Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Os autores gostaria de reconhecer o cérebro do New York Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel e Dr. Etty Cortés, por sua assistência na corte e preservar as amostras de tecido do cérebro humano congelado para estas experiências. Os autores gostaria de reconhecer os indivíduos que generosamente doaram seu cérebro para a pesquisa contínua sobre Tremor essencial. Dr. Fausto e Dr. Martuscello gostaria de reconhecer a Columbia University departamento de patologia e biologia celular para o seu contínuo apoio e espaço de pesquisa do núcleo. Os autores gostaria de reconhecer o NIH R01 NS088257 Louis/Fausto) para financiamento de pesquisa para este projeto. Imagens de LCM foram realizadas no Confocal e especializada microscopia recurso compartilhado do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, na Universidade de Columbia, suportado pelo NIH conceder #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Os autores que gostaria de agradecer a Theresa Swayne e Laura Munteanu por sua assistência continuada com microscopia especializada.

Todas as amostras humanas utilizadas neste protocolo foram obtidas com consentimento informado e foram aprovadas pelo interno Review Board (IRB), na Universidade de Columbia e Yale University.
Nota: A totalidade do presente protocolo deve seguir rigoroso RNA manipulação orientações, por meio de que uma mão enluvada sempre é usada, todas as superfícies são limpas com uma desinfecção de RNase e todos os materiais de trabalho são de RNA/DNA/Nuclease livre.
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<ol>
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O protocolo aqui apresentado é modificado especificamente para ser uma abordagem de aço inoxidável em Visualizar morfologicamente distintos tecidos para UV-LCM. Este método foi projetado para maximizar a integridade do RNA para subsequentes direto a sequenciação do ARN, mantendo um nível aprimorado de visualização do tecido. A capacidade de distinguir diferentes tipos de células para captura, para criar a população de células mais pura possível, é essencial para a compreensão de diferentes perfis molecula...

Do laser captura microdissection (LCM) é uma ferramenta valiosa pesquisa que permite a separação das células patologicamente relevantes para posterior avaliação molecularmente orientada. O uso de análises moleculares nestes espécimes de tecido heterogêneo e a correlação com dados clínicos e patológicos é um passo necessário na avaliação o significado translacional de pesquisa biológica1. Ao analisar dados da expressão do gene do RNA, o uso de seções do tecido congelado é altamente recomendado pois permite excelente qualidade de RNA bem como maximizada quantidade2. Tem sido bem estabelecida que alta qualidade e a quantidade de RNA são essenciais para dados significativos de sequenciamento de RNA3. No entanto, quando usando o RNA do tecido fresco congelado post-mortem para LCM, degradação de RNA é um grande desafio, como ocorre imediatamente após a morte e sua extensão é mediada por diversos fatores associados com o tecido coleção método4,5 . Além disso, degradação de RNA é agravada quando as técnicas de coloração são necessários para reconhecer detalhes histológicos e identificação de célula. Especializou-se de técnicas, como a hematoxilina & eosina, Nissl mancha, de coloração imunofluorescência e imunohistoquímica são úteis na diferenciação de células do estroma circundante, mas têm sido mostrados para degradar o RNA e alterar a expressão de transcrição perfis de6. Portanto, nosso laboratório criou um protocolo inoxidável projetado especificamente para preservar o RNA no cerebelo humano post mortem para fins de sequenciação do ARN, após isolamento de LCM de neurônios de Purkinje.
No processamento de tecido congelado fresco para o LCM, o método de fixação variàvel pode afetar a integridade tanto do RNA e tecido. Fixação de formalina é padrão para preservação morfológica, mas causas do cross-linking que podem fragmentar o RNA e interferir de amplificação do RNA7. Fixação de etanol é uma alternativa melhor para o isolamento de RNA, como é um hemostático fixador que não induz a do cross-linking1. Para melhorar a visualização da morfologia do tecido, xileno é a melhor escolha, como ele remove lipídios do tecido. No entanto, existem conhecidas limitações quando utilizando o xileno no LCM, como os tecidos podem secar e tornar-se frágil causando fragmentação de tecido em cima do laser captura7. Xileno também é uma toxina volátil e deve ser manuseado corretamente em uma coifa. Não obstante, xileno foi mostrado para melhorar a visualização do tecido preservando também RNA integridade8. Portanto, nosso protocolo centros em torno do uso de fixação de etanol 70% e desidratação do etanol, seguido de incubação xileno para clareza morfológica.
É importante observar os diferentes tipos de sistemas baseados em laser microdissection, como eles têm sido mostrados para diferem em velocidade, precisão e qualidade do RNA. O laser de infravermelho (IR) capturar microdissection e os sistemas de microdissection microbeam de laser ultravioletas (UV) foram as duas plataformas de LCM romance que surgiu quase simultaneamente8. O sistema IR-LCM emprega um sistema de"contacto" usando um filme termoplástico transparente colocado diretamente na seção de tecido, e as células de interesse seletivamente aderirem ao filme por pulsos de concentrado de um laser de IR. Alternativamente, o UV-LCM é um sistema "non-contact" no qual um feixe de laser focalizado corta fora as células ou regiões de interesse no tecido; dependendo da configuração em duas plataformas comerciais atualmente disponíveis que usam qualquer um microscópio invertido ou vertical design, tecido é adquirido em um dispositivo de recolha por uma onda de pressão induzida por laser que catapulta-lo contra a gravidade ou tecido é coletados por gravidade, respectivamente. Vantagens significativas do sistema UV-LCM incluem aquisição de celular mais rápida, coleção livre de contaminação com a abordagem de não-contato e dissecação mais precisa devido a um muito menor laser feixe diâmetro9. Este protocolo foi projetado especificamente para um sistema de UV-LCM e não foi testado em um sistema de IR-LCM. Em qualquer projeto de sistema de UV-LCM, quando acumuladas células na PAC coleção, o uso de uma lamela que aumenta a clareza celular durante a microscopia não é apropriada, como as células seriam incapazes de entrar o cap de coleção. Portanto, para melhorar a visualização do tecido, testamos o uso de tampões de coleção opaco, que são projetados para agir como uma lamela para visualização microscópica em sistemas UV-LCM, contra tampões coleção cheia de líquido. Tampões de coleção cheia de líquido podem ser um desafio, como o líquido está sujeito a evaporação e deve ser substituído frequentemente enquanto estiver trabalhando no microscópio. Tempo torna-se um fator importante para a estabilidade do RNA, como o tecido capturado imediatamente dissolve7.
Nosso laboratório estuda as alterações post-mortem de contrair no cerebelo dos pacientes com tremor essencial (ET) e doenças neurodegenerativas relacionadas do cerebelo. Temos demonstrado alterações morfológicas centradas nas células de Purkinje que distinguem ET casos versus controles, incluindo um número reduzido de células de Purkinje, aumentaram dendrítica regressão e uma variedade de alterações axonal, levando-na postular que Purkinje degeneração celular é um recurso biológico núcleo ET patogênese10,11,12,13. Perfil transcricional serviu em muitas doenças neurológicas para explorar a base molecular subjacente de alterações degenerativas do celulares. No entanto, perfis transcriptional de amostras heterogêneas, como regiões de tecido do cérebro, podem efetivamente mascarar a expressão de transcritos de baixa abundância e/ou diminuir a detecção de alterações moleculares que ocorrem apenas em uma pequena população de afetados células, como células de Purkinje do córtex cerebelar. Por exemplo, células de Purkinje são vastamente em desvantagem pelas células grânulo abundantes no córtex cerebelar por aproximadamente 1:3000; assim, para efetivamente alvo seu transcriptome exige isolamento específico destes neurônios. O córtex cerebelar é delineado por camadas distintas que diferem em densidade celular e tamanho da célula. Essa arquitetura celular é ideal para visualizar em uma amostra de tecido fresco congelado sem tintura contendo reagentes de coloração. Em teoria, este protocolo também poderia ser aplicado a outros tipos de tecidos que têm tecido característico semelhante organização.
Este protocolo foi projetado para trabalhar especificamente para visualização de células de Purkinje no cerebelo humano post mortem. Inúmeros protocolos existem para a fixação, de coloração, para efeitos de ambos os IR - e UV-LCM, visualização e preservação de RNA de muitos tipos de tecidos. Quando contemplando um projeto experimental para UV-LCM, indivíduos devem adaptar seu protocolo para melhor atender as necessidades e requisitos da inicial e final de materiais. Aqui, nós combinamos muitos aspectos dos diferentes protocolos de LCM para fornecer um método aprimorado para a visualização de células de Purkinje no cerebelo humano sem a necessidade de corante contendo reagentes coloração para preparar RNA de alta qualidade para transcriptome post-mortem sequenciamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Captura de laser microdissection (LCM) é uma ferramenta vantajosa que permite a recolha de células tumorais e/ou fenotipicamente relevantes ou regiões de tecidos heterogêneas. Capturado do produto pode ser usado em uma variedade de métodos moleculares para proteína, isolamento de DNA ou RNA. No entanto, a preservação do RNA do tecido do cérebro humano após a morte é especialmente desafiador. Técnicas de visualização padrão para LCM exigem histológica ou procedimentos de coloração imuno-histoquímica que ainda podem degradam o RNA. Portanto, nós projetamos um protocolo de aço inoxidável para visualização no LCM com a finalidade de preservar a integridade do RNA no tecido do cérebro humano de post-mortem. A célula de Purkinje do cerebelo é um bom candidato para visualização de aço inoxidável, devido ao seu tamanho e localização característica. O córtex cerebelar tem camadas distintas que diferem em densidade celular, tornando-os um bom arquétipo para identificar sob microscopia de alta ampliação. Células de Purkinje são grandes neurônios situados entre a camada de células grânulo, que é uma rede densamente celular de pequenos neurônios, e a camada molecular, que é escassa em corpos celulares. Por causa dessa arquitetura, o uso de visualização de aço inoxidável é viável. Outros sistemas do órgão ou célula que imitam este fenótipo também seria adequados. O protocolo de aço inoxidável é projetado para reparar o tecido fresco congelado com etanol e remover os lipídios com xilol para uma melhor visualização morfológica sob microscopia de luz de alta ampliação. Este protocolo não leva em conta outros métodos de fixação e é projetado especificamente para amostras de tecido fresco congelado capturadas usando uma radiação ultravioleta (UV)-sistema de LCM. Aqui, apresentamos um protocolo completo para corte e fixação tecido cerebelar humano fresco congelado post-mortem e purificação de RNA a partir de células de Purkinje isoladas por UV-LCM, preservando a qualidade do RNA para subsequente-a sequenciação do ARN. Em nossas mãos, este protocolo produz níveis excepcionais de visualização celular sem a necessidade de coloração reagentes e produz RNA com números elevados de integridade do RNA (≥ 8) conforme necessário para experimentos de perfil transcricionais.

Este protocolo detalha as etapas para preparar o tecido do cérebro humano fresco congelado post-mortem para UV-LCM. Anotações e minuciosos especificações são dadas para cortes de criostato, como pode ser difícil de cortar o tecido de cérebro congelado fresco com um alto grau de precisão. O ponto mais importante a considerar é que o tecido congelado fresco é extremamente frio e requer uma quantidade significativa de tempo se aclimate à temperatura mais quente de um criostato. E...

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A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Este protocolo utiliza uma abordagem de mancha-livre para visualizar e isolar as células de Purkinje no tecido fresco congelado do cerebelo humano post mortem através do laser microdissection de captura. O propósito do presente protocolo é gerar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para a sequenciação do ARN.

Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Este protocolo é significativo, pois utiliza um método de visualização livre de manchas em vez de visualização baseada em corante no tecido cerebral humano pós-morte, o que ajuda a preservar a integridade do RNA. A preservação do RNA é uma grande vantagem neste protocolo, pois é útil, não apenas no tecido cerebral humano pós-morte, mas também em outros tipos de tecido, com alta atividade RNase. Para começar, retire o tecido do congelador e coloque-o em gelo seco para transporte ao criostat.Coloque os pincéis limpos, o mandril e o tecido no criostat por pelo menos 20 minutos, para permitir que eles atinjam a temperatura ideal. Para criostatas com câmaras duplas e temperaturas de fixação de espécimes, coloque a temperatura do objeto em menos 16 graus Celsius e a temperatura da câmara para menos 18 graus Celsius. Coloque a espessura da seção do criostat para 14 micrômetros e a espessura do corte para 30 micrômetros.Em seguida, limpe o palco com uma mistura de descontaminador RNase e 70% de etanol, para evitar o congelamento. Obtenha uma nova lâmina criostat descartável e limpe-a com descontaminador RNase. Coloque a lâmina limpa no suporte da lâmina no palco.Em seguida, limpe a placa anti-rolo com o descontaminador RNase. Coloque a placa limpa no palco e espere pelo menos 20 minutos para que a lâmina e a placa anti-rolo desçam até a temperatura do criostat. Primeiro, corte um pequeno pedaço de tecido para seção, certificando-se de que a seção é aproximadamente 95% de córtex cerebelar.Devolva o tecido restante para gelo seco, ou um para um congelador, a menos 80 graus Celsius. Em seguida, comece a adicionar lentamente OCT em cima do mandril com um movimento lento e circular. Construa camadas de OTC até que haja uma montagem de aproximadamente três milímetros de altura cobrindo o mandril.Quando o OCT estiver parcialmente congelado, mas ainda tiver algum líquido no centro, coloque os tecidos no topo da montagem. Deixe o tecido sentar em cima do OCT por um a dois minutos até que esteja completamente congelado. Em seguida, transfira o mandril com a OCT congelada e tecido para o braço de corte criostat.Ajuste o tecido para que ele fique alinhado com a lâmina de corte e deixe o tecido sentar no braço de corte por 20 minutos para ajustar à nova temperatura. O passo mais crítico é permitir que o tecido se aclimata no braço de corte criostat por quanto tempo necessário. Se o tecido rasgar, a visualização da célula purkinje será muito difícil.Recomendo usar pedaços menores e mais finos de tecido, para permitir que o tecido se aclimata mais rápido. Depois disso, mova lentamente o tecido mais perto da lâmina. Uma vez que o tecido tenha atingido a lâmina, comece o processo de corte.Corte o tecido duas a três vezes, até que as camadas do córtex sejam visíveis. Em seguida, coloque e alinhe a placa anti-rolo logo acima da lâmina criostat. Corte de quatro a seis seções de 14 micrômetros de espessura, observando que as seções cortadas adequadamente serão planas sob a placa anti-rolo.Alinhe as seções de corte horizontalmente através do estágio criostat. Anguore um slide para pegar todos os pedaços de tecido simultaneamente. Imediatamente após a secção do tecido, coloque o slide no porta-lâminas com 70% de etanol no gelo por dois minutos.Transfira o slide para um suporte de slides com 95% de etanol no gelo por 45 segundos. Em seguida, coloque o slide no porta-slides com 100% de etanol em temperatura ambiente por dois minutos. Mergulhe o slide três vezes no suporte de slides contendo xileno número um à temperatura ambiente.Em seguida, coloque o slide no porta-slides com xileno dois em temperatura ambiente por cinco minutos. Levante os slides em um capô de fumaça limpa e deixe-os secar por pelo menos 30 minutos. Se armazenar os slides, coloque cada um em um tubo separado de 50 mililitros e coloque os tubos em um congelador a menos 80 graus Celsius por até sete dias.Primeiro, use o descontaminador RNase para limpar o estágio do microscópio e o braço de coleta da tampa. Com as mãos enluvadas, coloque o slide no microscópio e uma tampa opaca de 500 microliter no braço de coleta. Em baixa ampliação, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a tampa cubra toda a área visualizada na peça ocular.Use de cinco vezes a dez vezes o objetivo de visualizar as camadas cerebelares. Coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e a camada celular granual se cruzam. Mova-se para uma ampliação 40 vezes e visualize as células purkinje.Então, comece a capturá-los. Para iniciar a coleta de RNA após a microdisseção, adicione 50 microliters de tampão de lise celular à tampa opaca com a tampa voltada para cima. Feche cuidadosamente o tubo sobre a tampa e proceda com a coleta conforme descrito no protocolo de texto.Neste protocolo, tecido cerebral humano fresco, congelado, pós-morte, é preparado para microdisseção de captura de laser UV. Após a secção do criostat no tempo de desenho atribuído, as camadas celulares do cerebelo são facilmente visíveis com lentes objetivas de cinco vezes e 10 vezes. Como visto aqui, a incubação adequada do xileno faz com que o tecido se torne mais escuro e melhor delineie camadas celulares do que o etanol sozinho.Ao cortar no microscópio de captura a laser, a lente objetiva de 40 vezes é necessária para garantir a captura apenas de células purkinje e não do tecido circundante. Como visto aqui, a incubação adequada no xileno produz uma imagem morfologicamente intacta de alta qualidade quando comparada apenas à fixação do etanol. A capacidade de deslizamento de cobertura de uma tampa opaca é então testada enquanto outros protocolos utilizam uma tampa cheia de líquido, essas tampas podem reduzir a visualização do tecido e fazer com que a imagem resultante seja granular e iridescente sob o microscópio.No entanto, a visualização através de uma tampa opaca resulta na aparência de tecido suavizada que é mais macia e mais nítida na forma. Imagens representativas de células purkinje excisadas em baixa potência e em alta potência mostram remoção precisa apenas do corpo celular purkinje. Depois disso, a Rnase de alta qualidade é obtida para sequenciamento subsequente de RNA.Seis amostras representativas foram submetidas à extração de RNA e foram resuspengiadas em 14 microlitadores de água sem Rnase e todas as seis amostras produziram RNA de alta qualidade com números de integridade de RNA iguais ou maiores que oito. A coisa mais importante a se lembrar é que a qualidade do tecido é tudo. Mesmo a colocação de corte e slides fará ou quebrará este protocolo.Após esse procedimento, qualquer método que investigue RNA ou DNA poderia ser realizado, especificamente sondamos nosso RNA para expressão genética diferencial, mas outras questões sobre regulação genética também poderiam ser investigadas. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de tecido que tenha morfologia delineada específica que não exija o uso de reagentes específicos de antígeno ou corante para identificação de células de interesse. Esperamos que essa técnica nos ajude a entender a genética do tremor essencial e outras doenças que têm um fenótipo de tremor.O produto químico mais perigoso usado neste protocolo é o xileno. Deve ser manuseado adequadamente em um capô de fumaça, descartado adequadamente, e os slides devem ser permitidos secar adequadamente até que seja usado em um espaço aberto. Além disso, ao trabalhar com amostras humanas, deve-se utilizar o gerenciamento de resíduos de risco biológico e a segurança.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...