Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Y. Zhu bedanken de auteurs voor haar opmerkingen over het manuscript. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P30CA034196. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+at+40:+past,+present+and+future.">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li><li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping.">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li><li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation:+insights+from+and+for+human+disease.">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li><li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+reads:+their+purpose+and+place.">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li><li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing.">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads.">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li><li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing.">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer.">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li><li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+decades+of+nanopore+sequencing.">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li><li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxford+Nanopore+MinION:+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community.">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).</li><li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+view+on+sequencing.">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome.">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li><li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPack:+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data.">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li><li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication.">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615 (2013).</li><li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+(CATCH)+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping.">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+(CATCH).">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In principe is nanopore rangschikken kundig voor genereren van 100 kb aan megabase leest in lengte11,12,13. Vier belangrijke factoren zullen de prestaties van de sequencing uitvoeren en gegevens kwaliteit beïnvloeden: 1) actieve porie nummers en de activiteit van de poriën; 2) motor-eiwit, dat regelt de snelheid van DNA door de nanopore; 3) DNA sjabloon (lengte, zuiverheid, kwaliteit, massa); 4) sequencing adapter afbinding efficiëntie, die bepalend is voor de bruikbare DNA uit de input monster. De eerste twee factoren, is afhankelijk van de versie van de cel van de stroom en de sequencing kit geleverd door de fabrikant. De laatste twee factoren zijn kritische stappen in dit protocol (HMW DNA-extractie, schuintrekken en afbinding).
Dit protocol vereist geduld en oefening. De kwaliteit van HMW DNA is belangrijk voor ultra lange DNA bibliotheken6. Het protocol start met cellen verzameld met hoge levensvatbaarheid (> 85% levensvatbare cellen de voorkeur), beperking van de aangetaste DNA uit dode cellen. Iedere harde methode die schade met het DNA kennismaken kan (bijvoorbeeld sterk verstoren, schudden, vortex, meerdere pipetting, herhaalde bevriezen en ontdooien) moet worden vermeden. In het ontwerp van het protocol weglaten we pipetteren in het gehele proces van de DNA-extractie. Breed boring uiteinden moeten worden gebruikt wanneer pipetteren is nodig na de mechanische scheren tijdens de bouw van de bibliotheek en de sequencing. Als de nanopores gevoelig voor de chemicaliën in de kamer buffer12 zijn, moet er zo weinig resterende verontreinigingen (bijvoorbeeld de detergentia, oppervlakteactieve stoffen, fenol, ethanol, eiwitten RNAs, enz) mogelijk in het DNA. Gezien de lengte en de opbrengst toont de fenol-extractiemethode de resultaten van het beste en meest reproduceerbare vergeleken met meerdere verschillende extractiemethoden getest tot nu toe.
Ondanks het vermogen van dit protocol te produceren van lange-lezen sequenties, blijven verschillende beperkingen. Ten eerste, dit protocol werd geoptimaliseerd op basis van het nanopore sequencing apparaat beschikbaar ten tijde van publicatie; Dus, het is beperkt tot de sequentiebepaling van selectieve nanopore gebaseerde chemie en zou suboptimaal wanneer uitgevoerd in andere soorten lange-lezen sequencing apparaten. Ten tweede, het resultaat is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het DNA geëxtraheerd uit het uitgangsmateriaal (weefsels of cellen). Lees lengte zal worden aangetast als de startende DNA is al gedegradeerd of beschadigd. Ten derde, hoewel meerdere QC stappen zijn opgenomen in het protocol bij het controleren van de kwaliteit van DNA, de definitieve opbrengst en de lengte van de leest kunnen worden beïnvloed door de stroom-cel en poriën activiteit, die zou variabele in dit vroege stadium van nanopore sequencing platform ontwikkeling.
Het protocol beschreven gebruikt hier menselijke schorsing celsteekproeven lijn voor DNA-extractie. We hebben de passerende times in naald schuintrekken, de HMW DNA in verhouding tot de transposase en de tijd van de afbinding tot beschreven resultaten geoptimaliseerd. Het protocol kan op vier manieren worden uitgebreid. Eerst, kunnen de gebruikers beginnen met andere gekweekte zoogdiercellen en met verschillende hoeveelheid cellen, weefsels, klinische monsters of andere organismen. Verdere optimalisatie op lysis van de incubatietijd, reactie volume en centrifugeren nodig zullen zijn. Ten tweede, het is moeilijk te voorspellen het doelformaat voor het ultra lange Lees rangschikken. Als de Lees lengtes korter zijn dan verwacht, kunnen de gebruikers aanpassen van de passerende tijden in de mechanische schuintrekken gebaseerde methode of de verhouding van het DNA HMW omzetten in transposase in de transposase fragmentatie gebaseerde methode. Langere binding en elutie tijd tijdens cleanup stappen zijn handig omdat het HMW DNA is zeer viskeuze. Ten derde, met verschillende nanopore sequencing apparaten, kunt een aanpassen de hoeveelheid en het volume van het DNA om te voldoen aan de criteria van de sequencer. Ten vierde, zal alleen deze DNA afgebonden aan sequencing adapters worden sequenced. Om afbinding efficiëntie verder te verbeteren, kan men proberen om te Titreer de adapter en ligase concentraties. Gemodificeerde afbinding tijd en moleculaire omvangrijke agenten zoals PEG18 kunnen in de toekomst worden toegepast. Het ultra lange DNA sequencing protocol gecombineerd met CRISPR19,20 kan bieden een doeltreffend instrument voor het doel verrijking rangschikken.

In het afgelopen decennium, massaal parallelle en zeer nauwkeurige tweede generatie high-throughput sequencing technologieën hebben gereden een explosie van biomedische ontdekking en technologische innovatie1,2,3. Ondanks de technische vooruitgang, de gegevens van de korte-lezen gegenereerd door de tweede generatie platforms zijn niet effectief bij het oplossen van complexe genomic regio's en zijn beperkt in de opsporing van genomic structurele varianten (SVs), die een belangrijke rol in de mens spelen evolutie en ziekten4,5. Bovendien, korte-lezen gegevens zijn niet in staat om op te lossen herhaling variatie en zijn ongeschikt voor comforthotel haplotype fasering van genetische varianten6.
Recente vooruitgang in single-molecuul sequencing biedt aanzienlijk meer tijd lezen lengte, die de detectie van het volledige spectrum van SVs7,8,9, en biedt nauwkeurige en volledige vergadering van complex vergemakkelijken kan microbiële en zoogdieren genoom6,10. Het nanopore platform voert één-molecuul rangschikken door direct het meten van de huidige veranderingen gemedieerd door DNA passage door de poriën11,12,13. In tegenstelling tot elke bestaande DNA sequencing chemie, nanopore sequencing kunt genereren lange (tientallen tot duizenden kilobases) leest in real-time zonder zich het baseren op de kinetiek van de polymerase of kunstmatige versterking van het DNA-monster. Daarom, nanopore lang lezen sequencing (NLR-seq) houdt grote belofte voor het genereren van ultra lange Lees lengtes dan 100 kb, die zou verder sterk genomic en biomedische analyses14, met name in het lage-complexiteit of herhalen-rich regio's van het genoom15.
De unieke eigenschap van de nanopore rangschikking is het potentieel voor het genereren van lange leest zonder een theoretische lengte beperking. Dus is de Lees lengte afhankelijk van de fysieke lengte van DNA die wordt rechtstreeks beïnvloed door de DNA-integriteit en de sequencing sjabloon kwaliteit. Bovendien, afhankelijk van de mate van manipulatie en het aantal stappen, zoals pipetting krachten en extractie voorwaarden, de kwaliteit van het DNA is zeer variabel. Daarom is het uitdagende voor een te lange leest door alleen toe te passen de standaard protocollen van de DNA-extractie en fabrikant meegeleverde bibliotheek bouwwijze opleveren. Richting van dit doel hebben we een robuuste methode voor het genereren van ultra lange rangschikken gegevens vanaf geoogste cel pellets (honderden kilobases) lezen. Wij hebben meerdere verbeteringen in de DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding procedures aangenomen. Wij stroomlijnen het protocol als u wilt uitsluiten van geen onnodige procedures die de aantasting van het DNA en schade veroorzaken. Dit protocol is samengesteld uit hoge molecuulgewicht (HMW) DNA-extractie, ultra lange DNA bibliotheek constructie en rangschikken op een nanopore platform. Voor een goed opgeleide moleculair bioloog, meestal duurt het 6 h uit cel oogsten tot de voltooiing van HMW DNA-extractie, 90 min of 8 h voor bibliotheek bouw afhankelijk van de shearing methode, en tot een verdere 48u voor DNA sequencing. Het gebruik van het protocol zal de emancipatie van de Gemeenschap van de genomica te verbeteren van ons begrip van de complexiteit van het genoom en nieuw inzicht in de variatie van het genoom in ziekten bij de mens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

Derde generatie single-molecuul DNA sequencing technologieën aanzienlijk langer bieden Lees lengte die de vergadering van complexe genomen en analyse van complexe structurele varianten kan vergemakkelijken. Nanopore platforms uitvoeren van single-molecuul rangschikken door direct het meten van de huidige veranderingen gemedieerd door DNA passage door de poriën en honderden kilobase (kb) leest met minimale kapitaal kosten kunnen genereren. Dit platform is goedgekeurd door vele onderzoekers voor een verscheidenheid van toepassingen. Het bereiken van langere sequencing Lees lengtes is de meest kritische factor om de invloed van de waarde van de nanopore rangschikking platformen. Voor het genereren van ultra lange leest, is speciale aandacht vereist DNA-breuken te vermijden en zo de efficiëntie voor het genereren van productieve sequencing sjablonen. Wij bieden hier de gedetailleerde protocol van ultra lange DNA-sequencing met inbegrip van ultrahoog moleculair gewicht (HMW) DNA-extractie uit vers of bevroren cellen, bibliotheek bouw door mechanische schuintrekken of transposase fragmentatie, en het rangschikken op een nanopore apparaat. Van 20-25 µg HMW DNA, de methode N50 lezen lengte van 50-70 kb met mechanische Schuintrekken kunt bereiken en N50 van 90-100 kb Lees lengte met transposase gemedieerde fragmentatie. Het protocol kan worden toegepast op DNA van zoogdiercellen geëxtraheerd uit te voeren gehele genoom sequencing voor de detectie van structurele varianten en genoom vergadering. Aanvullende verbeteringen van de DNA-extractie en enzymatische reacties verlengt de Lees verder en het nut ervan uit te breiden.

Het ultra lange DNA sequencing protocol geldt HMW DNA voor bibliotheek bouw. Daarom is het essentieel om te kiezen van goed gekweekte cellen met de levende verhouding > 85% bij de cel oogsten stap. Het bedrag van de cellen die worden gebruikt voor DNA-extractie zal van invloed zijn op de kwaliteit en de kwantiteit van de HMW DNA. De lysis van de cel werkt niet goed als begint met te veel cellen. Te weinig cuvetten genereert geen voldoende DNA voor bibliotheek bouw omdat de HMW DNA neerslag wordt uitgevoerd met behulp van zachte rotatie met de hand in plaats van snelle centrifugeren. Een voorbeeld van het DNA van de HMW nadat ijskoude 100% ethanol toe te voegen en roterende wordt weergegeven als het witte katoen-achtige neerslag in Figuur 2.
Het is belangrijk om de kwaliteit van de input DNA controleren voordat u begint met de bouw van de bibliotheek. Afbraak, onjuiste kwantificering, verontreiniging (b.v., eiwitten, RNAs, detergentia, oppervlakteactieve stof, en resterende fenol of ethanol) en lage moleculaire gewicht DNA kan een significant effect op de daaropvolgende procedures en op de finale Lees lengte hebben. Het is raadzaam voor het uitvoeren van de QC-analyse met behulp van het DNA van drie verschillende locaties in de buis met HMW DNA. Van UV het lezen van de resultaten voor de HMW DNA, de OD-waarde voor280 260/OD is ongeveer 1.9 en de OD-waarde voor230 260/OD is ongeveer 2.3 (figuur 3AB). Deze verhouding waarden stroken onder de drie proeven voor een goede HMW DNA-monster. Verschillende schuintrekken methoden vereist verschillende volumes van input DNA. De concentratie van HMW DNA moet > 200 ng/µL voor mechanische schuintrekken terwijl het moet > 1 µg/µL voor versnippering van de transposase. De concentratie gedetecteerd door een Fluorimeter is een beetje lager dan UV lezen. De variatiecoëfficiënt van de concentratie van de dezelfde HMW DNA-monster is echter vereist op minder dan 15% met zowel de Fluorimeter en de UV-lezen van testen. Mechanische schuintrekken geldt een injectiespuit met een naald te breken het DNA HMW zodat het aantal passeert de naald invloed op de grootte van de sheared DNA hebben zal en de finale lengte lezen. Het is raadzaam voor het uitvoeren van grootte QC nadat naald Schuintrekken om ervoor te zorgen de meerderheid van de HMW DNA groter dan 50 kb is zoals geïllustreerd in Figuur 4. In de mechanische schuintrekken methode gegenereerd 30 passeert de beste rangschikkend resultaten gezien van zowel de lengte als de uitvoer.
De N50 van een mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek is 50-70 kb, terwijl een transposase op basis van fragmentatie bibliotheek 90-100 kb is. De resultaten van vier runs met behulp van de cellijn van HG00733 staan in tabel 1. Alle vier punten hebben meer dan 2.300 leest met lengte langer zijn dan 100 kb. De maximale lengte is langer in de transposase fragmentatie-bibliotheken (455 kb en 489 kb) in vergelijking met de mechanische scheren-bibliotheken (348 kb en 387 kb) terwijl laatstgenoemde geproduceerd meer totale leest, geven een hoger rendement. De transposase bibliotheek fragmentatie gebaseerde bouw heeft minder stappen en kortere voorbereidingstijd zodat het minder korte fragmenten zal introduceren. De twee runs toe met behulp van transposase hebben een langere gemiddelde lengte (> 30 kb) en gemiddelde lengte (> 10 kb). Daarnaast toont de gegevens constante hoge kwaliteit in alle runs (gemiddelde kwaliteitsscore is ongeveer 10.0, ~ 90% basis nauwkeurigheid). Meer dan 97% van de totale honken werden uitgelijnd aan de menselijke referentie genoom (hg19) Minimap216 met de standaardinstellingen. De verwachte grootte verdelingen van de ruwe leest zijn afgebeeld in Figuur 5. Alle sessies hebben een groot aantal gegevens boven 50 kb terwijl transposase fragmentatie gebaseerde bibliotheken een hogere ratio van ultra lange luidt (b.v. > 100 kb hebben). Dit protocol is succesvol toegepast in meerdere menselijke cellijnen (aanvullende tabel 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de workflow van de lange-lezen sequencing (NLR-seq) nanopore. Oranje, de complexe transposase. Geel-groen, de nanopore-adapter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger DNA neerslag van fenol-chloroform extractiemethode. De witte pijl geeft de HMW DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> Figuur 3: voorbeeld QC resultaten van DNA uit UV lezing HMW. (A) HMW DNA uit stap 1.21.1 klaar voor mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek bouw. (B) HMW DNA uit stap 1.21.2 voor transposase op basis van fragmentatie bibliotheek bouw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> Figuur 4: QC resultaten van de naald geschoren HMW DNA door pulsed field gelelektroforese. L1: Quick-load 1 kb DNA ladder; L2: Quick-load 1 kb DNA-ladder uit te breiden. 1-8: DNA met verschillende passerende tijd via de naald schuintrekken. 1-3, geen schuintrekken; 4, 10 keer; 5, 20 keer; 6, 30 keer; 7, 40 keer; 8, 50 keer. Deze QC stap is optioneel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> Figuur 5: verwacht distributies van de grootte van de nanopore ultra lange DNA bibliotheken. MS, mechanische scheren-bibliotheken. TF, transposase fragmentatie-bibliotheken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Mechanische shearing_rep1</td>
			<td>Mechanische shearing_rep2</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellijn</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 van de leest</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal leest langer zijn dan 100 Kb</td>
			<td>2.500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2,355</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal totale leest</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maximale lengte (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde lengte (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde lengte (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde kwaliteit van de leest</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9,9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale basissen van ruwe luidt</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale basissen van uitgelijnde luidt</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toegewezen verhouding van totale bases (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96.9%</td>
			<td>98,0%</td>
			<td>97,7%</td>
			<td>97,0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal actieve poriën</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Samenvatting van prestatiegegevens uitgevoerd met verschillende schuintrekken protocollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Bibliotheek 1</td>
			<td>Bibliotheek 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellijn</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cel bestelinformatie</td>
			<td>ATCC, kat. Nr. CCL-243</td>
			<td>Coriell Instituut, kat. Nr. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protocol</td>
			<td>mechanische schuintrekken</td>
			<td>mechanische schuintrekken</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 van de leest</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal totale leest</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde lengte (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde lengte (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maximale lengte (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale basissen van ruwe luidt</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale basissen van uitgelijnde luidt</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toegewezen verhouding van totale bases (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal actieve poriën</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>Aanvullende tabel 1: Samenvatting van twee NLR-seq runs andere cellijnen met het mechanische schuintrekken protocol.

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Dit protocol vult een technische leemte in ons vermogen om ultralange sequentiearrays te genereren. Het stelt ons in staat om genoomcomplexiteit te onderzoeken die wordt beperkt door de huidige kortgelezen benaderingen in genomics. De methode is uniek in prestaties, robuustheid, veelzijdigheid en potentieel om te integreren met veelbelovende nieuwe toepassingen.Het is van toepassing op verschillende materialen en kan worden gemoduleerd voor verschillende instant maten. Deze techniek is begonnen met een revolutie in het klinische landschap. De diagnose nut in herhaalde expansie stoornissen heeft overwonnen vele huidige tekortkomingen.Sommige transplantatieregisters hebben gebruik gemaakt van hoge resolutie HLA-typen voor een betere klinische uitkomst. Deze methoden bieden eerder ontoegankelijke informatie over lange afstand, zoals fasering en complexe structurele variantie. In combinatie met epigenetische uitlezing in een enkele test, zal het precisiegeneeskunde mogelijk maken.Het is een lang protocol met veel nieuwe technieken en het is moeilijk om te weten of het werkt tot de definitieve volgorde. Ik adviseer het beoefenen van het laden op oude stroomcellen voor het uitvoeren van monsters. Medewerkers hebben gezegd dat sommige technieken verwarrend zijn in vergelijking met kortgelezen benaderingen.In het bijzonder is de extractie zachter vanwege het hoogwaardige DNA met een hoog moleculair gewicht. Om te beginnen met de extractie van HMW DNA, voeg eerst 200 microliter van de celsuspensie toe aan 10 milliliter lysebuffer in een buis van 50 milliliter. Dan, vortex op de hoogste snelheid gedurende drie seconden.En broed de oplossing op 37 graden celsius voor een uur. Voeg aan het einde van de incubatie twee microliters RNS-A toe aan het lysaat. Draai voorzichtig de buis van 50 milliliter om het monster te mengen en een uur lang 37 graden celsius te mengen.Voeg na incubatie 10 milliliter fenollaag fenol-chloroform-isoamylalcoholmengsel toe aan het lysaat. En zet de buis op een rotator op 20 rpm gedurende 10 minuten onder een rookkap. Na centrifugatie met gelbuizen, giet voorzichtig de supernatant in een nieuwe 50 milliliter buis.Voeg vervolgens 25 milliliter ijskoude 100% ethanol toe en draai de buis voorzichtig met de hand, totdat het DNA neerslaat. Buig een 20 microliter tip om een haak te maken. Neem met behulp van de haak voorzichtig het HMW-DNA eruit en laat de vloeistof afgeven.Plaats vervolgens het DNA in een buis van 50 milliliter met 40 milliliter ethanol van 70% en draai de buis voorzichtig drie keer om om het DNA te wassen. Om de mechanische schaargebaseerde bibliotheek voor te bereiden, gebruikt u eerst een naaldvrije spuit van 100 milliliter om al het DNA te nastreven. Dan, zet een 27 meter naald op de spuit en uitwerpen van al het DNA in de schotel zachtjes en langzaam.Herhaal dit 29 keer. Voeg vervolgens 143 microliter van de opnieuw opgehangen magnetische kralen en 143 microliter van het DNA-herstelreactiemengsel toe aan een buis. Veeg de buis zes keer om zachtjes te mengen, en zet de buis op een rotator op 20 rpm gedurende 30 minuten.Centrifugeren de buis op 1000G gedurende twee seconden op kamertemperatuur te draaien naar beneden het monster, en plaats de buis op een magnetisch rek gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg terwijl de buis nog op het rek ligt. Voeg 400 microliter van de vers bereide 70% ethanol toe.Wacht 30 seconden. En verwijder dan de ethanol. Vervolgens, centrifuge de buis op 1000G gedurende twee seconden bij kamertemperatuur te draaien vaststelling van het monster.Plaats de buis terug op het magnetische rek en verwijder eventuele resterende ethanol. Droog de pellet 30 seconden aan de lucht. Verwijder vervolgens de buis uit het magnetische rek en voeg 103 microliters T-E buffer toe.Vervolgens veeg je voorzichtig met de buis om ervoor te zorgen dat kralen in de buffer zijn bedekt en zet je de buis 30 minuten op de rotator op kamertemperatuur. Tot slot, plaats de buis terug op het magnetische rek gedurende 10 minuten om de kralen pellet. Gebruik een P200 brede boring tip om 100 microliter van het eluaat over te brengen naar een 0,2 milliliter buis, en ga over tot end-repair dA-tailing en adapter ligatie reacties.Om de transposase fragmentatiegebaseerde bibliotheek voor te bereiden, moet u eerst een DNA-tagmentatiereactie maken door 22 microliter van het HMW-DNA toe te voegen, een microliter van 10 millimolar Triss, pH 8, met 0,02%Triton X-100, en 1 microliter van de fragmentatiemix, tot een buis van 0,2 milliliter. Gebruik vervolgens een P200 brede boring tip om de reactie zes keer mengen, en incubeer op 30 graden Celsius voor een minuut, gevolgd door 80 graden celsius voor een minuut. Houd op vier graden Celsius.Gebruik ten slotte een P200 brede boorpunt om de reactie over te brengen op een buis van 1,5 milliliter en voeg snel 1 microliter rapid-adapter mix toe. Gebruik een P200 brede boring tip om de reactie zes keer te mengen. Broed de reactie een uur bij kamertemperatuur uit en ga over tot sequencing.Om te beginnen met sequencing, plaats eerst een nieuwe stroomcel in een van de kanalen van het Nanopore-apparaat. Schakel vervolgens op de bijbehorende sequencing-besturingssoftware het locatievakje van de stroomcel in. Selecteer het juiste stroomceltype en klik op de werkstroom van de controlestroomcel.Klik op de starttestknop om de QC-analyse van de stroomcel te starten. Vervolgens, met een P1000 pipet ingesteld op 100 microliters, terug te trekken minder dan 30 microliter buffer om bellen te verwijderen uit de stroomcel. Voeg 30 microliters van de priming mix toe om de bovenkant van de priming-poort te bedekken om te voorkomen dat er bellen worden geïntroduceerd.Vervolgens pipette 800 microliters van de priming mix in de priming poort om de stroomcel te laden. Neem de tip wanneer er ongeveer 50 microliters van de priming mix links, en voeg de rest van de priming mix op de top van de priming poort. Voeg vervolgens met een P1000-pipet 200 microliters van het priming-mix toe in de stroomcel.Gebruik vervolgens, vlak voor het laden, een P200 pipetset op 80 microliters om de DNA-bibliotheek zes keer op en neer te pipetten. Ten slotte laadt u de mix van de bibliotheek drop-wise in de stroomcel door de voorbeeldpoort en ga u verder met de volgorde en de gegevensanalyse. QC analyse van DNA klaar voor mechanische scheren gebaseerde bibliotheek constructie resulteerde in de 260 tot 280 zuiverheid verhouding van ongeveer 1,9, en de 260 tot 230 verhouding van ongeveer 2,3, met een goed DNA-monster.Hetzelfde resultaat werd gezien met behulp van DNA ready-for-transposase fragmentatie-gebaseerde bibliotheek constructie. Grootte kwaliteitscontrole van de naald geworpen HMW DNA door pulsveld gel elektroforese bleek dat de meerderheid van de HMW DNA groter was dan 50 kilobases. De resultaten van vier runs met behulp van de HG00733-cel toonden aan dat de N50 van een mechanische schuifbibliotheek korter was dan een transposase-fragmentatiegebaseerde bibliotheek.Ook alle vier runs had meer dan 2300 leest met een lengte langer dan 100 kilobases. De maximumlengte was langer in de transposase fragmentatie-gebaseerde bibliotheken met zijn kortere voorbereidingstijd, in vergelijking met de mechanische het scheren-gebaseerde bibliotheken. De mechanische shearing-based bibliotheken geproduceerd meer totale leest in vergelijking met de transponering op basis van fragmentatie-gebaseerde bibliotheken, wat wijst op een hogere opbrengst.Beide bibliotheken toonden consistente hoge kwaliteit en meer dan 97% van hun totale bases waren afgestemd op het menselijke referentiegenoom. De verwachte grootteverdelingen toonden aan dat alle vier de runs een groot deel van de gegevens boven de 50 kilobasis hadden, terwijl transposase-fragmentatiegebaseerde bibliotheken een hogere verhouding van ultralange reads hadden. Het algemene doel is om het DNA intact te houden, dus het is belangrijk om een harde behandeling van het DNA te voorkomen.Een belangrijke factor die de waarde van de methode kan maximaliseren is de computationele analyse. Ons team heeft een langgelezen analysepijplijn ontwikkeld genaamd PICKY die een volledig scala aan SUV's met een hoge gevoeligheid kan detecteren. Het zal nieuwe wegen openen voor spannende gebieden zoals het detecteren van complexe SUV's en het faseren van herschikkingen en modificaties op het niveau van één molecuul.Dit zal ons begrip van genoomarchitectuur sterk verbeteren. Fenol is zeer corrosief. Je moet ermee werken in een rookkap met persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, veiligheidsbrillen, een labjas, lange broek en schoenen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Volautomatische centrifugale microfluïdische apparaat voor Ultragevoelige Protein Detection uit volbloed

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...