Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

저자 절단 고이 실험에 대 한 냉동된 인간의 뇌 조직 샘플에서 그들의 지원에 대 한 박사 장 폴 Vonsattel와 박사 Etty 코르테스, 뉴욕 두뇌 은행을 인정 하 고 싶습니다. 저자 진전으로 지속적인 연구에 대 한 그들의 두뇌를 아낌없이 기부 하는 개인을 인정 하 고 싶습니다. 닥터 파우스트와 박사 Martuscello 그들의 지속적인된 지원 및 핵심 연구 공간에 대 한 컬럼비아 대학 학과 병리학 및 세포 생물학을 인정 하 고 싶습니다. 저자 NIH R01 NS088257 루이/파우스트를 인정 하 고 싶습니다)이이 프로젝트에 대 한 연구 자금에 대 한. LCM 이미지는 Confocal에서 수행 하 고 전문 현미경 공유 리소스 컬럼비아 대학, NIH에서 지원에서 허버트 어 빙 종합 암 센터의 #P30 CA013696를 부여 (국립 암 연구소). 저자 특수 현미경으로 그들의 지속적인된 지원에 대 한 테레사 Swayne로 라 Munteanu를 인정 하 고 싶습니다.

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 인간의 샘플 동의를 얻은 고 컬럼비아 대학과 예일 대학에서 내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.
참고: 이 프로토콜의 전체 처리 지침, 엄격한 RNA를 따라야 한다 그것에 의하여 gloved 손을 항상 사용, 모든 서피스는 RNase decontaminator로 청소는 모든 작동 물질이 RNA/DNA/Nuclease 무료.
1. 시작 LCM 이전 조직의...

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여기에 제시 된 프로토콜 특히 UV LCM에 대 한 시각화 하는 형태학 상으로 다른 조직에 스테인리스 접근 하도록 수정 됩니다. 이 메서드는 후속 직접 RNA 시퀀싱, 조직 시각화의 향상 된 수준을 유지 하면서 RNA 무결성을 최대화 하기 위해 설계 되었습니다. 가능한, 셀의 순수한 인구를 만드는 캡처, 다른 세포 유형 구별 하는 기능 이해 하는 인간의 조직15다른 분자 프로 파일에 대 한 ...

레이저 캡처 기정 (LCM)는 후속 분자로 제어 평가 대 한 병 적 관련 세포의 분리 수 있습니다 귀중 한 연구 도구입니다. 이러한 다른 유형의 조직 표본 및 병리학 및 임상 데이터와 상관 관계에 분자 분석의 사용 생물 학적 연구1의 변환의 평가에 필요한 단계입니다. RNA 유전자 표현 데이터를 분석할 때 언된 조직 단면도의 사용이 좋습니다 RNA의 우수한 품질에 대 한 수 뿐 아니라 수량2최대화. 그것은 잘 설립 되었습니다 높은 품질과 수량 RNA의 RNA 시퀀싱3에서 의미 있는 데이터에 대 한 필수적입니다. 그러나, LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 조직에서 RNA를 사용 하 여 때 RNA 강 직은 주요 도전, 죽음에 즉시 발생 하 고 그 범위는 조직의 컬렉션 방법4,5와 관련 된 다양 한 요인에 의해 중재 . 또한, RNA 저하 얼룩 기법 인식 더 세부 사항 및 셀 식별 하는 데 필요한 때 악화 됩니다. 전문 기술 되며 & 오신, Nissl 얼룩, 얼룩 면역 형광 및 immunohistochemistry 주변 기질에서 세포를 차별화 하는 데 도움이 하지만 RNA 저하 고 사본 식 변경 표시 되었습니다. 프로필6. 따라서, 우리의 실험실 스테인리스 프로토콜 Purkinje 신경의 LCM 격리 후 RNA 시퀀싱의 목적에 대 한 사후 인간 소 뇌에 RNA를 보존 하기 위해 특별히 만들었습니다.
LCM에 대 한 신선한 냉동된 조직 처리, 고정 방법 변함없이 RNA와 조직의 무결성을 발생할 수 있습니다. 포 르 말린 고정 형태 보존을 위한 표준 이지만 원인 있는 cross-linking RNA 수 있습니다 그리고 RNA 증폭7방해. 그것은 상호1을 유도 하지 않는 coagulative 정착 액 에탄올 고정 RNA 격리에 대 한 더 나은 대안입니다. 조직 형태학의 시각화를 향상 시키기 위해, 크 실 렌은 조직에서 지질 제거로 최고의 선택 이다. 그러나, 조직 수 밖으로 건조 하 고 레이저 캡처7시 취 일으키는 조직 조각화 되 LCM, 자일 렌을 활용 하면 제한 알려져 있습니다. 크 실 렌은 또한 휘발성 독 소 하 고 증기 두건에서 제대로 처리 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 크 실 렌은 또한 RNA 무결성8을 유지 하면서 조직 시각화를 향상을 보였다. 따라서, 우리의 프로토콜 70% 에탄올 고정 및 에탄올 탈수, 크 실 렌 외피 형태학 선명도 대 한 다음의 사용 주위 센터.
그것은 그들은 속도, 정밀도, 및 RNA 품질 표시 되었습니다로 서 레이저 기반 시스템의 종류를 주의 하는 것이 중요. 적외선 (IR) 레이저 캡쳐 서 자외선 (UV) 레이저 microbeam 기정 시스템8을 거의 동시에 등장 하는 두 소설 LCM 플랫폼을 했다. IR-LCM 시스템 사용 조직 섹션에 투명 열가 소성 필름을 사용 하 여 "연락처 시스템" 그리고 관심사의 세포 선택적으로 준수 영화 집중된 펄스에 의해 IR 레이저에서. 또는, UV LCM 시스템은 세포 또는 조직;에 대 한 관심의 영역이 그것에 의하여 초점된 레이저 빔을 멀리 인하 "비 접촉 시스템" 거꾸로 또는 똑바로 현미경 디자인 중 하나를 사용 하는 두 현재 사용 가능한 상용 플랫폼에서 구성에 따라 조직 중력에 대 한 투 석기는 레이저 유도 압력 파에 의해 수집 장치로 인수 또는 조직 중력에 의해 각각 수집. UV LCM 시스템의 중요 한 장점 빠른 세포 수집, 비 접촉 방식 및 많은 더 작은 레이저 빔 직경9인 더 정확한 해 부 오염 무료 컬렉션을 포함합니다. 이 프로토콜은 UV LCM 시스템을 위해 설계 된 고 IR LCM 시스템에서 테스트 되지 않았습니다. 어느 UV LCM 시스템 설계에 컬렉션 모자에 축적 셀는 coverslip의 사용을 향상 하는 때 현미경 중 세포 선명도가 아니다 적합, 셀 컬렉션 모자에 입력 수 없습니다. 따라서, 조직 시각화를 향상 시키기 위해, 액체 채워진된 컬렉션 모자에 대 한 UV LCM 시스템에 미세한 시각화 coverslip로 행동 하도록 설계 된 불투명 컬렉션 모자를 사용 하 여 테스트 했습니다. 액체는 증발 하 고 현미경에서 작업 하는 동안 자주 교체 해야 합니다 액체 채워진된 컬렉션 모자, 도전적 일 수 있다. 캡처된 조직을 녹이 고 즉시7시간 RNA 안정성에 대 한 중요 한 요소가 된다.
우리의 실험실 연구 진전 (동부)을 가진 환자의 소 뇌 및 소 뇌의 신경 관련된 질환에 사후 neuropathologic 변경 합니다. 우리는 시연 대 컨트롤, Purkinje 세포의 감소 된 수를 포함 하 여 동부 표준시 경우를 구별 하는 Purkinje 셀에 중심 형태 론 적 변화 증가 수지상 회귀 및 axonal 변화의 다양 한 공준을 선도 그 Purkinje 세포 변성은 외 병10,11,,1213에 핵심 생물 학적 기능입니다. Transcriptional 프로 파일링은 세포 퇴행 성 변화의 기본 분자 단위로 탐구에 많은 신경학 상 질병에 사용 되었습니다. 그러나, 뇌 조직 영역 같은 다른 유형의 샘플에서 transcriptional 프로필 수 effectually 낮은 풍부 성적 표현의 마스크 또는 감소의 영향을 받는 작은 인구에서 서만 발생 하는 분자 변화 감지 소 뇌 피 질에서 Purkinje 세포와 같은 세포. 예를 들어, Purkinje 세포는 훨씬 숫 적 소 뇌 피 질에 풍부한과 립 세포에 의해 약 1:3000; 따라서, 효과적으로 대상에 자신의 transcriptome 이러한 뉴런의 특정 격리가 필요합니다. 소 뇌 피 질 세포 밀도 및 셀 크기 고유 층에 의해 구분 된입니다. 이 세포질 건축 착 색 시 약 염료를 포함 하지 않고 신선한 냉동 조직 샘플에서 시각화 이상적입니다. 이론적으로,이 프로토콜 또한에 적용할 수 있는 비슷한 독특한 조직 다른 조직 유형 조직.
이 프로토콜은 인간의 사후 소 뇌의 Purkinje 세포 시각화를 위해 특별히 작동 하도록 설계 되었습니다. 수많은 프로토콜 고정, 시각화 및 조직의 많은 종류의 RNA 보존 목적의 두 IR-와 UV-LCM에 대 한 얼룩을 위한 존재 한다. UV LCM에 대 한 실험 설계를 고민 하는 경우 개인 필요와 시작 및 끝 재료의 요구 사항에 가장 적합 하 그들의 프로토콜에 맞게 해야 합니다. 여기, 우리가 transcriptome 수준 높은 RNA 준비 착 색 시 약을 포함 하는 염료의 필요 없이 사후 인간의 뇌에서 Purkinje 세포를 시각화에 대 한 향상 된 방법을 제공 하기 위해 다른 LCM 프로토콜의 여러 측면을 결합 시퀀싱.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

레이저 캡처 기정 (LCM) cytologically 또는 phenotypically 관련 셀 또는 이기종 조직에서 영역에 대 한 수 있는 유리한 도구입니다. 캡처된 사용할 수 있습니다 다양 한 단백질, 분자 방법에에서 DNA 또는 RNA 격리. 그러나, 인간의 사후 뇌 조직에서 RNA의 보존은 특히 도전적 이다. LCM에 대 한 표준 시각화 기술을 더 또는 추가 수 immunohistochemical 얼룩 절차 RNA 저하 됩니다. 따라서, 우리는 사후 뇌 조직에서 RNA 무결성을 보존 하기의 용도와 LCM에 시각화를 위한 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 소 뇌의 Purkinje 세포 크기 및 특성 위치 스테인리스 시각화에 대 한 좋은 후보입니다. 소 뇌 피 질의 세포 밀도, 그들 고배율 현미경에서 식별 하는 좋은 상을 만드는 다른 독특한 레이어 있다. Purkinje 세포는 큰 신경 작은 신경의 밀도가 셀룰러 네트워크는과 립 세포 레이어 및 셀 시체에 스파스는 분자 층 사이 위치. 이 건축 때문에 스테인레스 시각화의 사용은 가능 합니다. 이 표현 형을 모방 하는 다른 기관 또는 셀 시스템도 적합 한 것입니다. 에탄올과 신선한 냉동 조직 수정 하 고 높은 확대 가벼운 현미경 검사 법에서 향상 된 형태학 시각화를 위한 크 실 렌과 지질 제거 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 이 프로토콜 다른 고정 방법을 고려 하지 않습니다 하 고 자외선 (UV)를 사용 하 여 캡처한 신선한 냉동 조직 샘플에 대 한 특별히 설계 된-LCM 시스템. 여기, 선물이 단면화 및 후속 RNA 시퀀싱에 대 한 RNA 품질을 유지 하면서 UV LCM에 의해 분리 하는 Purkinje 세포에서 신선한 냉동된 사후 인간 소 뇌 조직 및 RNA의 정화를 해결에 대 한 전체 프로토콜. 우리의 손에이 프로토콜 착 색 시 약을 위한 필요 없이 세포 시각화의 뛰어난 수준을 생산 하 고 transcriptional 프로 파일링 실험에 대 한 필요에 따라 높은 RNA 무결성 번호 (≥8)와 RNA를 생성 합니다.

이 프로토콜 UV LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 뇌 조직 준비 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 철저 한 사양 및 주석 받는다 cryostat 절단, 정밀도의 고차를 가진 신선한 냉동된 뇌 조직을 절단 하는 것이 어려울 수 있습니다 대로. 고려해 야 할 가장 중요 한 포인트가입니다 신선한 냉동된 조직 매우 추운 이며 상당한은 cryostat의 따뜻한 온도에 적응 하는 시간이 필요 합니다....

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A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

이 프로토콜 얼룩 없는 접근을 사용 하 여 시각화 하 고 레이저 캡처 서 통해 인간의 사후 뇌에서 신선한-냉동 조직에서 Purkinje 세포를 분리. 이 프로토콜의 목적은 RNA 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 생성 하는 것입니다.

레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

이 프로토콜은 RNA 무결성을 보존하는 데 도움이 되는 사후 인간 뇌 조직에 염료 기반 시각화 대신 얼룩이 없는 시각화 방법을 활용하기 때문에 중요합니다. RNA의 보존은 이 프로토콜에서 큰 이점입니다, 그것은 유용, 뿐만 아니라 사후 인간 뇌 조직에서, 뿐만 아니라 다른 조직 유형, 높은 RNase 활동. 먼저, 냉동고에서 조직을 제거하고 냉동고로 운반하기 위해 드라이 아이스에 놓습니다.깨끗한 브러시, 척 및 조직을 극저온에 20분 이상 넣고 최적의 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 이중 챔버와 시편 유지 온도가 있는 저온의 경우 물체 온도를 영하 16도, 챔버 온도를 영하 18도로 설정합니다. 저온측정기의 단면 두께를 14마이크로미터로 설정하고 트림 두께를 30마이크로미터로 설정합니다.다음으로, RNase 오염물질과 70%에탄올의 일대일 혼합물로 무대를 청소하여 동결을 방지합니다. 새로운 일회용 저온 극저온 블레이드를 얻고 RNase 오염 제거물질로 청소하십시오. 청소된 블레이드를 블레이드 홀더에 배치합니다.그런 다음 RNase 오염 제거제로 롤 방지 플레이트를 청소하십시오. 청소된 접시를 무대에 부착하고 블레이드와 롤 방지 판이 극저온의 온도까지 내려올 때까지 적어도 20 분 동안 기다립니다. 첫째, 단면에 대한 조직의 작은 조각을 잘라, 섹션이 약 95 %의 소뇌 피질인지 확인.나머지 조직을 드라이 아이스또는 냉동고에 영하 80도에서 반환합니다. 다음으로, 천천히, 원형 동작척 위에 OCT를 추가하기 시작합니다. 척을 덮고 있는 약 3밀리미터 높이의 마운트가 있을 때까지 OTC 층을 구축합니다.OCT가 부분적으로 동결되었지만 여전히 중앙에 액체가 있는 경우 조직을 마운트 위에 놓습니다. 조직이 완전히 얼어 붙을 때까지 1 ~2 분 동안 1 0 월 위에 앉게하십시오. 그런 다음 냉동 10 월 및 조직으로 척을 냉동 절단 팔로 옮킨다.조직을 커팅 블레이드와 함께 플러시하고 조직이 절단 팔에 20 분 동안 앉아 새로운 온도에 적응하도록 조정합니다. 가장 중요한 단계는 조직이 필요한 기간 동안 극저온 절단 팔에 적응할 수 있도록 하는 것입니다. 조직이 분쇄되면, purkinje 세포 시각화는 매우 어려울 것입니다.조직이 더 빨리 적응할 수 있도록 조직의 더 작고 얇은 조각을 사용하는 것이 좋습니다. 그 후 조직을 블레이드에 가깝게 천천히 이동합니다. 조직이 블레이드에 도달하면 트리밍 과정을 시작합니다.피질 층이 보일 때까지 조직을 2~3회 다듬습니다. 다음으로, 냉동 블레이드 바로 위에 안티 롤 플레이트를 배치하고 정렬합니다. 14 마이크로미터 두께의 4~6개의 섹션을 잘라 내어 제대로 절단된 섹션이 롤 방지 플레이트 아래에 평평하다는 점에 주목합니다.저스트스테이지를 가로질러 절단 된 부분을 수평으로 정렬합니다. 슬라이드를 각도로 모든 조직 조각을 동시에 집어 들수 있습니다. 조직을 단면한 직후 슬라이드를 70%에탄올로 슬라이드 홀더에 2분간 얼음 위에 놓습니다.슬라이드를 얼음 위에 95%의 에탄올이 있는 슬라이드 홀더로 45초 동안 전송합니다. 다음으로 슬라이드 홀더에 100% 에탄올을 실온에 2분간 놓습니다. 실온에서 자일렌 넘버 1이 들어있는 슬라이드 홀더에 슬라이드를 세 번 찍어 넣습니다.그런 다음 슬라이드 홀더에 실온에서 2 개의 자일렌2를 5 분 동안 놓습니다. 깨끗한 연기 후드에 슬라이드를 서서 적어도 30 분 동안 공기를 건조하게하십시오. 슬라이드를 저장하는 경우 각 튜브를 별도의 50 밀리리터 튜브에 넣고 튜브를 섭씨 영하 80도에서 최대 7일 동안 냉동실에 넣습니다.먼저 RNase 오염제거기를 사용하여 현미경 단계와 캡 수집 암을 청소하십시오. 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 현미경에 놓고 500 마이크로리터 불투명 캡을 수집 팔에 놓습니다. 낮은 배율에서, 소뇌 조직 위에 불투명 캡을 정렬하여 캡이 눈조각에 시각화되는 전체 영역을 덮을 수 있도록 보장합니다.5배에서 10배의 목표를 사용하여 소뇌 층을 시각화합니다. 분자 층과 과립 세포 층이 교차하는 섹션 위에 커서를 놓습니다. 40배 배율로 이동하고 퍼킨제 세포를 시각화한다.그런 다음 캡처를 시작합니다. 마이크로 절제 후 RNA 수집을 시작하려면 캡이 위로 향하도록 불투명 한 캡에 셀 리시스 버퍼 50 마이크로 리터를 추가합니다. 조심스럽게 캡 위에 튜브를 닫고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬렉션을 진행합니다.이 프로토콜에서, 신선한, 냉동, 사후, 인간의 뇌 조직은 UV 레이저 캡처 미세 절에 대한 준비가되어 있습니다. 할당된 드로잉 타임에 극저고의 절개에 이어, 소뇌의 세포 층은 5배, 10배의 객관적인 렌즈로 쉽게 볼 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 적절한 자일렌 인큐베이션은 조직이 어두워지고 에탄올만하는 것보다 세포 층을 더 잘 묘사합니다.레이저 포획 현미경에서 절단할 때, 40배의 객관적인 렌즈는 주변 조직이 아닌 퍼킨제 세포만 캡처할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 여기서 볼 수 있듯이, 자일렌의 적절한 인큐베이션은 에탄올 고정에만 비해 고품질의 형태학적 으로 손상되지 않은 이미지를 생성합니다. 불투명 캡의 커버 슬립 능력은 다른 프로토콜이 액체 채워진 캡을 활용하는 동안 테스트되며, 이러한 캡은 조직 시각화를 줄이고 현미경하에서 결과 이미지가 세분화되고 무지개 빛깔로 만들 수 있습니다.그러나 불투명한 캡을 통한 시각화는 형태가 부드럽고 선명한 매끄러운 조직 외관을 초래합니다. 저전력과 고출력에서 절제된 퍼킨제 세포의 대표적인 이미지는 퍼킨제 세포 체체만을 정밀하게 제거한 것을 보여준다. 그 후, 고품질 Rnase는 후속 RNA 염기서열분석에 대해 수득된다.6개의 대표적인 견본은 RNA 추출을 겪었고 Rnase 없는 물의 14마이크로리터에서 재중단되고 모든 6개의 견본은 RNA 무결성 수와 동일하거나 8개 이상 인 고품질 RNA를 생성했습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 조직의 품질이 전부라는 것입니다. 절단 및 슬라이드 배치조차도 이 프로토콜을 만들거나 중단합니다.이 절차에 따라, RNA 또는 DNA를 조사하는 어떤 방법든지, 특히 우리는 차동 유전자 발현을 위해 우리의 RNA를 탐구합니다, 그러나 유전자 규칙에 관하여 그밖 질문도 조사될 수 있었습니다. 이 방법은 관심있는 세포의 식별을 위해 항원 또는 염료 특이 시약의 사용을 필요로하지 않는 특정 묘사 형태학이있는 조직 유형에 적용 될 수있다. 우리는 이 기술이 우리가 떨림 표현형이 있는 필수적인 떨림 및 그밖 질병의 유전학을 이해하는 것을 도울 것이라는 점을 희망합니다.이 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 화학 물질은 자일렌입니다. 연기 후드에 제대로 처리해야 하며, 제대로 폐기해야 하며, 슬라이드는 열린 공간에서 사용될 때까지 적절하게 건조할 수 있어야 합니다. 또한, 인간의 샘플과 함께 작업 할 때, 생물 위험 폐기물 관리 및 안전을 활용해야한다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...