Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne New York Brain Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel og Dr. Etty Cortés, for deres hjelp i skjæring og bevare de frosne menneskelige hjerne vevsprøver for disse eksperimentene. Forfatterne ønsker å erkjenne personer som sjenerøst donert hjernen for videre forskning i viktig Tremor. Dr. Faust og Dr. Martuscello ønsker å erkjenne Columbia University avdeling for patologi og cellebiologi for deres støtte og kjernen forskning plass. Forfatterne ønsker å erkjenne NIH R01 NS088257 Louis/Faust) for forskningsmidler for dette prosjektet. LCM bildene ble utført i Confocal og spesialisert mikroskopi delt ressurs av Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet av NIH gi #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Forfatterne ønsker å erkjenne Theresa Swayne og Laura Munteanu for deres fortsatte hjelp med spesialiserte mikroskopi.

Alle menneskelige prøver benyttet i denne protokollen er anskaffet med samtykke og er godkjent av interne Review Board (IRB) ved Columbia University og ved Yale University.
Merk: Hele denne protokollen skal følge strenge RNA håndtering retningslinjer, der en gloved hånd brukes alltid alle overflater rengjøres med en RNase renseinstallasjon og alle materialer er RNA/DNA/Nuclease gratis.
1. test RNA integriteten til vev før starter MFM
<p clas...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Protokollen presenteres her er spesielt modifisert for å være en rustfritt tilnærming visualisere morphologically forskjellige vev for UV-LCM. Denne metoden er utformet for å maksimere RNA integritet for påfølgende direkte RNA sekvensering, samtidig opprettholde en forsterket plan flate av vev visualisering. Muligheten til å skille ulike celletyper fangst, for å lage den reneste populasjonen av celler mulig, er avgjørende for å forstå ulike molekylær profiler i menneskelig vev15. I for...

Laser fange microdissection (LCM) er en verdifull forskningsverktøy som for separasjon av patologisk relevante celler for påfølgende molecularly drevet evaluering. Bruken av molekylære analyser i disse heterogene vevsprøver og sammenhengen med patologisk og kliniske data er et nødvendig skritt i å vurdere translasjonsforskning betydningen av biologiske1. Når du analyserer genuttrykk data fra RNA, bruk av frossent deler anbefales fordi det gir utmerket kvalitet på RNA samt maksimert antallet2. Det har vært godt etablert at høy kvalitet og kvantitet av RNA er avgjørende for meningsfylt data fra RNA sekvensering3. Men når bruker RNA fra frisk frosne obduksjon vev for LCM, er RNA degradering en stor utfordring, som det skjer umiddelbart etter døden og utstrekning er formidlet av ulike faktorer assosiert med vev samling metode4,5 . Videre forsterkes RNA fornedrelse når flekker teknikker er nødvendig for å gjenkjenne histologic detaljer og celle identifikasjon. Spesialiserte flekker teknikker, som hematoxylin og eosin, Nissl flekken, immunofluorescence og immunohistochemistry er nyttige i å skille celler fra omkringliggende stroma men har vist seg å redusere RNA og endre transkripsjon uttrykk Profiler6. Derfor, vårt laboratorium har skapt en rustfritt protokoll spesielt designet for å bevare RNA i evaluering av menneskelig lillehjernen anvendelsen av RNA sekvensering etter LCM isolasjon av Purkinje neurons.
I behandling frisk frossent for LCM, kan metoden fiksering ulik påvirke både RNA og vev integritet. Formalin fiksering er standard for morfologiske bevaring, men årsaker cross-linking som kan fragmentere RNA og forstyrre RNA forsterkning7. Etanol fiksering er et bedre alternativ for RNA isolasjon, som det er et coagulative bindemiddel som ikke brekning cross-linking1. For å forsterke effekten av vev morfologi, er xylen det beste valget, som det fjerner lipider fra vevet. Det er imidlertid kjent begrensninger når utnytte xylen i LCM, vev kan tørke ut og bli sprø forårsaker vev fragmentering på laser fange7. Xylen er også en flyktige gift og må behandles riktig i avtrekksvifte. Xylen har likevel vist seg å forbedre vev visualisering samtidig bevare RNA integritet8. Derfor Sentre våre protokollen rundt bruk av 70% etanol fiksering og etanol dehydrering, etterfulgt av xylen inkubasjon morfologiske klarhet.
Det er viktig å merke seg de forskjellige typene laser-basert microdissection systemer, som de har vist varierer i hastighet, presisjon og RNA kvalitet. Infrarød (IR) laser fange microdissection og ultrafiolett (UV) laser microbeam microdissection systemer var begge romanen LCM plattformer som dukket opp nesten samtidig8. IR-LCM systemet benytter en "kontakt system" bruke en gjennomsiktig termoplastisk film plassert direkte på delen vev, og cellene rundt overholder selektivt filmen av fokusert pulser fra en IR laser. Alternativt, UV-LCM systemet er en "ikke-kontakt system" der en fokusert laserstråle skjærer bort i celler eller områder av interesse i vev; avhenger på konfigurasjonen i to tilgjengelige kommersielle plattformer som bruker enten en invertert eller oppreist mikroskop design, vev er kjøpt i en samling enhet av en laser-induserte bølge som katapulter det mot tyngdekraften eller vev er samlet av tyngdekraften, henholdsvis. Betydelige fordeler av UV-LCM inkluderer raskere celle oppkjøpet, forurensning-fri samling med ikke-kontakt tilnærming og mer presis disseksjon på grunn av en mye mindre laser strålen diameter9. Denne protokollen ble spesielt utformet for en UV-LCM system og har ikke blitt testet i et IR-LCM system. Enten UV-LCM system design, når samler celler i samlingen hetten, bruk av en dekkglassvæske som forbedrer er mobilnettet klarhet under mikroskopi ikke egnet, som cellene kan ikke gå inn i samling hetten. Derfor for å forsterke vev visualisering, testet vi bruk av ugjennomsiktig samling lokk, som er utformet for å fungere som en dekkglassvæske for mikroskopiske visualisering i UV-LCM systemer, mot flytende fylt samling caps. Væske fylt samling caps kan være utfordrende, væsken er underlagt fordampning og må erstattes ofte mens du arbeider i mikroskopet. Tid blir en viktig faktor for RNA stabilitet, som fanget vevet oppløser umiddelbart7.
Vårt laboratorium studier postmortem neuropathologic endringene i lillehjernen av pasienter med viktig tremor (ET) og relaterte nevrodegenerative lidelser av lillehjernen. Vi har vist morfologiske endringer sentrert på Purkinje celler som skiller ET tilfeller versus kontroller, inkludert et redusert antall Purkinje celler, økt dendrittiske regresjon og en rekke axonal endringer, fører oss å postulere at Purkinje celle degenerasjon er en sentral biologiske funksjon i ET patogenesen10,11,12,13. Transcriptional profilering er brukt i mange nevrologiske sykdommer for å utforske underliggende molekylær grunnlaget for degenerative mobilnettet endringer. Men transcriptional profiler fra heterogene utvalgene, for eksempel områder av hjernen vev, kan effektivt maske uttrykk for lav overflod utskrifter og/eller redusere påvisning av molekylære endringer som oppstår i en liten populasjon av berørte celler, for eksempel Purkinje celler i lillehjernen cortex. For eksempel mindretall Purkinje celler langt av rikelig granule cellene i lillehjernen cortex av ca 1:3000; dermed målrette effektivt mot krever deres transcriptome bestemte isolasjon av disse neurons. Lillehjernen cortex er preget av ulike lag som varierer i cellen tetthet og Cellestørrelse. Denne mobilnettet arkitekturen er ideelt å visualisere i en frisk-frosne Vevsprøve uten fargestoff inneholder flekker reagenser. I teorien, denne protokollen kan også brukes til andre vev typer som har lignende karakteristiske vev organisasjon.
Denne protokollen ble utformet spesielt for Purkinje celle effekt i menneskelig evaluering av lillehjernen. Det finnes flere protokoller for fiksering, farging visualisering og RNA bevaring av mange typer vev i forbindelse med både IR - og UV-LCM. Når du vurderer en eksperimentell design for UV-LCM, bør enkeltpersoner skreddersy sine protokollen for å best passer behovene og kravene til start- og materialer. Her kombineres mange aspekter av forskjellige LCM protokoller en forbedret metode for å visualisere Purkinje celler i evaluering av menneskelig lillehjernen uten fargestoff som inneholder flekker reagenser å forberede høykvalitets RNA transcriptome sekvensering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Laser fange microdissection (LCM) er en fordelaktig verktøy for innsamling av cytologically og/eller svært relevante celler eller områder fra heterogene vev. Fanget produktet kan brukes i en rekke molekylær metoder for protein, DNA eller RNA isolasjon. Men er bevaring av RNA fra postmortem hjernevev spesielt utfordrende. Standard visualiseringsteknikker for LCM krever histologic eller immunohistochemical flekker prosedyrer som kan ytterligere redusere RNA. Derfor har vi utviklet en rustfritt protokoll for visualisering i LCM hensikten med bevare RNA integritet i evaluering av hjernevev. Purkinje cellen av lillehjernen er en god kandidat for rustfritt visualisering, p.g.a. størrelsen og karakteristiske plassering. Lillehjernen cortex har forskjellige lag som varierer i cellen tetthet, noe som gjør dem en god arketypen å identifisere under forstørring mikroskopi. Purkinje celler er store neurons granule celle laget, som er en tett cellular nettverk av små neurons, og molekylær laget, som er spredt i cellen legemer. Bruk av rustfritt visualisering er mulig på grunn av denne arkitekturen. Andre organ eller celle systemer som etterligner denne fenotypen vil også være egnet. Rustfritt protokollen er utformet for å fastsette frisk-frosne vev med etanol og fjerne lipider med xylen for forbedret morfologiske visualisering under forstørring * lys. Denne protokollen ikke høyde for andre fiksering metoder og er spesielt utformet for frisk-frosne vevsprøver tatt ved hjelp av en ultrafiolett (UV)-LCM systemet. Her presenterer vi en full protokoll for skjæring og fikse frisk frosne obduksjon menneskelig lillehjernen vev og rensing av fra Purkinje celler isolert av UV-LCM, stund preserving RNA kvalitet for påfølgende RNA-sekvensering. I våre hender denne protokollen gir overlegne nivåer av mobilnettet visualisering uten flekker reagenser og gir RNA med høy RNA integritet tall (≥8) behov for transcriptional profilering eksperimenter.

Denne protokollen detaljer trinnene for å forberede frisk frosne obduksjon hjernevev for UV-LCM. Grundig spesifikasjoner og merknader gis for kryostaten skjæring, som det kan være vanskelig å kutte frisk frosne hjernevev med en høy grad av presisjon. Det viktigste punktet å vurdere er at fersk frossent er svært kaldt og krever en betydelig mengde tid til acclimate til varmere temperaturen på en kryostaten. Dette trinnet kan ikke flyttes, og den kan ikke være overdrevet hvor sentr...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Denne protokollen bruker en flekk-fri tilnærming til å visualisere og isolere Purkinje celler i fersk-frosne vev fra menneskelige obduksjon lillehjernen via laser fange microdissection. Formålet med denne protokollen er å generere tilstrekkelig mengder av høy kvalitet for RNA-sekvensering.

En rustfritt protokoll for høykvalitets RNA isolasjon fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i menneskelig obduksjon lillehjernen

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Denne protokollen er betydelig, fordi den benytter en flekkfri visualiseringsmetode i stedet for fargebasert visualisering på post-mortem menneskelig hjernevev, som bidrar til å bevare RNA integritet. Bevaring av RNA er en stor fordel i denne protokollen, da det er nyttig, ikke bare i post-mortem menneskelig hjernevev, men også andre vevstyper, med høy RNase-aktivitet. Til å begynne med, fjern vevet fra fryseren og legg det på tørris for transport til kryostaten.Plasser de rene børstene, chucken og vevet i kryostaten i minst 20 minutter, slik at de kan nå optimal temperatur. For kryostater med doble kamre og prøveholdende temperaturer, sett objekttemperaturen til minus 16 grader Celsius og kammertemperaturen til minus 18 grader Celsius. Sett kryostatets seksjonstykkelse til 14 mikrometer og trimtykkelsen til 30 mikrometer.Deretter rengjør du scenen med en en-til-en-blanding av RNase dekontaminator og 70% etanol, for å forhindre frysing. Få et nytt, engangs cryostatblad og rengjør det med RNase dekontaminator. Plasser det rengjorte bladet i bladholderen på scenen.Rengjør deretter anti-roll platen med RNase dekontaminator. Fest den rengjorte platen til scenen og vent minst 20 minutter på at bladet og anti-roll-platen kommer ned til temperaturen på kryostaten. Først kutt et lite stykke vev for snitting, og pass på at avsnittet er ca 95% cerebellar cortex.Returner det gjenværende vevet enten til tørris, eller en til en fryser, ved minus 80 grader Celsius. Deretter begynner du sakte å legge til OCT på toppen av chucken med en langsom, sirkulær bevegelse. Bygg opp lag med OTC til det er en mount ca tre millimeter høy dekker chucken.Når OCT er delvis frosset, men fortsatt har litt væske i midten, plasser vevet på toppen av braketten. La vevet sitte på toppen av OCT i ett til to minutter til det er helt frosset. Deretter overfører chucken med den frosne OCT og vev inn i kryostatskjærearmen.Juster vevet slik at det skylles med skjærebladet og la vevet sitte i skjærearmen i 20 minutter for å tilpasse seg den nye temperaturen. Det mest kritiske trinnet er å tillate vevet å akklimatisere seg i kryostatkuttearmen så lenge som nødvendig. Hvis vev makulerer, purkinje celle visualisering vil være svært vanskelig.Jeg anbefaler å bruke mindre, tynnere biter av vev, slik at vevet akklimatiseres raskere. Etter dette beveger du langsomt vevet nærmere bladet. Når vevet har nådd bladet, start trimmingsprosessen.Trim vevet to til tre ganger, til cortex lagene er synlige. Deretter plasserer du og justerer rulleplaten like over kryostatbladet. Klipp fire til seks seksjoner som er 14 mikrometer tykke, og merk at riktig kutte seksjoner vil være flate under anti-roll plate.Juster de kuttede seksjonene horisontalt over kryostatstadiet. Vinkle et lysbilde for å plukke opp alle vevsbitene samtidig. Umiddelbart etter snitting av vevet, legg lysbildet i glideholderen med 70% etanol på is i to minutter.Overfør lysbildet til en glideholder med 95% etanol på is i 45 sekunder. Deretter plasserer du lysbildet i glideholderen med 100 % etanol ved romtemperatur i to minutter. Dypp lysbildet tre ganger inn i glideholderen som inneholder xylen nummer én ved romtemperatur.Plasser deretter skyvet i glideholderen med xylen to ved romtemperatur i fem minutter. Sett lysbildene opp i en ren røykhette og la dem lufttørke i minst 30 minutter. Hvis du lagrer lysbildene, plasserer du hver enkelt i et separat 50 milliliter rør og plasserer rørene i en fryser på minus 80 grader Celsius i opptil syv dager.Bruk først RNase dekontaminator til å rengjøre mikroskopstadiet og hettens oppsamlingsarm. Med hansker hender plasserer du lysbildet på mikroskopet og en 500 mikroliter ugjennomsiktig hette i oppsamlingsarmen. Ved en lav forstørrelse justerer du den ugjennomsiktige hetten over lillehjernen, og sikrer at hetten dekker hele området som visualiseres i øyestykket.Bruk en fem ganger til 10 ganger målsetting for å visualisere lillehjernen lag. Plasser markøren over delen der molekylært lag og granualcellelag krysser hverandre. Flytt til en 40 ganger forstørrelse og visualisere purkinje cellene.Deretter begynner du å fange dem. For å starte RNA-innsamlingen etter mikrodisseksjonen, legg til 50 mikroliter cellelysbuffer til den ugjennomsiktige hetten med hetten vendt opp. Lukk røret forsiktig over hetten og fortsett med samlingen som beskrevet i tekstprotokollen.I denne protokollen, frisk, frossen, post-mortem, menneskelig hjernevev er forberedt for UV laser fange mikrodisseksjon. Etter kryostats snitting i den tildelte tegnetiden, er de cellulære lagene i lillehjernen lett synlige med fem ganger og 10 ganger objektive linser. Som sett her, riktig xylen inkubasjon fører til at vevet blir mørkere og bedre avgrenser cellulære lag enn etanol alene.Når du kutter på laserfangstmikroskopet, er den 40 ganger objektive linsen nødvendig for å sikre at det bare er purkinjeceller og ikke det omkringliggende vevet. Som sett her, produserer riktig inkubasjon i xylen et morfologisk intakt bilde av høy kvalitet sammenlignet med etanolfiksering alene. Dekselet slip evne til en ugjennomsiktig cap blir deretter testet mens andre protokoller benytter en væskefylt cap, disse caps kan redusere vev visualisering og føre til at det resulterende bildet å være granulær og iriserende under mikroskopet.Visualisering gjennom en ugjennomsiktig hette resulterer i imidlertid i det glatte vevsutseendet som er mykere og skarpere i form. Representative bilder av utskåret purkinjeceller med lav effekt og ved høy effekt viser presis fjerning av bare purkinjecellekroppen. Etter dette oppnås Rnase av høy kvalitet for påfølgende RNA-sekvensering.Seks representative prøver gjennomgikk RNA-ekstraksjon og ble gjenbrukt i 14 mikroliter rnasefritt vann, og alle seks prøvene produserte RNA av høy kvalitet med RNA-integritetstall lik eller større enn åtte. Det viktigste å huske er at vevskvalitet er alt. Selv skjæring og lysbildeplassering vil gjøre eller bryte denne protokollen.Etter denne prosedyren kan enhver metode som undersøker RNA eller DNA utføres, spesielt vi sonderer vår RNA for differensialgenuttrykk, men andre spørsmål om genregulering kan også undersøkes. Denne metoden kan brukes på alle vevstyper som har spesifikk avgrenset morfologi som ikke krever bruk av antigen eller fargestoffspesifikke reagenser for identifisering av celler av interesse. Vi håper at denne teknikken vil hjelpe oss å forstå genetikken til essensiell tremor og andre sykdommer som har en tremor fenotype.Det farligste kjemikaliet som brukes i denne protokollen er xylen. Det skal håndteres riktig i en røykhette, kastes riktig, og lysbilder bør få lov til å tørke tilstrekkelig til de brukes i et åpent rom. I tillegg, når du arbeider med menneskelige prøver, bør biofarlig avfallshåndtering og sikkerhet benyttes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture microdissection av nerveceller fra Differensiert Menneskelig Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolasjon av distinkte cellepopulasjoner fra utviklings Cerebellum av microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodisseksjon - En demonstrasjon av Isolering av Individuell dopaminneuroner og hele Ventral tegmentale området

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...