Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Författarna vill erkänna New York hjärnan Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel och Dr. Etty Cortés, för deras hjälp i tillskärning och bevara de frysta mänskliga hjärnan vävnadsproverna för dessa experiment. Författarna vill erkänna de individer som generöst donerat sin hjärna för den fortsatta forskningen i essentiell Tremor. Dr. Faust och Dr Martuscello vill erkänna Columbia Universitet Institutionen för patologi och cellbiologi för deras fortsatta stöd och core forskning utrymme. Författarna vill erkänna NIH R01 NS088257 Louis/Faust) för finansiering av forskning för detta projekt. LCM bilder utfördes i Confocal och specialiserade mikroskopi delad resurs för Herbert Irving omfattande Cancer Center vid Columbia University, stöds av NIH bevilja #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Författarna vill erkänna Theresa Swayne och Laura Munteanu för deras fortsatta hjälp med specialiserade mikroskopi.

Alla mänskliga prover som utnyttjas i detta protokoll har erhållits med informerat samtycke och har godkänts av den interna granskning Board (IRB) vid Columbia University och Yale University.
Obs: Helheten av detta protokoll bör följa strikta RNA hantering riktlinjer, whereby en behandskade hand används alltid, alla ytor rengörs med ett RNase decontaminator och alla arbetsmaterial är RNA/DNA/Nuclease gratis.
1. testa RNA integritet vävnad fö...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Det protokoll som presenteras här är specifikt modifierad för att vara ett rostfritt tillvägagångssätt visualisera morfologiskt skilda vävnader för UV-LCM. Denna metod är utformad för att maximera RNA integritet för efterföljande direkt RNA-sekvensering, samtidigt som en förbättrad nivå av vävnad visualisering. Förmåga att skilja olika celltyper för capture, för att skapa den renaste befolkningen av celler som möjligt, är viktigt för att förstå olika molekylära profiler i mänskliga vävnader<su...

Laser fånga lokalt (LCM) är en värdefull forskningsverktyg som tillåter separation av patologiskt relevanta celler för efterföljande molekylärt driven utvärdering. Användning av molekylära analyser i dessa heterogena vävnadsprover och sambandet med patologiska och kliniska data är ett nödvändigt steg i utvärdera translationell betydelsen av biologisk forskning1. När man analyserar gen uttryck data från RNA, användning av frysta vävnadssnitt rekommenderas eftersom det ger utmärkt kvalitet av RNA som maximerad kvantitet2. Det har också fastställts att hög kvalitet och kvantitet av RNA är viktigt för meningsfulla data från RNA-sekvensering3. När du använder RNA från färsk fryst post mortem vävnad för LCM, är RNA nedbrytning dock en stor utmaning, eftersom det sker omedelbart efter döden och dess utsträckning medieras av olika faktorer som är förknippade med vävnad samling metod4,5 . Dessutom förvärras RNA nedbrytning när färgning tekniker behövs för att känna igen histologisk detaljer och cell identifiering. Specialiserade färgningsteknik, såsom hematoxylin och eosin, Nissl fläcken, immunofluorescens och immunohistokemi är till hjälp för att skilja celler från omgivande stroma men har visat sig försämra RNA och ändra avskrift uttryck profiler6. Vårt laboratorium har därför skapat ett rostfritt protokoll specifikt för att bevara RNA i postmortala mänskliga lillhjärnan för RNA-sekvensering efter LCM isolering av Purkinje nervceller.
I bearbetning färsk fryst vävnad för LCM, kan metoden fixering steglöst påverka både RNA och vävnad integritet. Formalin fixering är standard för morfologiska bevarande, men orsaker cross-linking som kan splittra RNA och störa RNA förstärkning7. Etanol fixering är ett bättre alternativ för RNA isolering, eftersom det är en coagulative fixativ som inte inducerar tvärbindande1. För att förbättra visualisering av vävnad morfologi, är xylen det bästa valet, eftersom det tar bort lipider från vävnaden. Men finns det kända begränsningar när du använder xylen i LCM, som vävnader kan torka ut och bli sprött orsakar vävnad fragmentering vid laser fånga7. Xylen är också ett flyktiga toxin och måste hanteras korrekt i dragskåp. Xylen har dock visats öka vävnad visualisering samtidigt bevara RNA integritet8. Därför kretsar våra protokoll kring användningen av 70% etanol fixering och etanol uttorkning, följt av xylen inkubation i morfologiska klarhet.
Det är viktigt att notera de olika typerna av laser-baserad lokalt system, som de har visat sig skiljer sig i hastighet, precision och RNA kvalitet. Infraröd (IR) lasern fånga lokalt och ultraviolett (UV) lasern microbeam lokalt system var båda roman LCM-plattformar som uppstod nästan samtidigt8. IR-LCM systemet använder ett ”kontakt system” med en transparent termoplast film placeras direkt på avsnittet vävnad och celler av intresse följa selektivt filmen av fokuserad pulser från en IR-laser. Alternativt, UV-LCM systemet är en ”icke-kontakt” whereby en fokuserade laserstrålen skär bort cellerna eller regioner av intresse i vävnaden; beroende på konfigurationen i två tillgängliga kommersiella plattformar som använder antingen en inverterad eller upprätt Mikroskop design, vävnad förvärvas i en samling av en laser-inducerad tryckvågen som katapulter det mot gravitationen eller vävnad är samlas in av gravitation, respektive. Betydande fördelar av UV-LCM systemet inkluderar snabbare cell förvärv, förorening-fri samling med beröringsfri metod och mer precisa dissektion på grund av en mycket mindre laser beam diameter9. Detta protokoll utformades specifikt för ett UV-LCM-system och har inte testats i ett IR-LCM-system. I antingen UV-LCM systemdesign, när ackumulerande celler i samlingen GJP, användning av ett täckglas som förbättrar är cellulär tydlighet under mikroskopi inte lämplig, som cellerna skulle kunna träda i den samling gemensamma jordbrukspolitiken. Därför, för att öka vävnad visualisering, vi testade användningen av ogenomskinlig collection lock, som är utformade för att fungera som ett täckglas för mikroskopiska visualisering i UV-LCM system, mot flytande fyllda samling caps. Flytande fyllda samling caps kan vara en utmaning då vätskan är föremål för avdunstning och måste bytas oftare medan du arbetar på mikroskopet. Tiden blir en viktig faktor för RNA stabilitet, som fångade vävnaden upplöser omedelbart7.
Vårt laboratorium studier efter döden neuropatologiska förändringar i lillhjärnan av patienter med essentiell tremor (ET) och relaterade neurodegenerativa sjukdomar av lillhjärnan. Vi har visat morphologic ändringar centrerad på Purkinje celler som skiljer ET fall jämfört med kontroller, inklusive minskat antal Purkinje celler, ökade dendritiska regression och en mängd axonal förändringar, leder oss till postulerar att Purkinje cell degeneration är en core biologiska funktion i ET patogenes10,11,12,13. Transkriptionell profilering har använts i många neurologiska sjukdomar för att utforska underliggande molekylära grunden för degenerativa cellförändringar. Dock kan transkriptionell profiler från heterogena prover, såsom vävnad hjärnregioner, effectually maskera uttryck för låg överflöd avskrifter eller minska detektion av molekylära förändringar som förekommer endast i en liten population av drabbade celler, såsom Purkinje celler i lillhjärnan cortex. Exempelvis är Purkinje celler kraftigt underläge av riklig granule celler i lillhjärnan cortex av ungefärligt 1:3000; således att effektivt rikta kräver deras transkriptom särskild isolering av dessa nervceller. Cerebellar cortex avgränsas av distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten och Cellstorlek. Denna cellulära arkitektur är idealisk att visualisera i ett färskfryst vävnadsprov utan som innehåller färgämnet färgning reagenser. I teorin, detta protokoll skulle också kunna tillämpas på andra vävnadstyper av som har liknande särskiljande vävnad organisation.
Detta protokoll var ämnad att arbeta specifikt för Purkinje celler visualisering i mänskliga postmortala lillhjärnan. Det finns även många protokoll, ofta för fixering, färgning visualisering och RNA bevarandet av många typer av vävnader vid tillämpningen av både IR - och UV-LCM. När överväger en experimentell design för UV-LCM, bör individer skräddarsy sina protokoll för att bäst passa behoven och kraven av start- och slutdatum material. Här kombinerar vi många aspekter av olika LCM protokoll att tillhandahålla en förbättrad metod för att visualisera Purkinje celler i postmortala mänskliga lillhjärnan utan färgämne som innehåller färgning reagenser att förbereda högkvalitativa RNA för transkriptom sekvensering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Laser fånga lokalt (LCM) är ett fördelaktigt verktyg som möjliggör insamling av cytologically och/eller fenotypiskt relevanta celler eller regioner från heterogen vävnader. Fångade produkten kan användas i en mängd olika molekylära metoder för protein, DNA eller RNA isolering. Bevarandet av RNA från efter döden mänsklig hjärnvävnad är dock särskilt utmanande. Standard visualiseringstekniker för LCM kräver histologisk eller immunhistokemisk färgning förfaranden som kan ytterligare försämra RNA. Därför har vi utformat ett rostfritt protokoll för visualisering i LCM med syftet att bevara RNA i postmortala mänsklig hjärnvävnad. Purkinje cellen av lillhjärnan är en bra kandidat för rostfritt visualisering, på grund av dess storlek och karakteristiska läge. Cerebellar cortex har distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten, vilket gör dem ett bra arketyp att identifiera under hög förstoring mikroskopi. Purkinje celler är stora nervceller som ligger mellan det granule celllagrar, som är ett tätt nät av små nervceller, och det molekylära lagret, som är gles i cellen organ. På grund av denna arkitektur är användningen av rostfritt visualisering genomförbart. Andra organ eller cell system som efterliknar denna fenotyp skulle också vara lämpliga. Det rostfria protokollet är utformat för att fixa färskfryst vävnad med etanol och ta bort lipider med xylen för förbättrade morfologiska Visualisering under hög förstoring ljusmikroskopi. Detta protokoll tar inte hänsyn till andra fixering metoder och är särskilt utformad för färskfryst vävnadsprover som tagits med en ultraviolett (UV)-LCM-systemet. Här presenterar vi ett komplett protokoll för snittning och fastställande färsk fryst postmortala mänsklig cerebellär vävnad och rening av RNA från Purkinje celler isoleras genom UV-LCM, samtidigt som RNA kvalitet för efterföljande RNA-sekvensering. I våra händer, detta protokoll producerar enastående nivåer av cellulära visualisering utan behov av färgning reagenser och avkastningar RNA med höga RNA integritet tal (≥8) som behövs för transkriptionell profilering experiment.

Detta protokoll Detaljer stegen för att förbereda färska frysta postmortala mänsklig hjärnvävnad UV-LCM. Grundlig specifikationer och anteckningar ges för kryostaten skärning, eftersom det kan vara svårt att skära färska frysta hjärnvävnad med en hög grad av precision. Den viktigaste punkten att överväga är att färsk fryst vävnad är extremt kallt och kräver en betydande mängd tid anpassa sig till en kryostat varmare temperatur. Detta steg kan inte forceras, och det k...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Detta protokoll används en fläck-fri metod för att visualisera och isolera Purkinje celler i färskfryst vävnad från mänskliga postmortala lillhjärnan via laser fånga lokalt. Syftet med detta protokoll är att generera tillräckliga mängder av hög kvalitet RNA för RNA-sekvensering.

Ett rostfritt protokoll för högkvalitativa RNA isolering från Laser fånga Microdissected Purkinje celler i människans postmortala lillhjärnan

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Detta protokoll är betydande, eftersom det utnyttjar en fläckfri visualiseringsmetod istället för färgämnesbaserad visualisering på post-mortem mänsklig hjärnvävnad, som hjälper till att bevara RNA-integritet. Bevarandet av RNA är en stor fördel i detta protokoll, eftersom det är användbart, inte bara i post-mortem mänskliga hjärnvävnad, men även andra vävnadstyper, med hög RNase aktivitet. Till att börja med ta bort vävnaden från frysen och placera den på torris för transport till kryostaten.Placera de rena borstarna, chucken och vävnaden i kryostaten i minst 20 minuter, så att de kan nå den optimala temperaturen. För kryostater med dubbla kammare och preparathållande temperaturer, ställ in objekttemperaturen till minus 16 grader Celsius och kammarens temperatur till minus 18 grader Celsius. Ställ cryostats sektionstjocklek på 14 mikrometer och trimtjockleken till 30 mikrometer.Därefter rengör scenen med en en-till-en blandning av RNase dekontaminator och 70%etanol, för att förhindra frysning. Skaffa ett nytt, disponibelt kryostatblad och rengör det med RNase decontaminator. Placera den rengjorda klingan i bladhållaren på scenen.Rengör sedan antirullningsplattan med RNase-dekontaminatorn. Fäst den rengjorda plattan på scenen och vänta minst 20 minuter för bladet och anti-rulle plattan att komma ner till temperaturen i kryostaten. Först skär en liten bit vävnad för snittning, se till att avsnittet är cirka 95%cerebellar cortex.Returnera den återstående vävnaden antingen till torris, eller en till en frys, vid minus 80 grader Celsius. Börja sedan långsamt lägga till OCT ovanpå chucken med en långsam, cirkulär rörelse. Bygg upp lager av OTC tills det finns ett fäste som är ungefär tre millimeter högt som täcker chucken.När OCT är delvis fryst, men fortfarande har en del vätska i mitten, placera vävnaderna ovanpå fästet. Låt vävnaden sitta ovanpå ULT i en till två minuter tills den är helt frusen. Överför sedan chucken med den frusna LY OCT och vävnaden i cryostat skärarmen.Justera vävnaden så att den är i jämnhöjd med skärbladet och låt vävnaden sitta i skärarmen i 20 minuter för att anpassa sig till den nya temperaturen. Det mest kritiska steget är att låta vävnaden acklimatisera sig i kryostatskärarmen så länge det behövs. Om vävnad strimlar, kommer purkinje cell visualisering vara mycket svårt.Jag rekommenderar att du använder mindre, tunnare bitar av vävnad, för att låta vävnaden att acklimatisera snabbare. Efter detta, långsamt flytta vävnaden närmare bladet. När vävnaden har nått bladet, påbörjar trimningsprocessen.Trimma vävnaden två till tre gånger, tills cortexlagren är synliga. Därefter placera och rikta in anti-rulle plattan strax ovanför kryostatbladet. Skär fyra till sex sektioner som är 14 mikrometer tjocka, och kan att ordentligt skurna sektioner kommer att vara platt under anti-rulle plattan.Rikta in snittsektionerna horisontellt över kryostatstadiet. Vinkla en bild för att plocka upp alla vävnad bitar samtidigt. Omedelbart efter att vävnaden har snittparti, placera du objektglaset i glidhållaren med 70%etanol på is i två minuter.Överför glidbanan till en glidhållare med 95%etanol på is i 45 sekunder. Därefter placerar du bilden i bildhållaren med 100%etanol i rumstemperatur i två minuter. Doppa glidglaset tre gånger i bildhållaren som innehåller xylen nummer ett i rumstemperatur.Placera sedan glidbanan i bildhållaren med xylen två i rumstemperatur i fem minuter. Ställ upp rutschkanorna i en ren rökhuva och låt dem lufttorka i minst 30 minuter. Om du förvarar rutschbanorna, placera var och en i ett separat 50 milliliterrör och placera rören i en frys på minus 80 grader Celsius i upp till sju dagar.Använd först RNase decontaminator för att rengöra mikroskopstadiet och cap-samlingsarmen. Med handskar händer, placera bilden på mikroskopet och en 500 microliter ogenomskinlig mössa i samlingen armen. Vid en låg förstoring, rikta in den ogenomskinliga locket över cerebellär vävnaden, försäkra att locket täcker hela området som visualiseras i ögonstycket.Använd en fem gånger till 10 gånger objektiv för att visualisera cerebellarlagren. Placera markören över det avsnitt där molekylskikt och granuala cellskikt skär varandra. Flytta till en 40 gånger förstoring och visualisera purkinjecellerna.Sedan börjar fånga dem. För att påbörja RNA-insamling efter mikrodissektionen, tillsätt 50 mikroliter av celllysbuffert till den ogenomskinliga locket med locket uppåt. Stäng försiktigt röret över locket och fortsätt med samlingen enligt textprotokollet.I detta protokoll, färska, frysta, post-mortem, mänskliga hjärnvävnaden är förberedd för UV-laser fånga mikrodissektion. Efter cryostat s snittning i den tilldelade rittiden, de cellulära skikten av lillhjärnan är väl synliga med fem gånger och 10 gånger objektiv objektiv. Som ses här, rätt xylen inkubation orsakar vävnaden att bli mörkare och bättre beskriver cellulära lager än etanol ensam.Vid skärning vid laserfångst mikroskop, 40 gånger objektivet krävs för att säkerställa att fånga endast purkinjeceller och inte den omgivande vävnaden. Som sett här, korrekt inkubation i xylen ger en hög kvalitet morfologiskt intakt bild när man jämför med etanol fixering ensam. Locket slip förmåga en ogenomskinlig mössa testas sedan medan andra protokoll utnyttja en vätskefylld mössa, dessa lock kan minska vävnad visualisering och orsaka den resulterande bilden vara granulat och iriserande under mikroskopet.Visualisering genom en ogenomskinlig mössa resulterar dock i det slätade vävnadsutseendet som är mjukare och skarpare i form. Representativa bilder av strukna purkinjeceller på låg effekt och vid hög effekt visar exakt avlägsnande av bara purkinjecellkroppen. Efter detta erhålls hög kvalitet Rnase för efterföljande RNA-sekvensering.Sex representativa prover genomgick RNA-extraktion och återanvändes i 14 mikroliter rna Rnase-fritt vatten och alla sex prover producerade hög kvalitet RNA med RNA integritet nummer lika med eller större än åtta. Det viktigaste att komma ihåg är att vävnadskvalitet är allt. Även skära och glida placering kommer att göra eller bryta detta protokoll.Efter detta förfarande, någon metod som undersöker RNA eller DNA skulle kunna utföras, specifikt vi sond vår RNA för differentiell gen uttryck, men andra frågor om genreglering kan också undersökas. Denna metod skulle kunna tillämpas på alla vävnadstyp som har specifik avgränsad morfologi som inte kräver användning av antigen eller färgämnesspecifika reagenser för identifiering av celler av intresse. Vi hoppas att denna teknik kommer att hjälpa oss att förstå genetiken hos essentiella tremor och andra sjukdomar som har en tremor fenotyp.Den farligaste kemikalien som används i detta protokoll är xylen. Det bör hanteras på rätt sätt i en rökhuv, kasseras på rätt sätt, och diabilder bör tillåtas att torka tillräckligt tills de används i ett öppet utrymme. Dessutom, när man arbetar med mänskliga prover, biologiskt risk avfallshantering, och säkerhet bör användas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Icke-Laser Capture Mikroskopi metoden för Microdissection diskreta Regioner Mouse Brain för Total RNA Isolering och nedströms nästa generations sekvensering och Gene expression profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Högupplösta functional magnetic resonance imaging metoder för Human mitthjärnan

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture Microdissection av nervceller från Differentierad Human Neuroprogenitor Celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion av RNA för transkriptomisk analys från mus ryggmärg motor neuron cellkroppar av laser capture mikrodissektion

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolering av Distinkta cellpopulationer från utvecklings Cerebellum från Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissection - En demonstration av Isolering av Individuell dopaminneuroner och hela Ventrala tegmentområdet

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...