Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Die Autoren danken für ihre Bemerkungen auf die Handschrift Y. Zhu. Forschung, die in dieser Publikation berichtet wurde teilweise durch das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P30CA034196 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Im Prinzip ist Nanopore Sequenzierung 100 kb zu Megabase liest in Länge11,12,13zu generieren. Vier wichtige Faktoren wirkt sich die Leistung der Sequenzierung ausführen und Daten: 1) aktive Pore Zahlen und die Aktivität der Poren; (2) motor-Protein, das die Geschwindigkeit der DNA durch die Nanopore steuert; (3) DNA-Vorlage (Länge, Reinheit, Qualität, Masse); (4) Sequenzierung Adapter Ligatur Effizienz, die die nutzbare DNA aus der Eingabe Probe bestimmt. Die ersten beiden Faktoren hängen von der Version von der Messzelle und das Sequencing Kit des Herstellers. Die zweiten zwei Faktoren sind wichtige Schritte in diesem Protokoll (HMW DNA-Extraktion, Scheren und Ligatur).
Dieses Protokoll erfordert Geduld und Übung. Die Qualität der HMW DNA ist wichtig für ultra-lange DNA-Bibliotheken-6. Das Protokoll beginnt mit Zellen mit hoher Rentabilität (> 85 % lebensfähigen Zelle bevorzugt), Begrenzung der degradierten DNS aus abgestorbenen Zellen. Harten Prozess, der Schäden an der DNA (z. B. stark stören, schütteln, Wirbel, mehrere pipettieren, wiederholtes Einfrieren und Auftauen) vorstellen kann, sollte vermieden werden. Bei der Gestaltung des Protokolls lassen wir Pipettieren in den gesamten Prozess der DNA-Extraktion. Große Bohrung Tipps müssen verwendet werden, wenn Pipettieren nach dem mechanischen Scheren während Bibliotheksbau und Sequenzierung erforderlich ist. Da die Nanoporen empfindlich auf Chemikalien in die Kammer Puffer12sind, sollte es möglichst wenige verbleibende Verunreinigungen (z.B. Waschmittel, Tenside, Phenol, Ethanol, Proteine RNAs, etc.) wie möglich in der DNA. Angesichts der Länge und der Ertrag zeigt die Phenol-Extraktions-Verfahren die beste und am meisten reproduzierbare Ergebnisse im Vergleich mit mehreren verschiedenen Extraktionsmethoden bisher getestet.
Trotz der Fähigkeit dieses Protokolls, lange lesende Sequenzen produzieren bleiben noch mehrere Einschränkungen. Zunächst wurde dieses Protokoll optimiert, basierend auf dem Nanopore Sequenzierung Gerät zum Zeitpunkt der Veröffentlichung verfügbar; so, es beschränkt sich auf die selektive Nanopore-basierte Sequenzierung Chemie und suboptimal, wenn in anderen Gerätetypen lange lesende Sequenzierung durchgeführt werden konnte. Zweitens ist das Ergebnis stark abhängig von der Qualität der DNA extrahiert aus dem Ausgangsmaterial (Gewebe oder Zellen). Lesen Sie Länge wird gefährdet, wenn die Start DNA bereits beeinträchtigt oder beschädigt wird. Drittens, obwohl mehrere QC Schritte in das Protokoll um die DNA-Qualität aufgenommen werden, den endgültigen Ertrag und die Länge des lautet können durch die Flusszelle beeinflusst werden und pore-Aktivität, die Variable in diesem frühen Stadium der Nanopore Sequenzierung Plattform sein könnte Entwicklung.
Das Protokoll beschrieben verwendet hier menschliche Aussetzung Linie Zellproben für DNA-Extraktion. Wir haben die Weitergabe in Nadeln, Scheren, das Verhältnis von HMW DNA zu Transposase und die Ligatur-Zeit, um die beschriebenen Ergebnisse produzieren optimiert. Das Protokoll kann auf vier verschiedene Arten erweitert werden. Erstens können Benutzer mit anderen kultivierten Säugerzellen und unterschiedliche Anzahl von Zellen, Geweben, klinischen Proben oder andere Organismen beginnen. Eine weitere Optimierung auf Lyse Inkubationszeit, Reaktionsvolumen und Zentrifugation wird benötigt. Zweitens ist es schwer vorherzusagen, die Zielgröße für ultra-lange lesen Sie Sequenzierung. Wenn die lesen Sie Längen kürzer als erwartet sind, können die Benutzer stellen Sie die Zeiten vorbei in die mechanische Scheren-basierte Methode oder ändern das Verhältnis der HMW DNA in Transposase in die Transposase Fragmentierung-basierte Methode. Bindung und Elution länger während der Bereinigung Schritte sind hilfreich, weil die HMW DNA sehr zähflüssig ist. Drittens kann man mit verschiedenen Nanopore Sequenzierung Geräte, die Höhe und das Volumen der DNA die Kriterien des Sequenzers einstellen. Viertens wird nur die DNA Sequenzierung Adapter ligiert sequenziert werden. Zur Unterbindung Effizienz weiter zu steigern, kann man versuchen, die Adapter und Ligase Konzentrationen zu titrieren. Modifizierte Ligatur Zeit und molekulare crowding Mittel wie PEG18 können in Zukunft angewendet werden. Die ultra-lange DNA-Sequenzierung Protokoll kombiniert mit CRISPR19,20 kann ein effektives Ziel Bereicherung Sequenzierung anbieten.

Im letzten Jahrzehnt haben massiv parallel und hochgenaue Hochdurchsatz-zweite Generation Sequenziertechnologien eine Explosion von biomedizinischen Entdeckung und technologische Innovation1,2,3. Trotz der technischen Fortschritte die kurze lesenden Daten generiert durch die zweite Generation-Plattformen sind unwirksam bei der Lösung von komplexen genomische Regionen und sind begrenzt bei der Erkennung von genomischen strukturelle Varianten (SVs), die beim Menschen eine wichtige Rolle spielen Evolution und Krankheiten4,5. Darüber hinaus kurze gelesene Daten nicht wiederholen Variation lösen und sind ungeeignet für anspruchsvolle Haplotyp Ausstieg von genetischen Varianten6.
Jüngste Fortschritte in Einzelmolekül-Sequenzierung bietet deutlich mehr lesen Länge, die die Aufdeckung der das gesamte Spektrum der SVs7,8,9und bietet genaue und vollständige Montage des Komplexes zu erleichtern, können mikrobielle und Säugetier-Genome6,10. Die Nanopore-Plattform führt Einzelmolekül-Sequenzierung durch direkte Messung der aktuellen Veränderungen vermittelt durch DNA-Passage durch die Poren11,12,13. Im Gegensatz zu bestehenden DNA-Sequenzierung Chemie, erzeugen Nanopore Sequenzierung langer (zig Tausende von Kilobases) liest in Echtzeit ohne auf Polymerase Kinetik oder künstliche Verstärkung des DNA-Probe. Daher lange lesende Nanopore Sequenzierung (NLR-Seq) hält große Verheißung für die Erzeugung von ultra-lange lesen Sie Längen weit über 100 kb, die stark genomische und biomedizinische Analysen14fördern würde, insbesondere bei geringer Komplexität oder Repeat-reich Regionen der Genome15.
Die Besonderheit der Nanopore Sequenzierung ist, sein Potenzial zu lange ohne eine theoretische Längenbegrenzung liest. Deshalb lesen Sie Länge abhängig von der physikalischen Länge der DNA durch die DNA-Integrität und Sequenzierung Vorlage Qualität direkt betroffen ist. Darüber hinaus ist je nach Ausmaß der Manipulation und die Anzahl der Schritte, wie Pipettieren Kräfte und Extraktionsbedingungen, die Qualität der DNA sehr variabel. Daher ist es schwierig für einen zu langen liest nur mittels Standardprotokollen der DNA-Extraktion und des Herstellers mitgelieferte Bibliothek Bauweisen. Zu diesem Zweck haben wir eine robuste Methode zur Erzeugung ultralangen lesen (Hunderte von Kilobases) Sequenzierungsdaten geernteten Zelle Pellets ab. Wir haben mehrere Verbesserungen bei den DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung angenommen. Wir optimiert das Protokoll um unnötige Verfahren auszuschließen, die DNA-Schädigung und Schäden verursachen. Dieses Protokoll besteht aus hochmolekularen (HMW) DNA-Extraktion, ultra-lange DNA Bibliotheksbau und Sequenzierung auf einer Nanopore Plattform. Für ein gut ausgebildeter Molekularbiologe dauert es in der Regel 6 h aus Zelle Ernte bis zur Fertigstellung der HMW DNA-Extraktion, 90 min. oder 8 h für Bibliotheksbau je nach der Schur Methode und bis zu weitere 48 h für die DNA-Sequenzierung. Die Verwendung des Protokolls wird die Genomik Gemeinschaft zu einem besseren Verständnis des Genoms Komplexität und neue Einblicke in Genom Variation im menschlichen Krankheiten stärken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

Dritter Generation bieten Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung Technologien deutlich mehr lesen Länge, die die Montage von komplexen Genomen und Analyse von komplexen strukturellen Varianten erleichtern können. Nanopore Plattformen führen Einzelmolekül-Sequenzierung durch direkte Messung der aktuellen Veränderungen vermittelt durch DNA-Passage durch die Poren und können Hunderte von Kilobase (kb) liest mit minimalen Investitionskosten zu generieren. Diese Plattform wurde von vielen Forschern für eine Vielzahl von Anwendungen übernommen. Längere Sequenzierung lesen Sie Längen zu erreichen ist der kritischste Faktor, den Wert der Nanopore Sequenzierung Plattformen zu nutzen. Um ultralangen liest zu generieren, ist besondere Aufmerksamkeit erforderlich, um DNA-Brüche zu vermeiden und Effizienz um produktive Sequenzierung Vorlagen zu erzeugen. Hier bieten wir das ausführliche Protokoll der ultra-lange DNA-Sequenzierung einschließlich hohes Molekulargewicht (HMW) DNA-Extraktion aus frischen oder gefrorenen Zellen, Bibliotheksbau durch mechanische Scherung oder Transposase Fragmentierung und Sequenzierung auf einem Nanopore Gerät. Von 20-25 µg HMW DNA die Methode erreichen N50 lesen Länge von 50-70 kb mit mechanischen Scheren und N50 von 90-100 kb Länge mit Transposase lesen vermittelt Fragmentierung. Das Protokoll kann auf aus Säugetierzellen extrahierte DNA Sequenzierung des gesamten Genoms für den Nachweis von strukturellen Varianten und Genom Montage durchführen angewendet werden. Weitere Verbesserungen auf der DNA-Extraktion und enzymatischen Reaktionen weiter lesen Sie Länge zu erhöhen und ihre Nützlichkeit zu erweitern.

Die ultra-lange DNA-Sequenzierung Protokoll gilt für Bibliotheksbau HMW DNA. Daher ist es wichtig, gut kultivierte Zellen mit dem live-Verhältnis zu wählen > 85 % bei der Ernte Schritt Zelle. Die Menge von Zellen für die DNA-Extraktion verwendet wird die Qualität und Quantität der HMW DNA beeinflussen. Die lyse der Zelle funktioniert nicht gut, wenn zu viele Zellen ab. Mit zu wenig Zellen erzeugt nicht genügend DNA für Bibliotheksbau, da die HMW DNA-Fällung erfolgt mit sanften Drehung von hand statt High-Speed-Zentrifugation. Ein Beispiel für die HMW-DNA nach Hinzufügen von eiskalten 100 % Ethanol und drehen als der weiße baumwollähnliche Niederschlag in Abbildung 2gezeigt wird.
Es ist wichtig, die Qualität der Eingabe DNA vor Beginn der Bibliotheksbau zu überprüfen. Abbau, falsche Quantifizierung, Kontamination (z. B. Proteine, RNAs, Waschmittel, Tenside, und passives Phenol oder Ethanol) und niedrigem Molekulargewicht DNA haben erhebliche Auswirkungen auf die nachfolgenden Verfahren und auf die endgültige Länge zu lesen. Es wird empfohlen, die QC-Analyse mit der DNA von drei verschiedenen Standorten in der Röhre mit HMW DNA durchzuführen. Von UV Leseergebnisse für HMW-DNA die OD260/OD280 Wert ist ca. 1,9 und der OD260/OD230 Wert ist ungefähr 2,3 (Abb. 3AB). Diese Verhältniswerte entsprechen den drei Tests für eine gute HMW DNA-Probe. Schere Methoden erfordert unterschiedliche Volumina der Eingabe DNA. Die Konzentration der HMW DNA muss > 200 ng/µL für mechanische Scheren, während es sein muss > 1 µg/µL für Transposase Fragmentierung. Die Konzentration von einem Fluorometer erkannt ist ein wenig niedriger als UV lesen. Der Variationskoeffizient der Konzentration der gleichen HMW DNA-Probe ist jedoch erforderlich, weniger als 15 % der Fluorometer mit UV-Assays zu lesen sein. Mechanische Scheren gilt eine Spritze mit einer Nadel, die HMW-DNA zu brechen, so dass die Anzahl von Durchläufen durch die Nadel auf die Größe der DNA geschoren Auswirkungen wird und das Finale Länge lesen. Es wird empfohlen, führen Sie Größe QC, nachdem Nadel Scheren um sicherzustellen die Mehrheit der HMW DNA größer als 50 kb wie in Abbildung 4dargestellt ist. In der mechanischen Scheren-Methode erzeugt 30 Pässe die besten Sequenzierung Ergebnisse unter Berücksichtigung der Dauer und Ausgang.
Die N50 einer mechanischen Scheren-basierte Bibliothek ist 50-70 kb während eine Transposase Fragmentierung-basierte Bibliothek 90-100 kb. Die Ergebnisse der vier Läufe unter Verwendung der HG00733-Zell-Linie sind in Tabelle 1dargestellt. Alle vier Läufe haben mehr als 2.300 liest mit mehr als 100 kb Länge. Die maximale Länge ist länger in die Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheken (455 kb und 489 kb) im Vergleich mit den mechanischen Scheren-basierte Bibliotheken (348 kb und 387 kb) während die letzteren mehr Gesamtanzahl der Lesezugriffe produziert, zeigt eine höhere Ausbeute. Die Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheksbau hat weniger Schritte und kürzere Zubereitungszeit, so dass es weniger kurze Fragmente einführen wird. Die zwei Läufe mit Transposase haben eine längere durchschnittliche Länge (> 30 kb) und mittlere Länge (> 10 kb). Darüber hinaus zeigt die Daten gleich bleibend hohen Qualität in allen Läufen (mittlere Qualitätsfaktor ist ca. 10,0, ~ 90 % Basis Genauigkeit). Mehr als 97 % der gesamten Grundlagen waren die menschlichen Bezug Genom (hg19) mit Minimap216 mit den Standardeinstellungen ausgerichtet. Die erwarteten Größenverteilung des rohen lautet sind in Abbildung 5dargestellt. Alle Ausführungen haben einen Großteil der Daten über 50 kb Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheken ein höheres Verhältnis von ultra-lange liest (z. B. > 100 kb). Dieses Protokoll wurde in mehreren humanen Zelllinien (ergänzende Tabelle1) erfolgreich angewendet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Nanopore lange lesende Sequenzierung (NLR-Seq) Workflow. Orange, die Transposase Komplex. Gelb-grün, die Nanopore-Adapter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> Abbildung 2: repräsentative DNA Niederschlag aus Phenol-Chloroform Extraktionsmethode. Der weiße Pfeil zeigt die HMW-DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiel QC Ergebnisse der HMW DNA aus UV lesen. (A) HMW DNA aus Schritt 1.21.1 mechanische Scheren-basierte Bibliothek baureif. (B) HMW DNA aus Schritt 1.21.2. für Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheksbau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> Abbildung 4: QC-Ergebnisse der Nadel geschert HMW DNA durch pulsieren-auffangen Gel-Elektrophorese. L1: Schnell-Ladung 1 kb DNA-Leiter; L2: Quick-Load 1 kb DNA-Leiter zu verlängern. 1-8: DNA mit verschiedenen vorbeifahrenden Zeiten durch die Nadel Scheren. 1-3, keine Scheren; 4, 10 Mal; 5, 20 Mal; 6, 30-Mal; 7, 40-Mal; 8, 50-Mal. Dieser QC-Schritt ist optional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> Abbildung 5: Größenverteilung der Nanopore ultra-lange DNA-Bibliotheken erwartet. MS, mechanische Scheren-basierte Bibliotheken. TF, Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Mechanische shearing_rep1</td>
			<td>Mechanische shearing_rep2</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zell-Linie</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 des lautet</td>
			<td>55.180</td>
			<td>63.007</td>
			<td>98.237</td>
			<td>95.629</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der Lesevorgänge länger als 100 Kb</td>
			<td>2.500</td>
			<td>3.082</td>
			<td>2.386</td>
			<td>2.355</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der insgesamt mal gelesen</td>
			<td>97.859</td>
			<td>80.465</td>
			<td>24.166</td>
			<td>21.032</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maximale Länge (bp)</td>
			<td>348.482</td>
			<td>387.113</td>
			<td>454.660</td>
			<td>489.426</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittlere Länge (bp)</td>
			<td>17.861</td>
			<td>20.395</td>
			<td>33.528</td>
			<td>38.175</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittlere Länge (bp)</td>
			<td>5.335</td>
			<td>5.894</td>
			<td>10.249</td>
			<td>15.656</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittlere Qualität des lautet</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9.9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtunterseiten roh mal gelesen</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtunterseiten ausgerichteten mal gelesen</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zugeordneten Verhältnis von Gesamtunterseiten (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,9 %</td>
			<td>98.0 %</td>
			<td>97,7 %</td>
			<td>97,0 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der aktiven Poren</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Zusammenfassung von Leistungskennzahlen läuft mit verschiedenen Scheren Protokollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Bibliothek 1</td>
			<td>Bibliothek 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zell-Linie</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zelle Bestellinformationen</td>
			<td>ATCC, Kat. Nein. CCL-243</td>
			<td>Coriell Institut, Kat. Nein. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll</td>
			<td>mechanische Scheren</td>
			<td>mechanische Scheren</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 des lautet</td>
			<td>60.063</td>
			<td>55.295</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der insgesamt mal gelesen</td>
			<td>193.783</td>
			<td>120.807</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittlere Länge (bp)</td>
			<td>1.843</td>
			<td>4.688</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittlere Länge (bp)</td>
			<td>9.825</td>
			<td>17.408</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maximale Länge (bp)</td>
			<td>548.780</td>
			<td>212.338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtunterseiten roh mal gelesen</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtunterseiten ausgerichteten mal gelesen</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zugeordneten Verhältnis von Gesamtunterseiten (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,6 %</td>
			<td>95,0 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der aktiven Poren</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>Zusätzliche Tabelle 1: Zusammenfassung der zwei NLR-Seq-Läufe mit anderen Zelllinien mit dem mechanischen Scheren-Protokoll.

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Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Dieses Protokoll schließt eine technische Lücke in unserer Fähigkeit, ultralange Sequenz-Arrays zu generieren. Es ermöglicht uns, die Genomkomplexität zu untersuchen, die durch aktuelle Kurzleseansätze in der Genomik begrenzt wird. Die Methode ist einzigartig in Leistung, Robustheit, Vielseitigkeit und Integrationspotenzial in vielversprechenden neuen Anwendungen.Es ist auf verschiedene Materialien anwendbar und kann für verschiedene Instant-Größen moduliert werden. Diese Technik hat begonnen, die klinische Landschaft zu revolutionieren. Sein Diagnose-Nutzen bei wiederholten Expansionsstörungen hat viele aktuelle Mängel überwunden.Einige Transplantationsregister haben hochauflösende HLA-Typisierung für ein besseres klinisches Ergebnis verwendet. Diese Methoden bieten bisher unzugängliche Langzeitinformationen wie Phasing und komplexe strukturelle Varianz. Gekoppelt mit epigenetischer Auslesung in einem einzigen Test, wird es Präzisionsmedizin ermöglichen.Es ist ein langes Protokoll mit vielen neuen Techniken und es ist schwer zu wissen, ob es bis zur endgültigen Sequenzierung funktioniert. Ich empfehle, das Laden auf alten Durchflusszellen vor dem Ausführen von Proben zu üben. Mitarbeiter haben gesagt, dass einige Techniken im Vergleich zu kurzgelesenen Ansätzen verwirrend sind.Insbesondere ist die Extraktion durch die hochwertige, hochmolekulare DNA schonender. Um mit der Extraktion von HMW-DNA zu beginnen, fügen Sie zunächst 200 Mikroliter der Zellsuspension zu 10 MilliliterLysepuffer in einem 50 Milliliter-Rohr hinzu. Dann Wirbel mit der höchsten Geschwindigkeit für drei Sekunden.Und die Lösung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Am Ende der Inkubation zwei Mikroliter RNS-A in das Lysat geben. Drehen Sie das 50-Milliliter-Rohr vorsichtig, um die Probe zu mischen und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde zu brüten.Nach der Inkubation 10 Milliliter der Phenolschicht phenol-chlor-isoamyl-Alkoholgemischs in das Lysat geben. Und legen Sie das Rohr auf einen Rotator bei 20 U/min für 10 Minuten unter einer Dunstabzugshaube. Nach der Zentrifugation mit Gelröhren den Überstand vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Rohr gießen.Dann fügen Sie 25 Milliliter eiskaltes 100%Ethanol hinzu und drehen Sie das Rohr vorsichtig von Hand, bis die DNA ausscheidt. Biegen Sie eine 20-Mikroliter-Spitze, um einen Haken zu machen. Mit dem Haken, vorsichtig nehmen Sie die HMW DNA und lassen Sie die Flüssigkeit ab.Legen Sie die DNA dann in eine 50-Milliliter-Röhre mit 40 Millilitern 70% Ethanol und invertieren Sie die Tube dreimal, um die DNA zu waschen. Um die mechanische Scherbibliothek vorzubereiten, verwenden Sie zunächst eine 100 Milliliter nadelfreie Spritze, um die gesamte DNA anzustreben. Legen Sie dann eine 27-Meter-Nadel auf die Spritze und werfen Sie die gesamte DNA sanft und langsam in die Schale.Wiederholen Sie dies 29 Mal. Als nächstes fügen Sie 143 Mikroliter der wieder aufgehängten Magnetperlen und 143 Mikroliter des DNA-Reparatur-Reaktionsgemisches zu einem Rohr hinzu. Streichen Sie das Rohr sechsmal, um sanft zu mischen, und legen Sie das Rohr auf einen Rotator bei 20 U/min für 30 Minuten.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000G für zwei Sekunden bei Raumtemperatur, um die Probe zu drehen, und legen Sie das Rohr dann für 10 Minuten auf ein magnetisches Rack. Als nächstes entsorgen Sie den Überstand, während sich das Rohr noch auf dem Rack befindet. 400 Mikroliter des frisch zubereiteten 70%Ethanol hinzufügen.Warten Sie 30 Sekunden. Und dann entfernen Sie das Ethanol. Zentrifugieren Sie dann das Rohr bei 1000G für zwei Sekunden bei Raumtemperatur, um die Probe herunterzudrehen.Legen Sie das Rohr wieder auf das Magnetische Rack und entfernen Sie jegliches Restethanol. Das Pellet 30 Sekunden lang lufttrocknen. Als nächstes entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack und fügen Sie 103 Mikroliter T-E Puffer hinzu.Dann streichen Sie das Rohr sanft, um sicherzustellen, dass Perlen im Puffer bedeckt sind, und legen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Rotator. Schließlich legen Sie das Rohr wieder auf das magnetische Rack für 10 Minuten, um die Perlen zu pellet. Verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um 100 Mikroliter des Eluats auf ein 0,2 Milliliter Rohr zu übertragen, und fahren Sie mit End-Reparatur dA-Tailing und Adapter Ligation Reaktionen.Um die Transposase-Fragmentierungs-basierte Bibliothek vorzubereiten, machen Sie zunächst eine DNA-Tagmentierungsreaktion, indem Sie 22 Mikroliter der HMW-DNA, einen Mikroliter von 10 Millimolar Triss, pH 8, mit 0,02%Triton X-100 und 1 Mikroliter der Fragmentierungsmischung zu einem 0,2 Milliliter-Rohr hinzufügen. Als nächstes verwenden Sie eine P200 breite Bohrung Spitze, um die Reaktion sechs Mal zu mischen, und inkubieren bei 30 Grad Celsius für eine Minute, gefolgt von 80 Grad Celsius für eine Minute. Halten Sie bei vier Grad Celsius.Schließlich verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um die Reaktion auf eine 1,5 Milliliter-Rohr übertragen und schnell 1 Mikroliter Rapid-Adapter-Mix hinzufügen. Verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um die Reaktion sechs mal zu mischen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für eine Stunde, und fahren Sie mit der Sequenzierung fort.Um mit der Sequenzierung zu beginnen, fügen Sie zunächst eine neue Durchflusszelle in einen der Kanäle des Nanopore-Geräts ein. Aktivieren Sie dann in der begleitenden Sequenzierungssteuerungssoftware das Positionsfeld der Durchflusszelle. Wählen Sie den richtigen Durchflusszellentyp aus, und klicken Sie auf den Workflow der Prüfflusszelle.Klicken Sie auf die Schaltfläche Test starten, um die QC-Analyse der Durchflusszelle zu starten. Als nächstes, mit einer P1000 Pipette auf 100 Mikroliter eingestellt, ziehen Sie weniger als 30 Mikroliter Puffer zurück, um Blasen aus der Durchflusszelle zu entfernen. Fügen Sie 30 Mikroliter der Grundierungsmischung hinzu, um die Oberseite des Grundierungsports zu bedecken, um Blasen zu vermeiden.Dann, Pipette 800 Mikroliter der Grundierung mischen in den Grundierungsanschluss, um die Durchflusszelle zu laden. Nehmen Sie die Spitze heraus, wenn es etwa 50 Mikroliter der Grundierungsmischung links, und fügen Sie den Rest der Grundierung Mischung auf der Oberseite des Grundierungsports. Mit einer P1000 Pipette 200 Mikroliter der Grundierungsmischung in die Durchflusszelle geben.Verwenden Sie dann kurz vor dem Laden eine P200-Pipette, die auf 80 Mikroliter eingestellt ist, um die DNA-Bibliothek sechsmal auf und ab zu pipette. Laden Sie schließlich den Bibliotheksmix drop-weise in die Durchflusszelle durch den Beispielport, und fahren Sie mit der Sequenzierung und der Datenanalyse fort. Die QC-Analyse der DNA, die für den mechanischen Scherenbau bereit war, ergab ein Reinheitsverhältnis von etwa 1,9 von 260 bis 280 und ein Verhältnis von 260 zu 230 von etwa 2,3, was eine gute DNA-Probe zeigte.Das gleiche Ergebnis wurde mit DNA-ready-for-transposase Fragmentierung-basierte BibliothekKonstruktion gesehen. Die Größenqualitätskontrolle der nadelgeschorenen HMW-DNA durch Pulsfeld-Gelelektrophorese ergab, dass der Großteil der HMW-DNA größer als 50 Kilobasen war. Die Ergebnisse von vier Durchläufen mit der HG00733-Zelle zeigten, dass der N50 einer mechanischen Scherbibliothek kürzer war als eine transposase Fragmentierungsbibliothek.Außerdem hatten alle vier Läufe über 2300 Lesevorgänge mit einer Länge von mehr als 100 Kilobasen. Die maximale Länge war in den transposase fragmentierungsbasierten Bibliotheken mit ihrer kürzeren Vorbereitungszeit länger als in den mechanischen Scherbibliotheken. Die mechanischen Scherbibliotheken erzeugten mehr Gesamtlesevorgänge im Vergleich zu den transposase fragmentierungsbasierten Bibliotheken, was auf eine höhere Ausbeute hindeutet.Beide Bibliotheken zeigten eine gleichbleibend hohe Qualität und mehr als 97 % ihrer Gesamtbasen wurden mit dem menschlichen Referenzgenom in Einklang stehen. Die erwarteten Größenverteilungen zeigten, dass alle vier Durchläufe einen großen Anteil an Daten über 50 Kilobasen hatten, während transposase fragmentierungsbasierte Bibliotheken ein höheres Verhältnis von ultralangen Lesevorgängen aufwiesen. Das übergeordnete Ziel ist es, die DNA intakt zu halten, daher ist es wichtig, jeden harten Umgang mit der DNA zu vermeiden.Ein Schlüsselfaktor, der den Wert der Methode maximieren kann, ist die Berechnungsanalyse. Unser Team hat eine lang gelesene Analysepipeline namens PICKY entwickelt, die eine vollständige Palette von SVs mit hoher Empfindlichkeit erkennen kann. Es wird neue Wege für spannende Bereiche wie die Erkennung komplexer SVs und die schrittweise Umlagerung endes und Modifikationen auf der Ebene einzelner Moleküle eröffnen.Dies wird unser Verständnis der Genomarchitektur erheblich verbessern. Phenol ist sehr ätzend. Sie müssen damit in einer Dunstabzugshaube mit persönlicher Schutzausrüstung arbeiten, einschließlich Handschuhen, Schutzbrille, Labormantel, lange Hose und Schuhe.

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The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

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Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...