Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

يشكر المؤلفون تشو Y. لتعليقاتها على المخطوطة. وأيد البحث عنها في هذا المنشور جزئيا المعهد الوطني للسرطان من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم P30CA034196. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

<ol>
	<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+at+40:+past,+present+and+future.">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li><li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping.">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li><li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation:+insights+from+and+for+human+disease.">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li><li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+reads:+their+purpose+and+place.">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li><li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing.">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads.">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li><li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing.">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer.">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li><li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+decades+of+nanopore+sequencing.">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li><li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxford+Nanopore+MinION:+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community.">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).</li><li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+view+on+sequencing.">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome.">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li><li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPack:+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data.">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li><li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication.">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615 (2013).</li><li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+(CATCH)+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping.">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+(CATCH).">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

من حيث المبدأ، تسلسل نانوبوري قادرة على توليد 100 كيلو بايت ليقرأ مجباس بطول11،،من1213. أربعة عوامل رئيسية سوف تؤثر على أداء نوعية البيانات وتشغيل التسلسل: 1) أرقام المسام النشطة ونشاط المسام؛ 2) بروتين السيارات، الذي يتحكم في سرعة الحمض النووي مرورا نانوبوري؛ 3) قالب الحمض النووي (طول والنقاء والجودة، جماعية)؛ 4) تسلسل محول ربط الكفاءة، الذي يحدد الحمض النووي صالحة للاستعمال من العينة الإدخال. أول اثنين من العوامل تعتمد على الإصدار من الخلية تدفق وتسلسل مجموعة توفيرها من قبل الشركة المصنعة. ثاني العاملين هما خطوات حاسمة في هذا البروتوكول (استخراج "الحمض النووي حمو" والقص والربط).
يتطلب هذا البروتوكول من الصبر والممارسة. نوعية "حمو الحمض النووي" مهم ل مكتبات الحمض النووي طويلة جداً6. البروتوكول ويبدأ بالخلايا التي تم جمعها مع بقاء عالية (> 85% خلية قابلة للتطبيق المفضل)، يحد من الحمض النووي المتدهورة من الخلايا الميتة. وينبغي تجنب أي عملية قاسية مما قد يعرض الأضرار بالحمض النووي (مثلاً، قوية مثيرة للقلق، والهز، ودوامه، متعددة بيبيتينج، وتكرار تجميد وذوبان الجليد). في تصميم البروتوكول، يمكننا حذف بيبيتينج في عملية استخراج الحمض النووي برمتها. نصائح تتحمل واسعة تحتاج لاستخدامه عند بيبيتينج ضروري بعد القص الميكانيكية أثناء تشييد مكتبة وتسلسلها. نانوبوريس حساسة لكيمياء في المخزن المؤقت الدائرة12، هناك ينبغي أن الملوثات المتبقية قليلة (مثلاً، المنظفات، التوتر السطحي، الفينول، الإيثانول، البروتينات الكشف، إلخ) ممكن في الحمض النووي. ونظرا لطول والغلة، يبين طريقة استخراج الفينول نتائج أفضل وأكثر استنساخه بالمقارنة مع أساليب الاستخراج مختلفة متعددة اختبار حتى الآن.
وعلى الرغم من قدرة هذا البروتوكول على إنتاج تسلسلات طويلة للقراءة، لا تزال هناك العديد من القيود. أولاً، هذا البروتوكول كان الأمثل استناداً إلى جهاز التسلسل نانوبوري المتاحة في وقت النشر؛ وهكذا، يقتصر على كيمياء تسلسل الانتقائي القائم على نانوبوري ويمكن أن تكون دون المستوى الأمثل عند القيام بأنواع أخرى من أجهزة تسلسل طويلة للقراءة. ثانيا، والنتيجة تعتمد اعتماداً كبيرا على النوعية من الحمض النووي المستخرج من المواد البداية (الأنسجة أو الخلايا). طول القراءة ستتأثر إذا كان الحمض النووي انطلاق الفعل المتدهورة أو أضرار. ثالثا، على الرغم من أن العديد من الخطوات ومراقبة الجودة مدرجة في بروتوكول للتحقق من جودة الحمض النووي، المحصول النهائي وطول على ما يلي يمكن أن يتأثر تدفق الخلية والمسام النشاط، الذي يمكن أن يكون المتغير في هذه المرحلة المبكرة من منصة التسلسل نانوبوري التنمية.
هنا يستخدم بروتوكول وصف عينات خط الخلية البشرية تعليق لاستخراج الحمض النووي. ونحن قد الأمثل مرات يمر بإبرة القص، نسبة "الحمض النووي حمو" ترانسبوساسي والوقت عملية ربط لإنتاج نتائج وصف. ويمكن توسيع البروتوكول بأربع طرق. أولاً، يمكن للمستخدمين بدء مع خلايا الثدييات الأخرى المستزرعة وكمية مختلفة من الخلايا والأنسجة والعينات السريرية، أو الكائنات الحية الأخرى. ستكون هناك حاجة إلى مزيد التحسين في وقت الحضانة تفسخ وحجم رد الفعل والطرد المركزي. ثانيا، من الصعب التنبؤ بحجم الهدف لتسلسل قراءة طويلة جداً. إذا كانت أطوال اقرأ أقصر مما كان متوقعا، للمستخدمين ضبط مرات عابرة في الأسلوب القائم على القص الميكانيكية أو تغيير النسبة من "الحمض النووي حمو" ترانسبوساسي في الأسلوب القائم على تجزئة ترانسبوساسي. وقت الربط وشطف أطول خلال خطوات تنظيف مفيدة لأن "الحمض النووي حمو" عالية اللزوجة. ثالثا، مع أجهزة تسلسل نانوبوري مختلفة، واحد ضبط مقدار وحجم الحمض النووي لتلبية معايير جهاز التسلسل. رابعا، سوف التسلسل فقط الحمض النووي متصلة بمحولات التسلسل. لزيادة تحسين كفاءة عملية ربط، يمكن محاولة أحد تيتراتي تركيزات ليجاسى ومحول. ربط تعديل الوقت وعوامل الازدحام الجزيئية مثل شماعة18 يمكن تطبيقها في المستقبل. قد توفر فائقة طويلة البروتوكول تسلسل الحمض النووي جنبا إلى جنب مع كريسبر19،20 أداة فعالة لهدف إثراء التسلسل.

على مدى العقد الماضي، موازية لنطاق واسع وتكنولوجيات دقيقة للغاية التسلسل الفائق من الجيل الثاني دفعت انفجار اكتشاف الطبية الحيوية والابتكار التكنولوجي1،،من23. وعلى الرغم من أوجه التقدم التقني، قصيرة-قراءة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة منصات الجيل الثاني من غير فعالة في حل مناطق الجينوم معقدة ومحدودة في الكشف عن المتغيرات الهيكلية الجينوم (SVs)، التي تلعب أدواراً هامة في الإنسان تطور والأمراض4،5. وعلاوة على ذلك، قصيرة-قراءة البيانات غير قادر على حل تكرار الاختلاف وغير ملائمة للمميزين هابلوتيبي التدريجي للمتغيرات الجينية6.
التقدم الذي أحرز مؤخرا في تسلسل واحد جزيء عروض أطول بشكل ملحوظ قراءة الطول، التي يمكن أن تسهل الكشف عن النطاق الكامل ل SVs7،،من89، وعروض الجمعية دقيقة وكاملة لمجمع الجينومات الميكروبية والثدييات6،10. ينفذ منهاج نانوبوري تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام11،،من1213وساطة مباشرة. خلافا لأي الكيمياء تسلسل الحمض النووي القائمة، يمكن أن تولد التسلسل نانوبوري طويلة (عشرات الآلاف من كيلوبس) ما يلي: في الوقت الحقيقي دون الاعتماد على حركية بوليميريز أو اصطناعية تضخيم عينات الحمض النووي. ولذلك، نانوبوري طويلة قراءة التسلسل (NLR-seq) يحمل وعدا كبيرا لتوليد أطوال قراءة طويلة جداً تتجاوز 100 كيلو بايت، التي ستعزز إلى حد كبير تحليل الجينوم والطب الأحيائي14، لا سيما في تعقيد منخفض أو الغنية بتكرار مناطق الجينوم15.
الميزة الفريدة للتسلسل نانوبوري قدرته على توليد طويلة يقرأ دون وجود قيود طول نظرية. ولذلك، طول القراءة تعتمد على طول الفعلي من الحمض النووي الذي يتأثر بصورة مباشرة بنوعية القالب النزاهة وتسلسل الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تبعاً لمدى التلاعب وعدد الخطوات التي تنطوي عليها، مثل قوات بيبيتينج وشروط الاستخراج، نوعية الحمض النووي اختلافاً كبيرا. ولذلك، أنها تمثل تحديا لأحد الخضوع الطويل ما يلي: بمجرد تطبيق البروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية والشركة المصنعة للمكتبة التي تم توفيرها أساليب البناء. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير قوي الأسلوب لتوليد طويلة جداً قراءة (مئات كيلوبس) تسلسل البيانات بدءاً من الخلية المقطوع الكريات. لقد اعتمدنا عدة تحسينات في إجراءات إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي. نحن تبسيط البروتوكول لاستبعاد الإجراءات غير الضرورية التي تسبب تدهور الحمض النووي والأضرار. ويتألف هذا البروتوكول من ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي وبناء مكتبة الحمض النووي طويلة جداً وتعاقب على منصة نانوبوري. لإحياء الجزيئية المدربين تدريبا جيدا، يستغرق عادة 6 ح من الخلية الحصاد للانتهاء من استخراج الحمض النووي حمو، 90 دقيقة أو ح 8 لتشييد المكتبة اعتماداً على أسلوب القص، وحتى 48 ساعة أخرى لتسلسل الحمض النووي. استخدام البروتوكول ستمكن المجتمع الجينوم لتحسين فهمنا لتعقيد الجينوم واكتساب المعرفة الجديدة إلى تباين المجين في الأمراض التي تصيب الإنسان.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

قراءة الجيل الثالث التي توفر تكنولوجيات تسلسل الحمض النووي جزيء واحد لم يعد إلى حد كبير المدة التي يمكن أن تيسر الجمعية جينومات معقدة وتحليل المتغيرات الهيكلية المعقدة. منصات نانوبوري إجراء تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام وساطة مباشرة، ويمكن أن تولد مئات من كيلوبس (kb) على ما يلي مع الحد الأدنى من التكاليف الرأسمالية. قد اعتمد هذا المنبر العديد من الباحثين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. تحقيق أطوال قراءة التسلسل هو العامل الأهم الاستفادة من قيمة منصات التسلسل نانوبوري. لتوليد يقرأ طويلة جداً، مطلوب اعتبارا خاصا لتجنب الكسور الحمض النووي واكتساب الكفاءة لإنشاء قوالب تسلسل الإنتاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكول مفصلاً لزمن تسلسل الحمض النووي بما في ذلك ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي من الخلايا الطازجة أو المجمدة، وبناء مكتبة بالقص الميكانيكية أو تجزئة ترانسبوساسي، وتسلسل على جهاز نانوبوري. من 20-25 ميكروغرام من "الحمض النووي حمو"، الأسلوب يمكن تحقيق N50 قراءة طول 50-70 كيلوبايت مع القص الميكانيكية و N50 من 90-100 كيلو بايت قراءة طول مع ترانسبوساسي بوساطة التجزؤ. يمكن تطبيق البروتوكول على الحمض النووي المستخرج من خلايا الثدييات لإجراء تسلسل الجينوم الكامل للكشف عن المتغيرات الهيكلية والجمعية الجينوم. تحسينات إضافية على استخراج الحمض النووي والتفاعلات الانزيمية سوف زيادة طول القراءة وزيادة فائدته.

ينطبق البروتوكول تسلسل الحمض النووي طويلة جداً "حمو الحمض النووي" لبناء مكتبة. ولذلك، من الأهمية بمكان اختيار الخلايا المستزرعة جيدا مع نسبة لايف > 85% في الخلية حصاد خطوة. كمية الخلايا المستخدمة لاستخراج الحمض النووي سيؤثر على النوعية والكمية من "الحمض النووي همو". تحلل الخلية لا يعمل جيدا إذا بدأت مع عدد كبير جداً من الخلايا. استخدام عدد قليل جداً من الخلايا لا تولد ما يكفي من الحمض النووي لبناء مكتبة لترسيب "الحمض النووي همو" تتم باستخدام التناوب لطيف باليد بدلاً من الطرد المركزي عالية السرعة. مثال من "الحمض النووي حمو" بعد إضافة المثلج 100 ٪ الإيثانول والتناوب هو كما هو موضح متسرعا مثل القطن الأبيض في الشكل 2.
من المهم التحقق من جودة المدخلات الحمض النووي قبل البدء في إنشاء المكتبة. يمكن أن يكون التدهور الكمي غير صحيحة والتلوث (مثلاً، البروتينات، والكشف، والمنظفات، الفاعل، والفينول المتبقية أو الإيثانول) والوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي أثر كبير على الإجراءات اللاحقة وعلى النهائي قراءة طول. نوصي بإجراء التحليل ومراقبة الجودة باستخدام الحمض النووي من ثلاثة مواقع مختلفة في الأنبوبة التي تحتوي على "الحمض النووي حمو". من الأشعة فوق البنفسجية قراءة النتائج "الحمض النووي حمو"، قيمة280 /OD260OD حوالي 1.9 وهو قيمة230 /OD260OD حوالي 2.3 (الشكل 3 أ، ب). وتتسق هذه القيم نسبة بين ثلاثة اختبارات عينة "الحمض النووي حمو" جيدة. أساليب القص مختلفة تتطلب كميات مختلفة من الحمض النووي الإدخال. يتعين تركيز "الحمض النووي همو" > 200 نانوغرام/ميليلتر للقص الميكانيكية في حين أنها تحتاج إلى أن تكون > 1 ميكروغرام/ميليلتر لتجزئة ترانسبوساسي. تركز الكشف عنها بواسطة fluorometer أقل قليلاً من الأشعة فوق البنفسجية القراءة. ومع ذلك، معامل الاختلاف لتركيز العينة "حمو الحمض النووي" نفسه مطلوب أن تكون أقل من 15% مع فلوروميتير والأشعة فوق البنفسجية قراءة فحوصات. وينطبق حقنه بإبرة لكسر "همو الحمض النووي" حيث أن عدد تصاريح الدخول عن طريق الإبرة سوف تؤثر على حجم الحمض النووي المنفصمة والقراءة النهائية طول القص الميكانيكية. من المستحسن القيام بحجم مراقبة الجودة بعد إبرة القص لضمان أغلبية "الحمض النووي حمو" أكبر من 50 كيلو بايت كما هو موضح في الشكل 4. في أسلوب القص الميكانيكية، ولدت يمر 30 أفضل النتائج تسلسل النظر سواء في الطول والإخراج.
N50 من مكتبة على أساس القص الميكانيكية 50-70 كيلوبايت بينما مكتبة القائم على تفتيت ترانسبوساسي 90-100 كيلو بايت. وترد نتائج تشغيل أربعة باستخدام خط الخلية HG00733 في الجدول 1. كافة المجريات الأربعة قد يقرأ أكثر 2,300 مع طول أطول من 100 كيلو بايت. الحد الأقصى للطول أطول في ترانسبوساسي المستندة إلى تجزئة المكتبات (455 كيلو بايت و 489 كيلو بايت) بالمقارنة مع المكتبات على أساس القص الميكانيكية (348 كيلو بايت و 387 كيلو بايت) بينما الأخيرة أنتجت أكثر من ما يلي: مجموع، تشير إلى ارتفاع عائد. بناء مكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي له عدد أقل من الخطوات وأقصر مدة التحضير حتى أنها ستقدم أجزاء قصيرة أقل. تشغيل اثنين باستخدام ترانسبوساسي يكون أطول يعني (> 30 كيلو بايت) ومتوسط طول (> 10 كيلو بايت). وبالإضافة إلى ذلك، تظهر البيانات متسقة ذات جودة عالية في كافة المجريات (نقاط الجودة يعني حوالي 10.0، ~ 90% دقة قاعدة). كانت الانحياز أكثر من 97 في المائة من مجموع الأسس المرجعية البشرية بالمجين (hg19) باستخدام Minimap216 مع الإعدادات الافتراضية. ويبين الشكل 5توزيعات الحجم المتوقع من الخام على ما يلي. وقد يدير كل نسبة كبيرة من البيانات أعلاه 50 كيلو بايت بينما ترانسبوساسي المستندة إلى تجزئة مكتبات لديها أعلى نسبة من يقرأ طويلة جداً (مثل > 100 كيلو بايت). هذا البروتوكول قد طبق بنجاح في خطوط الخلايا البشرية متعددة (تكميلية الجدول 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لسير العمل منذ فترة طويلة-قراءة التسلسل (NLR-seq) نانوبوري- أورانج، ترانسبوساسي المعقدة. الأصفر والأخضر، محول نانوبوري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> رقم 2: ترسيب الحمض النووي الممثل من طريقة استخراج الفينول كلوروفورم. ويشير السهم الأبيض إلى "الحمض النووي حمو". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> الشكل 3: نتائج مراقبة الجودة مثال من "الحمض النووي حمو" من قراءة الأشعة فوق البنفسجية- (أ) "حمو الحمض النووي" من الخطوة 1.21.1 جاهزة للبناء الميكانيكية مكتبة القائم على القص. (ب) "حمو الحمض النووي" من الخطوة 1.21.2 للبناء القائم على تجزئة مكتبة ترانسبوساسي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> الشكل 4: نتائج مراقبة الجودة من الإبرة المنفصمة "حمو الحمض النووي" بالتفريد جل الحقل نابض. L1: تحميل سريع 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي؛ L2: سرعة التحميل 1 كيلو بايت تمديد سلم الحمض النووي. 1-8: الحمض النووي مع أوقات مرور مختلفة عن طريق القص الإبرة. 1-3، لا القص؛ 4، 10 مرات؛ 5، 20 مرة؛ 6، 30 ضعفا؛ 7، 40 مرة؛ 8، 50 مرة. هذه الخطوة مراقبة الجودة اختياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> رقم 5: من المتوقع توزيع حجم المكتبات الحمض النووي طويلة جداً نانوبوري- مرض التصلب العصبي المتعدد، المكتبات على أساس القص الميكانيكية. TF، المكتبات على أساس تجزئة ترانسبوساسي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Shearing_rep1 الميكانيكية</td>
			<td>Shearing_rep2 الميكانيكية</td>
			<td>Fragmentation_rep1 ترانسبوساسي</td>
			<td>Fragmentation_rep2 ترانسبوساسي</td>
		</tr>
<tr>
<td>خط الخلية</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 من ما يلي</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>عدد القراءات أكثر من 100 كيلو بايت</td>
			<td>2,500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2,355</td>
		</tr>
<tr>
<td>عدد مجموع ما يلي:</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحد الأقصى للطول (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>يعني الطول (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوسط الطول (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>يعني نوعية ما يلي:</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9.9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع الأسس الأولية ما يلي:</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع أسس الانحياز ما يلي:</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>نسبة معين من مجموع القواعد (hg19، Minimap2)</td>
			<td>96.9%</td>
			<td>98، 0%</td>
			<td>97.7%</td>
			<td>97.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>عدد المسام النشطة</td>
			<td>1225:480، 402، 254، 89</td>
			<td>1058:480، 356، 176، 46</td>
			<td>958:452، 328، 148، 30</td>
			<td>1092:487، 367، 195، 43</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: موجز من مقاييس الأداء يعمل مع مختلف البروتوكولات الإمالة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>مكتبة 1</td>
			<td>مكتبة 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>خط الخلية</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلية معلومات الطلب</td>
			<td>ATCC، لجنة مناهضة التعذيب. لا. شركة CCL-243</td>
			<td>معهد كوريل، ولجنة مناهضة التعذيب. لا. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>بروتوكول</td>
			<td>القص الميكانيكية</td>
			<td>القص الميكانيكية</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 من ما يلي</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>عدد مجموع ما يلي:</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوسط الطول (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>يعني الطول (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحد الأقصى للطول (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع الأسس الأولية ما يلي:</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع أسس الانحياز ما يلي:</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>نسبة معين من مجموع القواعد (hg19، Minimap2)</td>
			<td>96.6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>عدد المسام النشطة</td>
			<td>1111:482، 371، 203، 55</td>
			<td>1032:447، 333، 196، 56</td>
		</tr>
</tbody></table>التكميلية الجدول 1: موجز لدورتين كاملتين NLR seq استخدام خطوط الخلايا الأخرى مع البروتوكول القص الميكانيكية.

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

تسلسلات طويلة القراءة يسهل الجمعية جينومات المعقدة وتوصيف التغير الهيكلي. يصف لنا طريقة لإنشاء تسلسلات طويلة جداً بالأنظمة الأساسية المستندة إلى نانوبوري التسلسل. ويعتمد النهج أمثل استخراج الحمض النووي تليها مكتبة تعديل الأعمال التحضيرية لتوليد مئات يقرأ كيلوباسي مع تغطية معتدلة من الخلايا البشرية.

ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

هذا البروتوكول يسد فجوة فنية في قدرتنا على توليد صفائف تسلسل طويلة جدا. فهو يمكننا من دراسة تعقيد الجينوم الذي يحد منه النهج الحالية للقراءة القصيرة في علم الجينوم. هذا الأسلوب هو فريد من نوعه في الأداء، والمتانة، وبراعة، وإمكانية الاندماج مع التطبيقات الجديدة الواعدة.وهو ينطبق على مواد مختلفة ويمكن تحويرها لأحجام فورية مختلفة. وقد بدأت هذه التقنية ثورة في المشهد السريري. وقد تغلب تشخيص فائدة في اضطرابات التوسع المتكررة العديد من أوجه القصور الحالية.وقد استخدمت بعض سجلات زرع عالية الدقة HLA-الطباعة من أجل نتائج سريرية أفضل. وتوفر هذه الطرق معلومات بعيدة المدى لم يمكن الوصول إليها من قبل مثل التدرج والتباين الهيكلي المعقد. إلى جانب قراءات اللاجينية في اختبار واحد ، فإنه سيمكن الطب الدقيق.إنه بروتوكول طويل مع العديد من التقنيات الجديدة ومن الصعب معرفة ما إذا كان يعمل حتى التسلسل النهائي. أوصي ممارسة التحميل على الخلايا القديمة تدفق قبل تشغيل العينات. وقال المتعاونون بعض التقنيات مربكة بالمقارنة مع نهج القراءة القصيرة.على وجه التحديد، استخراج هو ألطف نظرا للوعي عالية الجودة، والحمض النووي الوزن الجزيئي عالية. لبدء استخراج الحمض النووي HMW، أولا إضافة 200 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى 10 ملليلتر من العازلة تحلل في أنبوب 50 ملليلتر. ثم، دوامة في أعلى سرعة لمدة ثلاث ثوان.واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، إضافة اثنين microliters من RNS-A إلى lysate. تدوير بلطف أنبوب 50 ملليلتر لخلط العينة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، إضافة 10 ملليلتر من طبقة الفينول من الفينول- الكلوروفورم-ايساميل خليط الكحول إلى lysate. ووضع الأنبوب على دوار في 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق تحت غطاء محرك الدخان. بعد الطرد المركزي مع أنابيب هلام، صب بعناية supernatant في أنبوب جديد 50 ملليلتر.ثم، إضافة 25 ملليلتر من الجليد الباردة 100٪ الإيثانول، وتدوير بلطف الأنبوب باليد، حتى يترسب الحمض النووي. ثني طرف 20 ميكرولتر لجعل هوك. باستخدام هوك، تأخذ بعناية من الحمض النووي HMW والسماح للسوائل إسقاط.ثم، ضع الحمض النووي في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 40 ملليلتر من 70٪ إيثانول، وعكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات لغسل الحمض النووي. لإعداد المكتبة الميكانيكية القائمة على القص ، استخدم أولاً حقنة خالية من الإبر 100 ملليلتر للتطلع إلى جميع الحمض النووي. ثم، وضع إبرة قياس 27 على حقنة وإخراج كل الحمض النووي في الطبق بلطف وببطء.كرر 29 مرة. بعد ذلك، أضف 143 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي الذي أعيد تعليقه و143 ميكرولترات من خليط تفاعل إصلاح الحمض النووي إلى أنبوب. قم بالتمرير الأنبوبي ست مرات لخلطه بلطف، ثم ضع الأنبوب على ددورة عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.الطرد المركزي الأنبوب في 1000G لمدة ثانيتين في درجة حرارة الغرفة لتدور أسفل العينة، ومن ثم وضع الأنبوب على رف المغناطيسي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تجاهل المابير بينما الأنبوب لا يزال على الرف. أضف 400 ميكرولترات من الإيثانول الطازج 70٪.انتظر 30 ثانية. ثم قم بإزالة الإيثانول. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 1000G لمدة ثانيتين في درجة حرارة الغرفة لتدور أسفل العينة.ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وأزل أي الإيثانول المتبقي. الهواء الجافة بيليه لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 103 ميكرولترات من عازل T-E.ثم، نفض الغبار الأنبوب بلطف لضمان أن يتم تغطية الخرز في المخزن المؤقت ووضع الأنبوب على الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة 10 دقائق إلى بيليه الخرز. استخدام طرف تحمل P200 واسعة لنقل 100 ميكرولترات من eluate إلى أنبوب 0.2 ملليلتر، والمضي قدما في نهاية إصلاح dA- ذيل ردود الفعل الربط محول.لإعداد المكتبة القائمة على تجزئة transposase، أولا جعل رد فعل اغاسنتيشن الحمض النووي عن طريق إضافة 22 ميكرولتر من الحمض النووي HMW، وميكر واحد من 10 ملليمولار تريس، درجة 8، مع 0.02٪تريتون X-100، و 1 ميكرولتر من مزيج تجزئة، إلى أنبوب 0.2 ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم نصيحة P200 واسعة لخلط التفاعل ست مرات ، واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. عقد في أربع درجات مئوية.وأخيراً، استخدم نصيحة تحمل P200 واسعة لنقل رد فعل إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وإضافة بسرعة 1 ميكرولتر من مزيج محول سريع. استخدام تلميح P200 تتحمل واسعة لخلط رد فعل ست مرات. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، والمضي قدما في التسلسل.لبدء التسلسل، أدخل أولاً خلية تدفق جديدة في إحدى قنوات جهاز Nanopore. ثم، على برنامج التحكم التسلسل المصاحب، تحقق من مربع الموقع من خلية التدفق. حدد نوع خلية التدفق الصحيح وانقر على سير عمل خلية تدفق الاختيار.انقر على زر بدء اختبار لبدء تحليل تدفق خلية مراقبة الجودة. المقبل، مع ماصة P1000 تعيين إلى 100 ميكرولتر، سحب مرة أخرى أقل من 30 ميكرولترات من العازلة لإزالة فقاعات من خلية التدفق. إضافة 30 ميكرولترات من مزيج فتيلة لتغطية الجزء العلوي من ميناء فتيلة لتجنب إدخال فقاعات.ثم، ماصة 800 ميكرولترات من مزيج فتيلة في ميناء فتيلة لتحميل خلية تدفق. إخراج تلميح عندما يكون هناك حوالي 50 ميكرولتررس من المزيج فتيلة اليسار، وإضافة بقية مزيج فتيلة على الجزء العلوي من ميناء فتيلة. المقبل، مع ماصة P1000، إضافة 200 ميكرولترات من مزيج فتيلة في خلية تدفق.ثم، قبل التحميل فقط، استخدم ماصة P200 تعيين إلى 80 ميكرولتررس إلى ماص صعودا وهبوطا مكتبة الحمض النووي ست مرات. وأخيراً، قم بتحميل المزيج إسقاط مكتبة من الحكمة في خلية تدفق من خلال منفذ العينة، ثم انتقل إلى التسلسل وتحليل البيانات. وأدى تحليل مراقبة الجودة للحمض النووي الجاهز لبناء مكتبة تعتمد على القص الميكانيكية إلى نسبة نقاء 260 إلى 280 حوالي 1.9، ونسبة 260 إلى 230 حوالي 2.3، مما يدل على عينة جيدة من الحمض النووي.وشوهدت النتيجة نفسها باستخدام بناء المكتبة المستندة إلى تجزئة الحمض النووي الجاهزة للاندباس. حجم مراقبة الجودة من الحمض النووي HMW قلص إبرة بواسطة نبض هلام الكهربائي أظهرت أن غالبية الحمض النووي HMW كان أكبر من 50 كيلوباسس. وأظهرت نتائج أربعة أشواط باستخدام الخلية HG00733 أن N50 من مكتبة الميكانيكية المستندة إلى القص كان أقصر من مكتبة تجزئة transposase المستندة إلى.أيضا, كان كلّ أربعة أشواط على 2300 يقرأ مع طول طويلة من 100 كيلوباس. وكان الطول الأقصى أطول في المكتبات القائمة على تجزئة الـ transposase مع وقت إعداد أقصر، مقارنة بالمكتبات الميكانيكية المستندة إلى القص. أنتجت المكتبات الميكانيكية المستندة إلى القص عدد القراءات الإجمالية أكثر مقارنة بالمكتبات القائمة على تجزئة الـ transposase، مما يشير إلى عائد أعلى.وأظهرت المكتبات جودة عالية متسقة وأكثر من 97٪ من قواعدها الإجمالية كانت تتماشى مع الجينوم المرجعي البشري. وأظهرت التوزيعات المتوقعة للحجم أن جميع الأشواط الأربعة كانت لها نسبة كبيرة من البيانات التي تزيد عن 50 كيلوباسيس، في حين أن المكتبات القائمة على تجزئة نظام نقل الانبعاثات كانت نسبة أعلى من القراءات الطويلة جداً. الهدف العام هو الحفاظ على الحمض النووي سليم، لذلك من المهم تجنب أي تعامل قاس مع الحمض النووي.عامل رئيسي يمكن أن يزيد قيمة الأسلوب هو التحليل الحسابي. طور فريقنا خط أنابيب تحليل طويل القراءة يسمى PICKY يمكنه اكتشاف مجموعة كاملة من SVs ذات حساسية عالية. وسوف تفتح آفاقا جديدة للمناطق المثيرة مثل الكشف عن المركبات الكهربائية المعقدة وإعادة ترتيب المراحل والتعديلات على مستوى جزيء واحد.وهذا من شأنه أن يحسن كثيرا فهمنا لهندسة الجينوم. الفينول هو تآكل جدا. يجب عليك العمل معها في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، نظارات السلامة، معطف مختبر، السراويل الطويلة والأحذية.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

تصميم روبوت الحيوية استجابة من اوريغامي الحمض النووي

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

كامل الجسم الطيف الكتلي التصوير من قبل بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء ليزر الامتزاز Electrospray التأين (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

تماما الجهاز الآلي الطرد المركزي ميكروفلويديك للكشف عن البروتين فائق الحساسية من الدم الكامل

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...