acciaio inossidabile è progettato per fissare il tessuto fresco congelato con etanolo e rimuovere i lipidi con xilene per migliorare la visualizzazione morfologica nell'ambito di microscopia ad alto ingrandimento. Questo protocollo non tiene conto di altri metodi di fissazione ed è specificamente progettato per campioni di tessuto fresco congelato acquisiti utilizzando un ultravioletto (UV)-sistema di LCM. Qui, presentiamo un protocollo completo per sezionamento e fissare tessuto cerebellare umano fresco congelato post mortem e purificazione di RNA da cellule di Purkinje isolate di UV-LCM, preservando la qualità di RNA per RNA-ordinamento successivo. Nelle nostre mani, questo protocollo produce eccezionali livelli di visualizzazione cellulare senza la necessità di reagenti di colorazione e produce RNA con alti numeri di integrità di RNA (≥ 8) come necessario per gli esperimenti di profilatura trascrizionali.

Questo protocollo dettaglia i passaggi per la preparazione del tessuto di cervello umano fresco congelato post mortem per UV-LCM. Le annotazioni e le specifiche approfondite sono riportate per il taglio di criostato, come può essere difficile da tagliare del tessuto di cervello congelato fresco con un elevato grado di precisione. Il punto più importante da considerare è che il tessuto congelato fresco è estremamente freddo e richiede una notevole quantità di tempo per ambientarsi all...

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A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Questo protocollo utilizza un approccio privo di mordente di visualizzare e di isolare le cellule di Purkinje nel tessuto fresco congelato dal cervelletto umano post mortem tramite laser capture microdissection. Lo scopo del presente protocollo è quello di generare una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza di RNA.

Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Questo protocollo è significativo, perché utilizza un metodo di visualizzazione privo di macchie invece di una visualizzazione basata sulla tintura sul tessuto cerebrale umano post-mortem, che aiuta a preservare l'integrità dell'RNA. La conservazione dell'RNA è un grande vantaggio in questo protocollo, in quanto è utile, non solo nel tessuto cerebrale umano post-mortem, ma anche in altri tipi di tessuti, con alta attività RNasi. Per iniziare, rimuovere il tessuto dal congelatore e posizionarlo sul ghiaccio secco per il trasporto al criostato.Posizionare i pennelli puliti, il mandrino e il tessuto nel criostato per almeno 20 minuti, per consentire loro di raggiungere la temperatura ottimale. Per i criostatici con camere doppie e temperature di tenuta del campione, impostare la temperatura dell'oggetto su meno 16 gradi Celsius e la temperatura della camera a meno 18 gradi Celsius. Impostare lo spessore della sezione del criostato su 14 micrometri e lo spessore dell'assetto a 30 micrometri.Quindi, pulire il palco con una miscela uno-a-uno di decontaminatore di RNasi e 70% di etanolo, per evitare il congelamento. Ottenere una nuova lama criostatica usa e getta e pulirla con decontaminatore RNase. Posizionare la lama pulita nel supporto della lama sul palco.Quindi, pulire la piastra antirollio con il decontaminatore RNase. Attaccare la piastra pulita al palco e attendere almeno 20 minuti che la lama e la piastra antirollio si aggireranno alla temperatura del criostato. In primo luogo, tagliare un piccolo pezzo di tessuto per la sessatura, assicurandosi che la sezione sia circa il 95% della corteccia cerebellare.Riportare il tessuto rimanente a ghiaccio secco, o a in un congelatore, a meno 80 gradi Celsius. Quindi, iniziare lentamente ad aggiungere lo Strumento di personalizzazione di Office sopra il mandrino con un movimento lento e circolare. Costruisci strati di OTC fino a quando non c'è un supporto alto circa tre millimetri che copre il mandrino.Quando lo Strumento di personalizzazione di Office è parzialmente congelato, ma ha ancora del liquido al centro, posizionare i tessuti sopra il supporto. Lasciare riposare il tessuto sopra lo Strumento di personalizzazione di Office per uno o due minuti fino a quando non è completamente congelato. Quindi, trasferire il mandrino con l'OCT congelato e il tessuto nel braccio di taglio del criostato.Regolare il tessuto in modo che sia a filo con la lama da taglio e lasciare riposare il tessuto nel braccio di taglio per 20 minuti per adattarsi alla nuova temperatura. Il passaggio più critico è consentire al tessuto di acclimatarsi nel braccio di taglio del criostato per tutto il tempo necessario. Se i tessuti si distruggono, la visualizzazione delle cellule purkinje sarà molto difficile.Consiglio di utilizzare pezzi di tessuto più piccoli e sottili, per consentire al tessuto di acclimatarsi più velocemente. Dopo questo, spostare lentamente il tessuto più vicino alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, iniziare il processo di taglio.Tagliare il tessuto da due a tre volte, fino a quando gli strati della corteccia sono visibili. Quindi, posizionare e allineare la piastra antirollio appena sopra la lama del criostato. Tagliare da quattro a sei sezioni dello spessore di 14 micrometri, notando che le sezioni correttamente tagliate saranno piatte sotto la piastra antirollio.Allineare le sezioni tagliate orizzontalmente attraverso lo stadio criostato. Inclinare una diapositiva per raccogliere tutti i pezzi di tessuto contemporaneamente. Subito dopo aver sessato il tessuto, posizionare lo scivolo nel supporto dello scivolo con il 70% di etanolo sul ghiaccio per due minuti.Trasferire lo scivolo su un supporto scorrevole con 95% di etanolo sul ghiaccio per 45 secondi. Quindi, posizionare lo scivolo nel supporto scorrevole con 100% di etanolo a temperatura ambiente per due minuti. Immergere lo scivolo tre volte nel porta scorrevole contenente xilene numero uno a temperatura ambiente.Quindi, posizionare lo scivolo nel porta scorrevole con xilene due a temperatura ambiente per cinque minuti. Metti gli scivoli in una cappa pulita e lasciali asciugare all'aria per almeno 30 minuti. Se si conservano i vetrini, posizionare ciascuno in un tubo separato da 50 millilitri e posizionare i tubi in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per un massimo di sette giorni.In primo luogo, utilizzare il decontaminatore RNase per pulire lo stadio del microscopio e il braccio di raccolta del cappuccio. Con le mani guantate, posizionare lo scivolo al microscopio e un cappuccio opaco da 500 microliter nel braccio di raccolta. A basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco sul tessuto cerebellare, assicurando che il cappuccio copra l'intera area che viene visualizzato nell'oculare.Usa un obiettivo da cinque a 10 volte per visualizzare gli strati cerebellari. Posizionare il cursore sulla sezione in cui lo strato molecolare e lo strato di cellule granuali si intersecano. Passare a un ingrandimento 40 volte superiore e visualizzare le celle purkinje.Quindi, inizia a catturarli. Per iniziare la raccolta dell'RNA dopo la microdisezione, aggiungere 50 microlitri di tampone dilisi cellulare al cappuccio opaco con il cappuccio rivolto verso l'alto. Chiudere attentamente il tubo sopra il cappuccio e procedere con la raccolta come delineato nel protocollo di testo.In questo protocollo, fresco, congelato, post mortem, il tessuto cerebrale umano è preparato per la microdisezione di cattura laser UV. Dopo la sezione del criostato nel tempo di disegno assegnato, gli strati cellulari del cervelletto sono facilmente visibili con lenti cinque volte e 10 volte obiettive. Come visto qui, una corretta incubazione di xilene fa sì che il tessuto diventi più scuro e delinea meglio gli strati cellulari rispetto all'etanolo da solo.Quando si taglia al microscopio di cattura laser, l'obiettivo 40 volte è necessario per garantire la cattura solo delle cellule purkinje e non del tessuto circostante. Come si vede qui, una corretta incubazione in xilene produce un'immagine morfologicamente intatta di alta qualità rispetto alla sola fissazione dell'etanolo. La capacità di slittamento della copertura di un cappuccio opaco viene quindi testata mentre altri protocolli utilizzano un cappuccio riempito di liquido, questi tappi possono ridurre la visualizzazione dei tessuti e causare la granularità e l'iridescenza dell'immagine risultante al microscopio.Tuttavia, la visualizzazione attraverso un cappuccio opaco si traduce nell'aspetto del tessuto levigato che è più morbido e più nitido nella forma. Immagini rappresentative delle cellule purkinje accisa a bassa potenza e ad alta potenza mostrano una rimozione precisa solo del corpo cellulare purkinje. Dopo questo, l'Rnase di alta qualità viene ottenuto per il successivo sequenziamento dell'RNA.Sei campioni rappresentativi sono stati sottoposti a estrazione di RNA e sono stati rimescolati in 14 microlitri di acqua priva di Rnase e tutti e sei i campioni hanno prodotto RNA di alta qualità con numeri di integrità dell'RNA pari o superiore a otto. La cosa più importante da ricordare è che la qualità dei tessuti è tutto. Anche il taglio e il posizionamento delle diapositive faranno o infrangeranno questo protocollo.Seguendo questa procedura, qualsiasi metodo che indaghi sull'RNA o sul DNA potrebbe essere eseguito, in particolare sondiamo il nostro RNA per l'espressione genica differenziale, ma potrebbero essere studiate anche altre domande riguardanti la regolazione genica. Questo metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi tipo di tessuto che abbia una morfologia specifica delineata che non richieda l'uso di antigeni o reagenti specifici del colorante per l'identificazione di cellule di interesse. Speriamo che questa tecnica ci aiuti a comprendere la genetica del tremore essenziale e di altre malattie che hanno un fenotipo del tremore.La sostanza chimica più pericolosa utilizzata in questo protocollo è lo xilene. Deve essere maneggiato correttamente in una cappa aspirante, smaltito correttamente e gli scivoli devono essere autorizzati ad asciugarsi adeguatamente fino a quando non vengono utilizzati in uno spazio aperto. Inoltre, quando si lavora con campioni umani, è necessario utilizzare la gestione dei rifiuti pericolosi e la sicurezza.

Research

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Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

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