Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Los autores desean reconocer el cerebro Nueva York Banco, Dr. Jean Paul Vonsattel y Dr. Etty Cortés, por su asistencia en la corte y la preservación de las muestras de tejido de cerebro humano congelado para estos experimentos. Los autores desean reconocer las personas que generosamente donaron sus cerebros para la investigación continua en temblor esencial. Dr. Fausto y Dr. Martuscello agradece a Columbia University Departamento de patología y biología de la célula por su continuo apoyo y espacio de investigación de base. Los autores desean reconocer los NIH R01 NS088257 Louis/Fausto) de financiación de la investigación para este proyecto. Imágenes de LCM se realizaron en el Confocal y especializados microscopía compartido recursos del centro Herbert Irving integral cáncer en la Universidad de Columbia, apoyado por los NIH grant #P30 CA013696 (Instituto Nacional del cáncer). Los autores desean reconocer Theresa Swayne y Laura Munteanu su asistencia continua con microscopia especializada.

Todas las muestras humanas utilizadas en este protocolo se han obtenido con consentimiento informado y han sido aprobadas por la Junta interna de revisión (IRB) en la Universidad de Columbia y la Universidad de Yale.
Nota: La totalidad de este protocolo debe seguir RNA estricto manejo de las directrices, por el que se utiliza siempre una mano enguantada, todas las superficies se limpian con un descontaminador de RNasa y todos los materiales de trabajo son RNA/DNA/nucleasa gra...

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El protocolo presentado aquí es modificado específicamente para un enfoque inoxidable en visualizar morfológicamente distintos tejidos para UV-LCM. Este método está diseñado para maximizar la integridad del RNA para la posterior secuencia de RNA directa, manteniendo un mayor nivel de visualización de tejido. La capacidad de distinguir diferentes tipos de células para la captura, para crear la población pura de células posible, es esencial para la comprensión de diferentes perfiles moleculares en los tejidos hu...

Microdissection de la captura del laser (LCM) es una herramienta de investigación valiosa que permite la separación de células patológico relevantes para la posterior evaluación molecular conducida. El uso de análisis moleculares en estas muestras de tejido heterogéneo y la correlación con datos clínicos y patológicos es un paso necesario en la evaluación de la significación traslacional de la investigación biológica1. Al analizar los datos de la expresión del gene del RNA, el uso de secciones congeladas del tejido es muy recomendable ya que permite excelente calidad de RNA como maximiza cantidad2. Se ha establecido bien que alta calidad y la cantidad de RNA son esenciales para datos significativos de la secuencia de RNA3. Sin embargo, cuando se utiliza RNA de tejido fresco congelado post mortem para LCM, degradación de RNA es un gran desafío, como ocurre inmediatamente a la muerte y su extensión está mediada por diversos factores asociados con el tejido colección método4,5 . Además, degradación de RNA se exacerba cuando se necesitan técnicas de tinción para reconocer detalles histologic e identificación de la célula. Especializado de tinciones, como la hematoxilina & eosina, tinción de Nissl, inmunofluorescencia e inmunohistoquímica son útiles para distinguir las células del estroma circundante pero han demostrado que degradan RNA y alterar la expresión de la transcripción perfiles6. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha creado un protocolo inoxidable específicamente diseñado para preservar la RNA para los propósitos de la secuencia de RNA después de aislamiento de LCM de neuronas de Purkinje en cerebelo humano post-mortem.
En el proceso de tejido fresco congelado para LCM, el método de fijación variable puede afectar tejido y RNA integridad. La fijación con formol es estándar para la preservación morfológica, pero causas Cross-linking pueden fragmento de RNA e interferir con amplificación de RNA7. Fijación del etanol es una alternativa mejor para el aislamiento de RNA, ya que es un fijador coagulante que no induce el cross-linking1. Para mejorar la visualización de la morfología del tejido, xileno es la mejor opción, ya que elimina los lípidos de los tejidos. Sin embargo, se conocen limitaciones al utilizar xileno en LCM, como los tejidos pueden secarse y convertirse en frágiles causando fragmentación del tejido con láser captura7. Xileno es también una toxina volátil y debe ser manipulado correctamente en una campana de humos. Sin embargo, el xileno se ha demostrado para mejorar la visualización de tejido conservando también RNA integridad8. Por lo tanto, nuestro protocolo se centra en el uso de la fijación de etanol 70% y etanol deshidratación, seguido por incubación de xileno para claridad morfológica.
Es importante tener en cuenta los diferentes tipos de sistemas de Microdisección láser, como ha demostrado que difieren en la velocidad, precisión y calidad de RNA. El láser infrarrojo (IR) capture microdissection y los ultravioleta (UV) láser microhaz microdissection sistemas fueron ambas plataformas LCM novela que surgió casi al mismo tiempo8. El sistema IR-LCM emplea un "sistema de contacto" con una película termoplástica transparente colocada directamente en la sección del tejido y las células de interés selectivamente se adhieren a la película por impulsos de centrado de un laser del IR. Por otra parte, el sistema UV-LCM es un "sistema sin contacto", por el que un rayo láser enfocado corta las celdas o regiones de interés en el tejido; dependiendo de la configuración en dos plataformas comerciales actualmente disponibles que utilizan un diseño de microscopio invertido o vertical, tejido se adquiere en un dispositivo de recolección por una onda de presión inducida por láser que catapulta contra la gravedad o el tejido es recogida por gravedad, respectivamente. Ventajas significativas del sistema UV-LCM incluyen adquisición de celular más rápido, libre de contaminación la colección con el método de no contacto y disección más precisa debido a un mucho más pequeño laser viga diámetro9. Este protocolo fue diseñado específicamente para un sistema de UV-LCM y no ha sido probado en un sistema IR-LCM. En cualquier diseño de sistema UV-LCM, al acumular las células en la tapa de la colección, el uso de un cubreobjetos que mejora la claridad celular en microscopia no es conveniente, como las células sería incapaces de entrar en la tapa de la colección. Por lo tanto, para mejorar la visualización de tejido, probamos el uso de gorras de colección opaco, que están diseñados para actuar como un cubreobjetos para visualización microscópica en sistemas UV-LCM, contra tapas de colección llena líquido. Gorras de colección llena líquido pueden ser difícil, ya que el líquido está sujeto a evaporación y debe reemplazarse con frecuencia mientras trabajaba en el microscopio. Tiempo se convierte en un factor importante para la estabilidad del RNA, como el tejido capturado disuelve inmediatamente7.
Nuestro laboratorio estudia los cambios neuropathologic post mortem en el cerebelo de pacientes con temblor esencial (ET) y neurodegenerativos relacionados con trastornos del cerebelo. Hemos demostrado cambios morfológicos en las células de Purkinje que distinguen casos ET versus controles, incluyendo un número reducido de células de Purkinje, aumentaron de la regresión dendrítica y una variedad de cambios axonales, que nos lleva a postular que Purkinje degeneración celular es una característica biológica de base en ET patogenesia10,11,12,13. Transcripcional de perfiles se ha utilizado en muchas enfermedades neurológicas para explorar las bases moleculares subyacentes de los cambios degenerativos celulares. Sin embargo, pueden enmascarar la expresión de las transcripciones de baja abundancia o disminuir la detección de cambios moleculares que ocurren solamente en una pequeña población de afectados eficazmente perfiles transcripcionales de muestras heterogéneas, como las regiones de tejido cerebral, células, como células de Purkinje en la corteza cerebelosa. Por ejemplo, las células de Purkinje son ampliamente superados en número por las células del gránulo abundante en la corteza cerebelosa por aproximadamente 1: 3000; así, al objetivo eficazmente su transcriptoma requiere aislamiento específico de estas neuronas. La corteza cerebelosa está delineada por distintas capas que difieren en la densidad celular y el tamaño de la célula. Esta arquitectura celular es ideal para visualizar en una muestra de tejido congelado sin reactivos de tinción que contiene el tinte. En teoría, este protocolo también podría aplicarse a otros tipos de tejidos que tienen tejido distintivo similar organización.
Este protocolo fue diseñado para trabajar específicamente para visualización de células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem. Numerosos protocolos existen para la fijación, coloración visualización y RNA preservación de muchos tipos de tejidos para los propósitos de ambos LCM IR y UV. Cuando se contempla un diseño experimental para UV-LCM, individuos deben adaptar sus protocolos para adaptarse mejor a las necesidades y requisitos de inicio y fin de materiales. Aquí, se combinan muchos aspectos de diferentes protocolos de LCM para proporcionar un método mejorado para la visualización de las células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem sin necesidad de preparación de RNA de alta calidad para el transcriptoma de tinte que contiene reactivos de tinción secuencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
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a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Microdisección de captura láser (LCM) es una herramienta ventajosa que permite la acumulación de las células citológico o fenotípicamente pertinentes o regiones de tejidos heterogéneos. Producto capturado se puede utilizar en una variedad de métodos moleculares para proteínas, aislamiento de DNA o RNA. Sin embargo, la preservación del ARN del tejido de cerebro humano postmortem es especialmente desafiante. Técnicas de visualización estándar para LCM requieren histologic o procedimientos de tinción inmunohistoquímica que pueden degradarán RNA. Por lo tanto, hemos diseñado un protocolo de acero inoxidable para la visualización de LCM con la finalidad de preservar integridad de RNA en tejido de cerebro humano postmortem. La célula de Purkinje del cerebelo es un buen candidato para la visualización de acero inoxidable, debido a su tamaño y localización característica. La corteza cerebelosa tiene distintas capas que difieren en la densidad celular, lo que un buen arquetipo para identificar bajo el microscopio de alta magnificación. Las células de Purkinje son neuronas grandes, situadas entre la capa de células del gránulo, que es una red densamente celular de neuronas pequeñas, y la capa molecular, que es escasa en cuerpos de la célula. Gracias a esta arquitectura, el uso de acero inoxidable visualización es factible. Otros sistemas de órganos o células que imitan este fenotipo sería convenientes. El protocolo de acero inoxidable está diseñado para fijar tejido congelado con etanol y eliminar lípidos con xileno para mejorar la visualización morfológica bajo microscopia ligera de alta magnificación. Este protocolo no tiene en cuenta otros métodos de fijación y está diseñado específicamente para las muestras de tejido fresco congelado con una radiación ultravioleta (UV)-sistema LCM. Aquí, presentamos un protocolo completo para el seccionamiento y la fijación de tejido cerebeloso humano fresco congelado post mortem y la purificación del ARN de las células de Purkinje aisladas por UV-LCM, preservando calidad de RNA para la posterior secuenciación del RNA. En nuestras manos, este protocolo produce niveles excepcionales de visualización celular sin necesidad de coloración de los reactivos y rendimientos RNA con números altos de integridad de RNA (≥8) según sea necesario para los experimentos de perfilamiento transcripcionales.

Este protocolo describe los pasos para preparación de tejido de cerebro humano postmortem fresco congelado para UV-LCM. Anotaciones y especificaciones completa se dan para corte en criostato, ya que puede ser difícil cortar tejido cerebral congelado fresco con un alto grado de precisión. El punto más importante a considerar es que el tejido fresco congelado es extremadamente frío y requiere una cantidad significativa de tiempo para aclimatarse a la temperatura más caliente de un cri...

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A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Este protocolo utiliza un enfoque libre de manchas para visualizar y aislar a las células de Purkinje en tejido fresco congelado del cerebelo humano post-mortem mediante microdisección de captura láser. El propósito de este protocolo es generar cantidades suficientes de ARN de alta calidad para secuenciación del RNA.

Un protocolo de acero inoxidable para el aislamiento de ARN de alta calidad del Laser capturar las células Microdissected de Purkinje en el cerebelo humano Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Este protocolo es significativo, ya que utiliza un método de visualización libre de manchas en lugar de la visualización basada en tinte en el tejido cerebral humano post mortem, que ayuda a preservar la integridad del ARN. La preservación del ARN es una gran ventaja en este protocolo, ya que es útil, no sólo en el tejido cerebral humano post mortem, sino también en otros tipos de tejido, con alta actividad RNase. Para comenzar, retire el tejido del congelador y colóquelo sobre hielo seco para transportarlo al criostato.Coloque los cepillos limpios, el mandril y el tejido en el criostato durante al menos 20 minutos, para que alcancen la temperatura óptima. Para criostatos con cámaras duales y temperaturas de retención de muestras, ajuste la temperatura del objeto a menos 16 grados centígrados y la temperatura de la cámara a menos 18 grados centígrados. Establezca el espesor de sección del criostato en 14 micrómetros y el espesor de recorte en 30 micrómetros.A continuación, limpie el escenario con una mezcla uno a uno de descontaminador RNase y 70%etanol, para evitar la congelación. Obtenga una nueva hoja de criostato desechable y límpielo con el descontaminador RNase. Coloque la cuchilla limpia en el soporte de la cuchilla en el escenario.A continuación, limpie la placa antivuelco con el descontaminador RNase. Fije la placa limpia al escenario y espere al menos 20 minutos para que la cuchilla y la placa antivuelco bajen a la temperatura del criostato. Primero, corte un pequeño pedazo de tejido para segar, asegurándose de que la sección es aproximadamente 95%corteza cerebelosa.Devuelva el tejido restante al hielo seco o a un congelador, a menos 80 grados centígrados. A continuación, comience a agregar OCT lentamente en la parte superior del mandril con un movimiento lento y circular. Construir capas de OTC hasta que haya un montaje de aproximadamente tres milímetros de alto cubriendo el mandril.Cuando el PTU esté parcialmente congelado, pero todavía tiene algo de líquido en el centro, coloque los tejidos en la parte superior del soporte. Deje que el tejido se siente encima del PTU durante uno o dos minutos hasta que esté completamente congelado. A continuación, transfiera el mandril con el OCT y el tejido congelados al brazo de corte criostato.Ajuste el tejido de modo que quede al ras con la cuchilla de corte y deje que el tejido se siente en el brazo de corte durante 20 minutos para ajustarse a la nueva temperatura. El paso más crítico es permitir que el tejido se aclimate en el brazo de corte del criostato durante el tiempo que sea necesario. Si se tritura el tejido, la visualización de células de purkinje será muy difícil.Recomiendo usar trozos de tejido más pequeños y delgados, para permitir que el tejido se aclimate más rápido. Después de esto, mueva lentamente el tejido más cerca de la hoja. Una vez que el tejido haya llegado a la cuchilla, comience el proceso de recorte.Recorte el tejido de dos a tres veces, hasta que las capas de la corteza sean visibles. A continuación, coloque y alinee la placa estabilizadora justo encima de la hoja de criostato. Corte de cuatro a seis secciones de 14 micrómetros de espesor, teniendo en cuenta que las secciones correctamente cortadas serán planas debajo de la placa antivuelco.Alinee las secciones de corte horizontalmente a través de la etapa de criostato. Angulo una diapositiva para recoger todas las piezas de tejido simultáneamente. Inmediatamente después de secciones del tejido, coloque la corredera en el portaobjetos con 70% de etanol sobre hielo durante dos minutos.Transfiera la diapositiva a un portaobjetos con 95% de etanol sobre hielo durante 45 segundos. A continuación, coloque la diapositiva en el portaobjetos con 100% de etanol a temperatura ambiente durante dos minutos. Sumerja la diapositiva tres veces en el portaobjetos que contiene xileno número uno a temperatura ambiente.A continuación, coloque la diapositiva en el portaobjetos con xileno dos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Ponga los portaobjetos en una campana limpia y déjelos secar al aire durante al menos 30 minutos. Si almacena los portaobjetos, coloque cada uno en un tubo separado de 50 mililitros y coloque los tubos en un congelador a menos 80 grados Centígrados durante un máximo de siete días.En primer lugar, utilice el descontaminador RNase para limpiar la etapa del microscopio y el brazo de recogida de la tapa. Con las manos engunciadas, coloque la diapositiva en el microscopio y una tapa opaca de 500 microlitros en el brazo de la colección. Con un aumento bajo, alinee la tapa opaca sobre el tejido cerebeloso, asegurando que la tapa cubra toda el área que se visualiza en la pieza del ojo.Utilice un objetivo de cinco a 10 veces para visualizar las capas cerebelosas. Coloque el cursor sobre la sección donde se intersecan la capa molecular y la capa celular granual. Mover a un aumento de 40 veces y visualizar las células purkinje.Entonces, comienza a capturarlos. Para comenzar la recolección de ARN después de la microdisección, agregue 50 microlitros de tampón de lelisis celular a la tapa opaca con la tapa hacia arriba. Cierre cuidadosamente el tubo sobre la tapa y proceda con la colección como se describe en el protocolo de texto.En este protocolo, el tejido cerebral humano fresco, congelado, post mortem, se prepara para la microdisección de captura láser UV. Después de la sección del criostato en el tiempo de dibujo asignado, las capas celulares del cerebelo son fácilmente visibles con lentes objetivo cinco y 10 veces. Como se ve aquí, la incubación adecuada de xileno hace que el tejido se vuelva más oscuro y delinea mejor las capas celulares que el etanol solo.Al cortar en el microscopio de captura láser, se requiere la lente objetivo 40 veces para asegurar la captura de sólo células de purkinje y no el tejido circundante. Como se ve aquí, la incubación adecuada en xileno produce una imagen morfológicamente intacta de alta calidad en comparación con la fijación de etanol solo. La capacidad de deslizamiento de la cubierta de una tapa opaca se prueba entonces mientras que otros protocolos utilizan una tapa llena de líquido, estas tapas pueden reducir la visualización del tejido y hacer que la imagen resultante sea granular e iridiscente bajo el microscopio.Sin embargo, la visualización a través de una tapa opaca da como resultado la apariencia del tejido suavizado que es más suave y nítida en forma. Imágenes representativas de células de purkinje extirpadas a baja potencia y a alta potencia muestran una eliminación precisa del cuerpo de la célula de purkinje. Después de esto, se obtiene Rnase de alta calidad para la secuenciación posterior de ARN.Seis muestras representativas se sometieron a extracción de ARN y se resuspendieron en 14 microlitros de agua libre de arnse y las seis muestras produjeron ARN de alta calidad con números de integridad del ARN iguales o superiores a ocho. Lo más importante a recordar es que la calidad del tejido lo es todo. Incluso el corte y la colocación de diapositivas harán o romperán este protocolo.Después de este procedimiento, se podría realizar cualquier método que investigue el ARN o el ADN, específicamente sondemos nuestro ARN en busca de expresión génica diferencial, pero también podrían investigarse otras cuestiones relativas a la regulación genética. Este método podría aplicarse a cualquier tipo de tejido que tenga morfología delineada específica que no requiera el uso de antígeno o reactivos específicos del tinte para la identificación de células de interés. Esperamos que esta técnica nos ayude a entender la genética del temblor esencial y otras enfermedades que tienen un fenotipo de temblor.El producto químico más peligroso utilizado en este protocolo es el xileno. Debe manipularse correctamente en una campana de humo, desecharse correctamente y se debe permitir que las diapositivas se sequen adecuadamente hasta que se utilicen en un espacio abierto. Además, cuando se trabaja con muestras humanas, se debe utilizar la gestión de residuos biopeligrosos y la seguridad.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

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