Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Авторы хотели бы признать банк Нью-Йорка мозга, д-р Жан Поль Vonsattel и доктор Etty Кортес, за их помощь в резки и сохранения замороженных человеческий мозг образцов ткани для этих экспериментов. Авторы хотели бы признать лица, которые щедро пожертвовал их мозг для продолжающихся исследований в важнейших тремор. Доктор Фауст и д-р Martuscello хотели бы признать Колумбийского университета Департамента патологии и клеточной биологии, за их неизменную поддержку и основных космических исследований. Авторы хотели бы признать NIH R01 NS088257 Луи/Фауст) для финансирования научных исследований для этого проекта. LCM изображения были исполнены в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Авторы хотели бы признать Тереза Swayne и Лаура Мунтяну за их постоянную помощь с специализированными микроскопии.

Все человеческие образцы, используемые в настоящем протоколе были получены с осознанного согласия и были одобрены внутреннего обзора (КИБ) при Колумбийском университете, Йельском университете.
Примечание: Полностью этот протокол должен следовать строгим РНК, ?...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Протокола, представленные здесь специально изменены нержавеющей подход в визуализации морфологически различные ткани для УФ-НОК. Этот метод предназначен для обеспечения максимальной целостности РНК для последующих прямой последовательности РНК, сохраняя при этом повышенный уровен?...

Лазерная захвата microdissection (LCM) является ценный исследовательский инструмент, который позволяет разделение патологически соответствующих клеток для последующей оценки молекулярно приводом. Использование молекулярного анализа образцов этих разнородных тканей и корреляции с патологическим и клинических данных является необходимым шагом в оценке трансляционная значение биологических исследований1. При анализе данных выражение гена РНК, использование разделов замороженные ткани очень рекомендуется, так как она позволяет за отличное качество РНК, а также максимальным количеством2. Хорошо известно, что высокое качество и количество РНК необходимы для значимых данных от РНК последовательности3. Однако при использовании РНК из ткани свежий замороженные посмертные для LCM, РНК деградации является серьезной проблемой, как это происходит сразу же после смерти и его степени опосредовано различные факторы, связанные с ткани коллекции метод4,5 . Кроме того РНК деградации усугубляется, когда методы окраски необходимо признать гистологических детали и идентификации клетки. Специализированных пятная методы, такие как гематоксилином и эозином, Ниссль пятно, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии полезны в дифференциации клеток от окружающих стромы, но было показано, снизить РНК и изменить выражение Стенограмма 6профилей. Таким образом наша лаборатория создала нержавеющей протокол, специально предназначенных для сохранения РНК человека мозжечка посмертные для целей РНК последовательности после изоляции LCM Пуркинье нейронов.
В обработке свежий замороженные ткани для LCM, метод фиксации переменно может повлиять на целостность РНК и тканей. Формалин фиксации стандартный морфологический сохранения, но причины cross-linking который может фрагмент РНК и мешать амплификации РНК7. Фиксация этанол является лучшей альтернативой для изоляции РНК, как это коагуляционное фиксатором, который не побудить сшивки1. Для лучшей визуализации тканей морфологии, ксилол является лучшим выбором, как она удаляет липиды из ткани. Однако существуют известные ограничения при использовании ксилола в НОК, как ткани могут высохнуть и стать хрупкими вызывая ткани фрагментации после лазерной захвата7. Ксилол также летучих токсин и должно быть правильно обработаны в зонта. Тем не менее ксилол было показано для улучшения визуализации тканей, сохраняя при этом целостность РНК8. Таким образом наш протокол центров вокруг 70% этанол фиксации и дегидратации этанола, следуют ксилол инкубации для морфологических ясность.
Важно обратить внимание на различные виды microdissection лазерных систем, как они показали отличаются в скорости, точности и качества РНК. Инфракрасный (ИК) лазерный захватить microdissection и ультрафиолетового (УФ) Лазерные Микролучевой microdissection системы были оба романа LCM платформ, которые почти одновременно появились8. IR-LCM система использует «контактной системы» с помощью прозрачная пленка из термопластичного помещены непосредственно на участке ткани, и клетки интереса выборочно придерживаться фильм сосредоточены импульсы от ИК-лазер. Кроме того система УФ-НОК является «система-контакт», whereby сфокусированного лазерного пучка порезы от клетки или регионы интереса в ткани; в зависимости от конфигурации в двух имеющихся в настоящее время коммерческих платформ, использующих либо прямой или инвертированный микроскоп дизайн ткани приобретается в коллекции устройство по лазерно индуцированным давления волны, что катапульты против силы тяжести или ткани собранные под действием силы тяжести, соответственно. Значительные преимущества УФ-LCM системы включают в себя быстрее клеток приобретения, свободной от загрязнения коллекции с бесконтактным подхода и более точного рассечение из-за гораздо меньшие лазерный луч диаметром9. Этот протокол был разработан специально для системы УФ-LCM и не тестировался в системе ИК-НОК. В конструкции системы либо УФ-НОК когда накопления клеток в коллекции колпачок, использование coverslip, улучшает сотовых ясность при микроскопии не подходит, как клетки не сможет вступить в коллекции Кап. Таким образом чтобы повысить визуализации тканей, мы протестировали использование непрозрачной коллекции шапки, которые призваны выступать в качестве coverslip для микроскопических визуализации в системах УФ-НОК, против жидкости заполнены коллекции шапки. Колпачков жидкости заполнены коллекции может быть сложным, как жидкость подлежит испарения и должны быть заменены часто во время работы в Микроскоп. Время становится важным фактором стабильности РНК, как захваченных ткани растворяет сразу7.
Наша лаборатория изучает посмертных neuropathologic изменения в мозжечке больных с необходимым тремор (ET) и смежных нейродегенеративных расстройств мозжечка. Мы продемонстрировали морфологических изменений, сосредоточены на клетки Пуркинье, которые отличают ET дела против контроля, в том числе уменьшение количества клеток Пуркинье, увеличение дендритных регрессии и разнообразные аксональное изменений, ведущих нас постулат что Пуркинье дегенерации клеток является основной функцией биологических ET патогенеза10,11,12,13. Транскрипционный анализ профиля используется во многих неврологических заболеваний исследовать основные молекулярные основы дегенеративных клеточных изменений. Однако транскрипционный анализ профилей из гетерогенных образцов, таких как ткани областях мозга, могут действенно маска выражение низкой изобилие стенограммы и/или уменьшить обнаружения молекулярных изменений, которые происходят только в небольшой численностью населения пострадавших клеток, таких как клетки Пуркинье в коре мозжечка. Например клетки Пуркинье значительно превосходили клетками обильные гранул в коре мозжечка, приблизительно в избытке; Таким образом чтобы эффективно целевой их транскриптом требует конкретных изоляции этих нейронов. Коры мозжечка, разделенное на различные слои, которые отличаются в ячейке плотность и размер ячейки. Эта Сотовая архитектура идеально подходит для визуализации в образец ткани, свежемороженая без красителя содержащих окрашивание реагентов. В теории, этот протокол может также применяться к другим типам ткани, которые имеют аналогичные отличительные ткани Организации.
Этот протокол был разработан для работы специально для визуализации клеток Пуркинье в мозжечок человека посмертные. Для фиксации, окрашивание визуализации и РНК сохранение многих видов тканей для целей из обоих ИК - и УФ-LCM существуют многочисленные протоколы. При созерцая экспериментальный дизайн для УФ-НОК, лиц следует адаптировать их протокол для наилучшего нужд и потребностей, начиная и заканчивая материалы. Здесь мы объединяем многие аспекты различных протоколов LCM, чтобы предоставить метод расширения для визуализации клеток Пуркинье трупа человека мозжечка без необходимости краски, содержащие окрашивание реагентов для подготовки высококачественных РНК транскриптом последовательности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Лазерная захвата microdissection (LCM) является выгодным инструментом, который позволяет для коллекции обнаружения и/или фенотипически соответствующих ячеек или регионов из гетерогенных тканей. Захваченные продукт может быть использован в различных молекулярных методов для белков, ДНК или РНК изоляции. Однако сохранение РНК из ткани посмертных человеческого мозга является особенно сложным. Методы стандартных визуализации для LCM требуют гистологического или иммуногистохимическое окрашивание процедур, которые может еще больше ухудшить РНК. Таким образом мы разработали нержавеющей протокол для визуализации в LCM с цель сохранения целостности РНК в ткани мозга человека post-mortem. Клетки Пуркинье мозжечка является хорошим кандидатом для нержавеющей визуализации, благодаря его размер и расположение характерной. Коры мозжечка имеет различные слои, которые отличаются в плотность клеток, что делает их хорошим архетип для идентификации под большим увеличением микроскопии. Клетки Пуркинье являются крупные нейроны, расположенный между гранул слоя клеток, который плотно сотовой сети мелких нейронов, и молекулярный слой, который редкий в клетки тела. Из-за этой архитектуры целесообразно использование нержавеющей визуализации. Подойдет также другие органа или ячейки системы, которые имитируют этот фенотип. Нержавеющая протокол призван исправить свежемороженые ткани с этанолом и удаление липидов с ксилол для улучшения визуализации морфологических под большим увеличением световой микроскопии. Этот протокол не учитывает другие методы фиксации и разработан специально для образцов тканей, свежемороженая, захвачен с помощью ультрафиолетового (УФ)-LCM системы. Здесь мы представляем полный протокол для разрезания и фиксации свежий замороженные посмертные тканей мозжечка человека и Очистка РНК из клеток Пуркинье, изолированные, УФ-НОК, при сохранении качества РНК для последующего РНК последовательности. В наших руках этот протокол производит исключительным уровнем сотовой визуализации без необходимости для окрашивания реагентов и урожаи РНК с большим числом целостности РНК (≥8), необходимые для профилирования транскрипционный анализ экспериментов.

Этот протокол описывает шаги для подготовки ткани мозга человека свежий замороженные посмертные УФ-LCM. Тщательной спецификации и аннотации приведены для криостата резки, как это может быть трудно вырезать свежий замороженные мозговой ткани с высокой степенью точнос?...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Этот протокол использует пятно свободный подход для визуализации и изолировать клеток Пуркинье свежемороженые ткани от мозжечка человека посмертные через лазерный захвата microdissection. Цель настоящего Протокола заключается в том, для создания достаточного количества качественных РНК РНК последовательности.

Нержавеющая протокол для высокого качества изоляции РНК от лазерного захват клеток Пуркинье Microdissected мозжечка человека Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Этот протокол имеет важное значение, потому что он использует метод визуализации без пятен вместо красителя на основе визуализации на посмертной ткани человеческого мозга, которая помогает сохранить целостность РНК. Сохранение РНК является большим преимуществом в этом протоколе, так как полезно не только в посмертной ткани мозга человека, но и в других типах тканей, с высокой активностью RNase. Для начала удалите ткань из морозильной камеры и поместите ее на сухой лед для транспортировки в криостат.Поместите чистые щетки, патрон и ткань в криостат, по крайней мере 20 минут, чтобы позволить им достичь оптимальной температуры. Для криостатов с двойными камерами и температурами, удерживая образцы, установите температуру объекта до минус 16 градусов по Цельсию, а температуру камеры до минус 18 градусов по Цельсию. Установите толщину секции криостата до 14 микрометров, а толщину отделки до 30 микрометров.Затем очистите сцену смесью RNase без обеззараживания и 70%этанола, чтобы предотвратить замерзание. Получить новый, одноразовый криостат лезвие и очистить его с RNase обеззараживателя. Поместите очищенное лезвие в держатель лезвия на сцене.Затем очистите анти-ролл пластины с rNase обеззараживателя. Прикрепите очищенную пластину к сцене и подождите не менее 20 минут, пока лезвие и анти-ролл пластины спуститься к температуре криостата. Во-первых, вырезать небольшой кусочек ткани для секции, убедившись, что раздел составляет примерно 95%мозжечковой коры.Верните оставшуюся ткань либо в сухой лед, либо в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем начните медленно добавлять OCT поверх патрона медленным круговым движением. Создайте слои внебиржевого до тех пор, пока есть крепление высотой около трех миллиметров, покрывающее патрон.Когда OCT частично заморожены, но все еще имеет некоторую жидкость в центре, поместите ткани на вершине крепления. Пусть ткань сидеть на верхней части OCT в течение одной-двух минут, пока она полностью заморожена. Затем перенесите патрон с замороженным OCT и ткани в криостат резки руку.Отрегулируйте ткань так, чтобы она промыта режущей лезвием и позволила ткани сидеть в режущей руке в течение 20 минут, чтобы приспособиться к новой температуре. Наиболее важным шагом является позволяет ткани акклиматизироваться в криостат резки руку до тех пор, как это необходимо. Если ткани клочья, purkinje визуализации клеток будет очень трудно.Я рекомендую использовать меньшие, тонкие кусочки ткани, чтобы позволить ткани акклиматизироваться быстрее. После этого медленно переместите ткань ближе к лезвию. Как только ткань достигла лезвия, начните процесс обрезки.Обрезать ткани два-три раза, пока слои коры видны. Далее поместите и выровнять анти-ролл пластины чуть выше криостата лезвие. Вырезать четыре-шесть разделов, которые 14 микрометров толщиной, что правильно сократить разделы будут плоскими под анти-ролл пластины.Выровнять разрез разделы горизонтально через стадию криостата. Угол слайда, чтобы забрать все части ткани одновременно. Сразу же после раздела ткани, поместите слайд в держатель слайда с 70% этанола на льду в течение двух минут.Перенесите слайд на держатель слайда с 95%этанолом на льду в течение 45 секунд. Затем поместите слайд в держатель слайда со 100%-ти этанолом при комнатной температуре в течение двух минут. Опустите слайд три раза в держатель слайда, содержащий ксилен номер один при комнатной температуре.Затем поместите слайд в держатель слайда с ксиленом два при комнатной температуре в течение пяти минут. Стенд слайды в чистом капоте дыма и дайте им высохнуть воздух, по крайней мере 30 минут. При хранении слайдов поместите каждый из них в отдельную 50-миллилитровую трубку и поместите трубки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию на срок до семи дней.Во-первых, используйте обеззараживатель RNase для очистки стадии микроскопа и руки коллекции крышки. С руками в перчатках поместите слайд на микроскоп и 500 микролитер непрозрачной крышкой в руке коллекции. При низком увеличении, выровнять непрозрачный колпачок над мозжечковой ткани, заверив, что крышка охватывает всю область, которая визуализирована в глазу кусок.Используйте пять раз до 10 раз объективной визуализации мозжечковых слоев. Поместите курсор над секцией, где пересекаются молекулярный слой и слой гранулированных клеток. Перейти к 40 раз увеличение и визуализировать клетки purkinje.Затем начните захватывать их. Чтобы начать сбор РНК после микродиссекции, добавьте 50 микролитров буфера клеточного лиза к непрозрачной крышке с крышкой вверх. Аккуратно закройте трубку над крышкой и приступайте к сбору, как указано в текстовом протоколе.В этом протоколе, свежие, замороженные, посмертные, ткани человеческого мозга готовится для УФ-лазерного захвата микродиссекции. После секционирования криостата в отведенное время рисования, клеточные слои мозжечка легко видны с пятью и 10 раз объективными линзами. Как видно здесь, надлежащее инкубации ксилена вызывает ткани, чтобы стать темнее и лучше очерчивает клеточных слоев, чем этанол в одиночку.При резке на микроскоп захвата лазера, 40 раз объектив объектива требуется для обеспечения захвата только клетки purkinje, а не окружающие ткани. Как видно здесь, надлежащее инкубации в ксилен производит высокое качество морфологически нетронутыми изображения по сравнению с этанолом фиксации в одиночку. Способность скольжения крышки непрозрачной крышки после этого испытана пока другие протоколы используют жидкостн-заполненную крышку, эти крышки могут уменьшить визуализацию ткани и причинить приводящ к изображению быть гранулированным и радужным под микроскопом.Тем не менее, визуализация через непрозрачный колпачок приводит к гладкой ткани внешний вид, который мягче и острее по форме. Репрезентативные изображения вырезанных клеток пуркинье при низкой мощности и при высокой мощности показывают точное удаление только тела клетки пуркинье. После этого, высокое качество Rnase получается для последующего секвенирования РНК.Шесть репрезентативных образцов прошли экстракции РНК и были повторно использованы в 14 микролитров рнк свободной воды и все шесть образцов производится высокое качество РНК с РНК целостности номера равны или больше, чем восемь. Самое главное помнить, что качество тканей это все. Даже резки и слайд размещения сделает перерыв или этот протокол.После этой процедуры, любой метод, который исследует РНК или ДНК может быть выполнена, в частности, мы зонд нашей РНК для дифференциальной экспрессии генов, но другие вопросы, касающиеся регуляции генов также могут быть исследованы. Этот метод может быть применен к любому типу тканей, который имеет конкретные очерченные морфологии, которая не требует использования антигена или красителя конкретных реагентов для идентификации клеток, представляющих интерес. Мы надеемся, что этот метод поможет нам понять генетику основных тремор и других заболеваний, которые имеют тремор фенотипа.Наиболее опасным химическим веществом, используемым в этом протоколе, является ксилен. Она должна быть обработана должным образом в дым капот, утилизировать должным образом, и слайды должны быть разрешены для адекватного высыхания до тех пор, пока используется в открытом пространстве. Кроме того, при работе с образцами человека следует использовать биоопасное управление отходами и безопасность.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Высокое разрешение функциональной магнитно-резонансной томографии методы по правам мозга

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...