Name: a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

Yazarlar, New York beyin banka, Dr. Jean Paul Vonsattel ve Dr. Etty Cortés, kesme ve donmuş insan beyin doku örnekleri bu deneyler için koruma onların yardımını kabul etmek istiyorum. Yazarlar kim cömertçe esansiyel Tremor devam eden araştırma için onların beyin bağışlanan bireylerin kabul etmek istiyorum. Doktor Faust ve Dr Martuscello Columbia Üniversitesi patoloji bölümü ve hücre biyolojisi onların sürekli destek ve çekirdek araştırma alanı için kabul etmek istiyorum. Yazarlar NIH R01 NS088257 Louis/Faust kabul etmek istiyorum) Bu proje için araştırma fonu için. LCM görüntüleri Confocal içinde gerçekleştirilen ve ihtisas mikroskobu paylaşılan kaynak-Herbert Irving kapsamlı Kanser Merkezi, Columbia Üniversitesi, NIH tarafından desteklenen hibe #P30 CA013696 (Ulusal Kanser Enstitüsü). Yazarlar Theresa Swayne ve Laura Munteanu özel mikroskobu ile devam eden onların yardımını kabul etmek istiyorum.

Bu protokol için kullanılan tüm insan örneklerini onam ile elde edilen ve Columbia Üniversitesi ve Yale Üniversitesi İç İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.
Not: Bu iletişim kuralının tamamı katı RNA yönergeleri, işleme takip etmeli sayede eldivenli elini her zaman kullanıldığında, tüm yüzeyler RNase decontaminator ile temizlenir ve RNA/DNA/nükleaz ücretsiz tüm çalışma malzemelerdir.
1. doku başlayan okek ö...

<ol>
	<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist.">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality.">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA.">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97 (2006).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).</li><li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used.">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li><li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).</li><li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor:+From+models+to+morphology.">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li><li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor:+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis.">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+changes+in+essential+tremor:+33+cases+compared+with+21+controls.">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , 3297-3307 (2007).</li><li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathologic+findings+in+essential+tremor.">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection.">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li><li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection.">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus.">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ.">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples.">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons.">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues:+results+from+a+rapid+human+autopsy+program.">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carl Zeiss Microscopy. , (2012).</li></ol>

Burada sunulan Protokolü özellikle morfolojik farklı dokuların UV-LCM için görselleştirme Paslanmaz bir yaklaşım olarak değiştirilir. Bu yöntem doku görselleştirme geliştirilmiş bir düzeyde muhafaza süre sonraki doğrudan RNA sıralama, RNA bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. İnsan doku15farklı moleküler profilde anlamak için gerekli hücrelerin en saf nüfus mümkün oluşturmak için farklı hücre tipleri için yakalama, ayırt etmek için ye...

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) sonraki tatlı tahrik değerlendirme için patolojik olarak ilgili hücreleri ayırma verir bir değerli araştırma aracıdır. Moleküler analiz bu türdeş olmayan doku örnekleri ve korelasyon patolojik ve klinik verilerle biyolojik araştırma1translasyonel önemini değerlendirmek gerekli bir adım kullanmaktır. Gen ifadesi verileri RNA üzerinden analiz ederken, donmuş doku bölümleri kullanımını RNA mükemmel kalitesi için verdiğinden önerilir yanı sıra miktar2ekranı kaplamış. Evet yüksek kalite ve RNA miktarı RNA sıralama3den anlamlı veriler için gerekli olan kurulmuştur. Ancak, RNA LCM için taze donmuş post-mortem doku kullanırken, RNA bozulması büyük bir sorun, ölümü üzerine hemen gerçekleşir ve ölçüde kendi doku toplama Yöntem4ile,5 ilişkili çeşitli faktörler tarafından aracılık ettiği gibi olduğunu . Ayrıca, boyama teknikleri histolojik ayrıntıları ve hücre kimliğini tanımak için gerektiğinde RNA bozulması şiddetlenir. Hematoksilen ve eozin, Nisl leke gibi teknikleri boyama İhtisas ayirt ve immünhistokimya çevreleyen stroma hücreleri ayırt yararlı ama RNA aşağılamak ve transkript ifade değiştirmek için gösterilen profilleri6. Bu nedenle, bizim laboratuvar RNA öldükten sonra insan beyincik LCM yalıtım Purkinje nöronların sonra RNA sıralama amaçları için korumak için özel olarak tasarlanmış bir paslanmaz protokol yarattı.
Taze donmuş doku LCM için işleme, fiksasyon yöntemi degisken RNA ve doku bütünlüğü etkileyebilir. Formalin fiksasyon morfolojik korunması için standart, ancak bu cross-linking nedenleri RNA parçası ve RNA amplifikasyon7ile müdahale. 1cross-linking teşvik değil koagülatif bir sabitleştirici olarak etanol fiksasyon RNA izolasyonu için daha iyi bir alternatiftir. Lipidler dokudan kaldırır gibi doku morfoloji görselleştirme, ksilen en iyi seçenek, artırmaktır. Ancak, orada sınırlamalar ne zaman belgili tanımlık doku kurumasına ve kırılgan neden doku parçalanma üzerine lazer yakalama7haline LCM, ksilen kullanan denir. Ksilen da uçucu bir toksin ve düzgün bir duman mahallede ele alınması gerekir. Yine de, ksilen doku görselleştirme Ayrıca RNA bütünlük8koruma sırasında artırmak için gösterilmiştir. Bu nedenle, bizim iletişim kuralı kullanımı % 70 etanol fiksasyon ve etanol dehidratasyon, ksilen kuluçka morfolojik netlik için ardından etrafında merkezleri.
Onlar hızlı, hassas ve RNA kalite farklı gösterildiği gibi farklı türde mikrodiseksiyon lazer tabanlı sistemleri, unutmamak önemlidir. Kızılötesi (IR) lazer yakalama mikrodiseksiyon ve ultraviyole (UV) lazer microbeam mikrodiseksiyon sistemleri neredeyse aynı anda8ortaya her iki roman LCM platform olduğunu. IR-LCM sistem "doğrudan doku bölümüne yerleştirilen bir şeffaf termoplastik film kullanarak bir iletişim sistemi" istihdam ve ilgi hücreleri seçerek film tarafından odaklı bakliyat bir IR Lazer uygun. Alternatif olarak, UV-LCM sistemidir "bir temassız sistem sayede odaklı lazer ışını uzakta hücreleri ya da doku; ilgi bölgelerinde keser" bir ters veya dik mikroskop tasarımı kullanma iki mevcut ticari platformlarda yapılandırmasına doku içine bir koleksiyon aygıt yerçekimine karşı mancınık bir lazer kaynaklı basınç dalgası tarafından kazanılır veya doku sırasıyla yerçekimi tarafından toplanan. UV-LCM sisteminin önemli avantajı daha hızlı hücre satın alma, temassız yaklaşım ve daha kesin diseksiyon nedeniyle bir çok küçük lazer ışın çapı9ile kirlenme ücretsiz toplama içerir. Bu iletişim kuralı bir UV-LCM sistemi için özel olarak tasarlanmıştır ve bir IR-LCM sisteminde test edilmemiştir. Koleksiyon kap içine biriken hücreler, bir coverslip kullanımını artırır hücreleri toplama kap girmek mümkün olacak gibi ya da UV-LCM sistem tasarımı, hücresel netlik mikroskobu sırasında uygun, değildir. Bu nedenle, doku görselleştirme geliştirmek için karşı sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar UV-LCM sistemlerindeki mikroskobik görüntüleme için bir coverslip olarak hareket için tasarlanmıştır opak koleksiyonu büyük harf kullanımını test ettik. Sıvı buharlaşma tabidir ve mikroskop çalışırken sık sık değiştirilmesi gerekir gibi sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar, zor olabilir. Yakalanan doku hemen7çözülür gibi zaman RNA istikrar için önemli bir faktör haline gelir.
Beyincik esansiyel tremor (ET) hastalarda ve beyincik ilgili nörodejeneratif bozuklukları öldükten sonra neuropathologic değişimler bizim laboratuvar çalışmaları. Biz morfolojik değişiklikler ET durumlarda denetimleri, Purkinje hücreleri, azaltılmış bir dizi de dahil olmak üzere karşı ayırt Purkinje hücreleri merkezli arttı dendritik regresyon ve çeşitli aksonal değişikliklere, bize önermeyi önde gelen göstermiştir bu Purkinje hücre dejenerasyonu çekirdek biyolojik ET Patogenez10,11,12,13özelliğidir. Transkripsiyon profil oluşturma birçok nörolojik hastalıklarda dejeneratif hücresel değişiklikler temel alınan moleküler temeli keşfetmek için kullanılmıştır. Ancak, beyin doku bölgeleri gibi heterojen örnekleri transkripsiyon profillerden effectually düşük bereket transkript ifade maske ve/veya etkilenen, sadece küçük bir nüfus içinde moleküler değişiklikler tespiti azaltmak serebellar korteksin Purkinje hücreleri gibi hücrelerin. Örneğin, Purkinje hücreleri büyük ölçüde serebellar korteksin bol granül hücrelerde tarafından yaklaşık 1:3000 tarafından sayıca; Böylece, etkili bir şekilde hedef için onların transcriptome bu nöronların belirli yalıtımı gerektirir. Serebellar korteksin farklı hücre yoğunluğu ve hücre boyutu farklı katmanları tarafından belirlendi. Bu hücresel mimarisi boyama reaktif boya içeren olmadan taze donmuş doku örneği görselleştirmek idealdir. Teorik olarak, bu iletişim kuralını da benzer farklı doku var diğer doku türlerine uygulanabilir organizasyon.
Bu protokol insan öldükten sonra beyincik Purkinje hücre görselleştirme için özel olarak çalışmak üzere tasarlanmıştır. Görselleştirme ve dokuların birçok türde RNA koruma, her iki IR - ve UV-LCM amaçlı boyama fiksasyon için çok sayıda protokoller bulunmaktadır. Ne zaman UV-LCM için deneysel bir tasarım düşünürken, bireylerin ihtiyaçları ve başlangıç ve bitiş malzeme gereksinimlerini en iyi sığacak şekilde onların Protokolü terzi. Burada, biz öldükten sonra insan beyincik boya boyama reaktifler içeren yüksek kaliteli RNA transcriptome için hazırlamak gerek kalmadan Purkinje hücreleri görüntülenmesi için geliştirilmiş bir yöntem sağlamak için farklı LCM iletişim kuralları, bir çok yönünü birleştirmek sıralama.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MembraneSlide NF 1.0 PEN</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9081-000</td>
			<td style="width:488px;">Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AdhesiveCap 500 Opaque</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">415190-9201-000</td>
			<td style="width:488px;">Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:147px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7005-11</td>
			<td style="width:488px;">Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:147px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">2701</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylenes (Certified ACS)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5P-1GAL</td>
			<td style="width:488px;">If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td style="width:488px;">Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-Fix Slide Jars</td>
			<td style="width:147px;">Evergreen</td>
			<td style="width:119px;">240-5440-G8K</td>
			<td style="width:488px;">Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um</td>
			<td style="width:147px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">14041933980</td>
			<td style="width:488px;">Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5758-50mL</td>
			<td style="width:488px;">DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td style="width:488px;">Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td style="width:488px;">Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to &#39;chuck&#39;.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4280L</td>
			<td style="width:488px;">Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica Microsystems 3P&#160;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0558768</td>
			<td style="width:488px;">Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:488px;">Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:488px;">Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:488px;">Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Globe Scientific&#160;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-010-092</td>
			<td style="width:488px;">Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stainless protocol for high quality rna isolation from laser capture microdissected purkinje cells in the human post-mortem cerebellum

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) ve cytologically/veya phenotypically ilgili hücreleri veya hànzú doku bölgelerden topluluğu için sağlayan avantajlı bir araçtır. Yakalanan ürün-ebilmek var olmak kullanılmış içinde çeşitli protein, moleküler Yöntemler DNA veya RNA izolasyon. Ancak, ölüm sonrası insan beyin dokusundan RNA'ın koruma özellikle meydan okuyor. LCM için standart görselleştirme teknikleri histolojik gerektirmez veya RNA immunohistokimyasal boyama işlemleri daha da fazla bozulmasına yol açar. Bu nedenle, biz paslanmaz bir protokol RNA bütünlük öldükten sonra insan beyin dokusu içinde korunması amacı ile LCM içinde görüntüleme için tasarlanmıştır. Beyincik Purkinje hücre boyutu ve karakteristik konumu nedeniyle paslanmaz görselleştirme için iyi bir adaydır. Serebellar korteksin hücre yoğunluğu, yapım onları yüksek büyütme mikroskobu altında tanımlamak için iyi bir güzel örneği farklı farklı katmanları vardır. Purkinje hücreleri küçük nöronlar yoğun hücresel ağdır, granül hücre katmanı ve hücre gövdelerinde seyrek moleküler katmanı arasında yer alan büyük nöronlar vardır. Bu mimarisi nedeniyle, paslanmaz görselleştirme kullanımı mümkün olduğunu. Bu fenotip taklit diğer organ veya hücre sistemleri de uygun olacaktır. Paslanmaz Protokolü taze donmuş doku etanol ile düzeltmek ve lipidler yüksek büyütme ışık mikroskobu altında geliştirilmiş morfolojik görselleştirme için ksilen ile kaldırmak için tasarlanmıştır. Bu iletişim kuralı için diğer fiksasyon yöntemleri hesaba katmaz ve bir ultraviyole (UV) kullanarak yakalanan taze donmuş doku örnekleri için özel olarak tasarlanmıştır-LCM sistem. Burada, kesit ve taze donmuş öldükten sonra insan serebellar dokusu ve arıtma RNA'ın UV-LCM tarafından sonraki RNA-sıralama için RNA kalitesini koruyarak izole Purkinje hücrelerinden sabitleme için tam bir iletişim kuralı mevcut. Bizim ellerde bu protokolü reaktifler boyama gerek kalmadan hücresel görselleştirme olağanüstü düzeyde üretir ve RNA yüksek RNA bütünlük sayılarla (≥8) transkripsiyon profil oluşturma denemeleri için gerektiği gibi verimleri.

Bu iletişim kuralı taze donmuş öldükten sonra insan beyin dokusu UV-LCM için hazırlanması için gereken adımları ayrıntılı. Taze donmuş beyin dokusu duyarlık yüksek düzeyde kesmek zor olabilir gibi ayrıntılı özellikleri ve ek açıklamaları cryostat kesme için verilir. En önemli nokta göz önünde taze donmuş doku aşırı soğuk ve bir cryostat daha sıcak sıcaklık alışmana için zaman önemli miktarda gerektirir olmasıdır. Bu adımı aceleye gelmez ve nas...

Watch this Scientific Journal Video about A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum at JoVE.com

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Bu iletişim kuralı bir leke içermeyen yaklaşım görselleştirmek ve insan öldükten sonra beyincik lazer yakalama mikrodiseksiyon üzerinden taze donmuş dokudan Purkinje hücreleri izole etmek için kullanır. Bu iletişim kuralının amacını RNA-sıralama için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA üretmektir.

Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Bu protokol önemli, çünkü post-mortem insan beyin dokusunda boya bazlı görselleştirme yerine lekesiz bir görselleştirme yöntemi kullanır, bu da RNA bütünlüğünükorumaya yardımcı olur. RNA korunması bu protokolde büyük bir avantajdır, bu yararlıdır, sadece post-mortem insan beyin dokusu, ama aynı zamanda diğer doku tipleri, yüksek RNase aktivitesi ile. Başlamak için, dondurucudan doku çıkarın ve kriyostat taşınması için kuru buz üzerine yerleştirin.En uygun sıcaklığa ulaşmalarını sağlamak için temiz fırçaları, chuck'ı ve dokuyu en az 20 dakika kriyostatiçine yerleştirin. Çift odacıklı ve numune tutma sıcaklığına sahip kriyostatlar için nesne sıcaklığıeksi 16 derece, oda sıcaklığı eksi 18 dereceye ayarlayın. Kriyostat'ın kesit kalınlığını 14 mikrometreye, döşeme kalınlığını 30 mikrometreye ayarlayın.Daha sonra, donma önlemek için RNase dekontamine oridi ve% 70 etanol bire bir karışımı ile sahne temizleyin. Yeni, tek kullanımlık kriyostat bıçak edinin ve RNase dekontalüile temizleyin. Temizlenmiş bıçağı sahnedeki bıçak tutucuya yerleştirin.Daha sonra anti-roll plakasını RNase dekontalüor ile temizleyin. Temizlenmiş plakayı sahneye takın ve bıçağın ve anti-roll plakasının kriyostat sıcaklığına inmesini en az 20 dakika bekleyin. İlk olarak, kesit için doku küçük bir parça kesilmiş, bu bölüm yaklaşık% 95 serebellar korteks olduğundan emin olun.Kalan dokuyu eksi 80 derecede kuru buza veya dondurucuya geri getirin. Daha sonra, yavaş, dairesel bir hareket le yavaşça chuck üstüne OCT eklemeye başlayın. Yaklaşık üç milimetre yüksekliğinde bir montaj chuck kapsayan kadar OTC katmanları oluşturun.OCT kısmen dondurulmuş, ancak hala merkezinde bazı sıvı olduğunda, montaj üstüne dokuları yerleştirin. Doku tamamen dondurulana kadar bir ila iki dakika için OKT üstüne oturalım. Sonra, dondurulmuş OKT ve doku ile chuck transfer kriyostat kesme koluiçine.Dokuyu kesme bıçağıyla temizleyebilsin diye ayarlayın ve yeni sıcaklığa uyum sağlamak için dokunun kesme kolunda 20 dakika beklemesine izin verin. En kritik adım, dokunun kriyostat kesme kolunda gerektiği kadar alışmasını sağlamaktır. Doku parçalanırsa, purkinje hücre görselleştirmesi çok zor olacaktır.Ben doku daha hızlı alışmak için izin vermek için doku daha küçük, ince parçaları kullanmanızı öneririz. Bundan sonra, yavaş yavaş bıçak yakın doku hareket ettirin. Doku bıçak ulaştıktan sonra, kesme işlemi başlar.Korteks tabakaları görünene kadar dokuyu 2-3 kez kırpın. Daha sonra, anti-roll plakasını kriyostat bıçağının hemen üzerine yerleştirin ve hizalayın. 14 mikrometre kalınlığında dört ila altı bölüm keserek, düzgün kesilmiş kesitlerin anti-roll plakasının altında düz olacağını belirtin.Kesme bölümlerini kriyostat aşamasında yatay olarak hizalayın. Açı aynı anda tüm doku parçaları almak için bir slayt. Dokuyu kesitle dikten hemen sonra, slaytı iki dakika boyunca %70 etanolile buza yerleştirin.Slaytı 45 saniye boyunca buz üzerinde %95 etanol içeren bir slayt tutucuya aktarın. Daha sonra, slaytı iki dakika oda sıcaklığında %100 etanolile slayt tutucuya yerleştirin. Slaytı oda sıcaklığında bir numaralı ksilen içeren slayt tutucuya üç kez batırın.Daha sonra, slaytı slayt tutucuya ksilen iki ile oda sıcaklığında beş dakika yerleştirin. Temiz bir duman kaputunda slaytlar standı ve onları en az 30 dakika kuru hava sağlar. Slaytları depolarken, her birini ayrı bir 50 mililitrelik tüpe yerleştirin ve tüpleri eksi 80 derecede yedi güne kadar dondurucuya yerleştirin.İlk olarak, mikroskop aşamasını ve kapak toplama kolunu temizlemek için RNase dekontamine oramasını kullanın. Eldivenli ellerle, slaytı mikroskoba ve 500 mikrolitrelik opak kapağı toplama koluna yerleştirin. Düşük büyütme de, serebellar doku üzerinde opak kap hizalamak, bu kap göz parçası görselleştirilmiş tüm alanı kapsadığını sigortalayan.Serebellar katmanları görselleştirmek için beş kez ila 10 kez objektif kullanın. İmleci moleküler tabaka ve granül hücre tabakasının kesiştiği bölümün üzerine yerleştirin. 40 kat büyütme ye geçin ve purkinje hücrelerini görselleştirin.Sonra, onları yakalamaya başlayın. Mikrodiseksiyondan sonra RNA koleksiyonuna başlamak için, kapağı yukarı bakacak şekilde opak kapak için 50 mikrolitre hücre lisis tamponu ekleyin. Tüpü kapağın üzerine dikkatlice kapatın ve metin protokolünde belirtildiği gibi koleksiyona devam edin.Bu protokolde, taze, dondurulmuş, post-mortem, insan beyin dokusu UV lazer yakalama mikrodizise için hazırlanır. Kriyostat'ın ayrılan çizim süresiiçinde kesilmesinden sonra, beyinciğin hücresel katmanları beş kat ve 10 kat objektif merceklerle kolayca görülebilir. Burada görüldüğü gibi, uygun ksilen kuluçka doku koyu ve daha iyi tek başına etanol daha hücresel katmanları ortaya çıkarmak neden olur.Lazer yakalama mikroskobu keserken, 40 kez objektif lens sadece purkinje hücreleri değil, çevreleyen doku yakalama sağlamak için gereklidir. Burada görüldüğü gibi, ksilen uygun kuluçka sadece etanol fiksasyonu ile karşılaştırıldığında yüksek kaliteli morfolojik olarak bozulmamış görüntü üretir. Diğer protokoller sıvı dolu bir kapak kullanırken opak bir kapağın kapak kayma yeteneği test edilir, bu kapaklar doku görselleştirmesini azaltabilir ve ortaya çıkan görüntünün mikroskop altında taneli ve yanardöner olmasına neden olabilir.Ancak, opak bir kapak ile görselleştirme yumuşak ve formda keskin pürüzsüzleştirilmiş doku görünümünü sonuçlanır. Düşük güçte ve yüksek güçte eksinyeden çıkarılan purkinje hücrelerinin temsili görüntüleri sadece purkinje hücre gövdesinin hassas bir şekilde ortadan kaldırıldığını göstermektedir. Bundan sonra, yüksek kaliteli Rnase sonraki RNA sıralama için elde edilir.Altı temsili numune RNA ekstraksiyonuna alındı ve 14 mikrolitre Rna-free su ile yeniden askıya alındı ve altı numune de sekize eşit veya daha büyük RNA bütünlüğü sayılarına sahip yüksek kaliteli RNA üretti. Hatırlanması gereken en önemli şey doku kalitesi her şeydir. Hatta kesme ve slayt yerleşimi bu protokolü yapar veya kırar.Bu prosedürü takiben, RNA veya DNA'yı araştıran herhangi bir yöntem yapılabilir, özellikle diferansiyel gen ekspresyonu için RNA'mızı inceleriz, ancak gen regülasyonu ile ilgili diğer sorular da araştırılabilir. Bu yöntem, ilgi hücrelerinin belirlenmesi için antijen veya boyaya özgü reaktiflerin kullanılmasını gerektirmeyen özel şekillenmiş morfolojiye sahip herhangi bir doku tipine uygulanabilir. Bu tekniğin, esansiyel titreme ve titreme fenotipine sahip diğer hastalıkların genetiğini anlamamıza yardımcı olacağını umuyoruz.Bu protokolde kullanılan en tehlikeli kimyasal ksilen'dir. Bir duman kaputunda düzgün bir şekilde ele alınmalı, düzgün bir şekilde atılmalı ve slaytların açık bir alanda kullanılana kadar yeterince kurumasına izin verilmelidir. Ayrıca, insan örnekleri ile çalışırken, biyolojik atık yönetimi ve güvenlik kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...