Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

המחברים מודים ז'ו י' על הערות על כתב היד. מחקר דיווח בפרסום זה מומן בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P30CA034196. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

<ol>
	<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+at+40:+past,+present+and+future.">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li><li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping.">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li><li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation:+insights+from+and+for+human+disease.">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li><li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+reads:+their+purpose+and+place.">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li><li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing.">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads.">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li><li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing.">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer.">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li><li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+decades+of+nanopore+sequencing.">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li><li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxford+Nanopore+MinION:+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community.">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).</li><li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+view+on+sequencing.">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome.">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li><li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPack:+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data.">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li><li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication.">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615 (2013).</li><li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+(CATCH)+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping.">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+(CATCH).">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

בעקרון, רצף nanopore הוא מסוגל לייצר 100 kb כדי קריאות megabase אורך11,12,13. ארבעה גורמים עיקריים ישפיע על הביצועים של רצף הפעלה ונתונים האיכות: 1) נקבובית פעיל מספרים וכן את פעילותם של הנקבוביות; 2) חלבון מנוע, אשר שולט על המהירות של ה-DNA עובר nanopore; 3) תבנית DNA (אורך, טוהר, איכות, המוני); 4) רצף מתאם יעילות מצדו, הקובע את ה-DNA שמיש מדגם קלט. הגורמים הראשונים תלויים בגירסה של התא זרימה, ערכת רצף המסופקים על ידי היצרן. שנית משני הגורמים הם השלבים הקריטיים פרוטוקול זה (מיצוי HMW DNA, הטיה, מצדו).
פרוטוקול זה דורש אימון וסבלנות. האיכות של ה-DNA HMW חשוב עבור ספריות DNA6ארוכים במיוחד. הפרוטוקול מתחיל עם תאים נאספו עם הכדאיות גבוהה (> תא קיימא 85% העדיפו), הגבלת את הדנ א פגום של תאים מתים. יש להימנע כל תהליך קשה אשר עלולה להציג נזק ל- DNA (למשל, חזק מפריע, רעידות, מערבולת, מרובות pipetting, חוזרות ונשנות הקפאה והפשרה של). עיצוב של הפרוטוקול, אנחנו להשמיט pipetting בתוך כל התהליך של הפקת דנ א. טיפים נשא רחב צריך לשמש כאשר pipetting יש צורך אחרי חיתוך מכני במהלך הבנייה ספריית רצף. כמו nanopores רגישים בדיקות, הביוכימיה מאגר קאמרית12, צריך להיות כמה מזהמים שיורית (למשל, חומרי ניקוי, פיתחה, פנול, אתנול, חלבונים RNAs, וכו ') ככל האפשר ב- DNA. בהתחשב האורך ואת התשואה, שיטת החילוץ פנול מראה את התוצאות הטוב ביותר ביותר לשחזור לעומת בשיטות חילוץ שונות מרובות נבדקו עד כה.
למרות היכולת של פרוטוקול זה לייצר רצף ארוך-קריאה, מספר מגבלות עדיין נשארים. ראשית, פרוטוקול זה היה מותאם המבוססת על רצף nanopore המכשיר זמין בזמן הפרסום; לפיכך, הוא מוגבל הכימיה רצף המבוסס על nanopore סלקטיבית, יכול להיות שיוצרת כאשר מבוצעת בסוגים אחרים של התקני רצף ארוך-קריאה. שנית, התוצאה תלויה מאוד האיכות של ה-DNA שחולצו מן חומר המוצא (רקמות או תאים). אורך לקריאה יסוכל אם ה-DNA מתחיל כבר מושפל או פגום. שלישית, למרות מספר השלבים QC משולבים בפרוטוקול כדי לבדוק את איכות ה-DNA, התשואה הסופית ואורך הקריאות עשויה להיות מושפעת התא זרימה ונקבוביות פעילות, אשר יכול להיות משתנה בשלב מוקדם זה של פלטפורמת רצף nanopore פיתוח.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש ההשעיה האדם תא קו דגימות להפקת DNA. לנו יש אופטימיזציה פעמים עובר את המחט הטיה, היחס של ה-DNA HMW transposase ואת הזמן מצדו כדי להפיק את התוצאות המתואר. ניתן להרחיב את הפרוטוקול בארבע דרכים. ראשית, משתמשים יכולים להפעיל אחרים בתרבית של תאים בתרבית, עם כמות שונה של תאים, רקמות, דוגמאות קליניות או אורגניזמים אחרים. יהיה צורך נוספים מיטוב על זמן הדגירה פירוק, התגובה נפח צנטריפוגה. שנית, קשה לחזות את גודל היעד עבור רצף קריאה ארוכים במיוחד. אם המרחק קריאה קצרה יותר מהצפוי, המשתמשים יכולים להתאים טיימס שעובר בהשיטה מבוססת על הטיית מכני או שינוי היחס של ה-DNA HMW transposase בשיטה מבוססת-פיצול transposase. זמן מחייבים, • תנאי יותר במהלך ניקוי צעדים מועילים בגלל ה-DNA HMW בעלי צמיגות גבוהה. שלישית, עם התקנים רצף nanopore שונים, אחד ניתן להתאים את כמות ונפח של ה-DNA כדי לענות על הקריטריונים של הרצפים (sequencer). רביעית, רק אלה DNA מאתרים למתאמים רצף להיות רציף. כדי לשפר את יעילות מצדו, אחד יכול לנסות titrate ריכוז המתאם, ליגאז. זמן מצדו ששונה וסוכנים המתגודדים מולקולרי כגון פג18 ניתן להחיל בעתיד. פרוטוקול רצפי DNA ארוכים במיוחד בשילוב עם CRISPR19,20 עשוי להציע כלי יעיל עבור היעד העשרה רצף.

בעשור האחרון, בנפט מקבילי ומונהג טכנולוגיות ומדויקים רצף תפוקה גבוהה הדור השני יש פיצוץ של גילוי הביו-רפואית של חדשנות טכנולוגית1,2,3. למרות ההתקדמות הטכנית, את הנתונים קצר-קריאה שנוצר על ידי הדור השני פלטפורמות אינם יעילים בפתרון מורכב אזורים גנומית ואת מוגבלים זיהוי של משתנים מבניים גנומית (SVs), ממלאים תפקיד חשוב-אנוש האבולוציה ומחלות4,5. יתר על כן, קצר-קריאת נתונים אינן מצליחות לפתור וריאציה. אני חוזר, הזדהמו אניני טעם haplotype בהדרגה של וריאציות גנטיות6.
התקדמות אחרונים מולקולה בודדת רצף מציע באופן משמעותי יותר לקרוא את אורך, דבר היכול להקל על הזיהוי את מלוא הספקטרום של SVs7,8,9, והרכבה הצעות מלאים ומדויקים של המתחם הגנום של חיידקים, בתרבית של6,10. פלטפורמת nanopore מבצעת רצף מולקולה בודדת על-ידי ישירות מדידת השינויים הנוכחיים מתווכת על-ידי ה-DNA מעבר דרך הנקבוביות11,12,13. בניגוד ביננו כימיה רצפי DNA הקיים, nanopore הרצף ניתן להפיק קריאות רב (עשרות אלפי kilobases) בזמן אמת בלי להסתמך על פולימראז קינטיקה או מלאכותי הגברה דגימת דנ א. לכן, nanopore לונג-קריאה רצף (NLR-seq) מביאות הבטחה גדולה ליצירת באורכים ארוכים במיוחד לקרוא הרבה מעבר 100 kb, אשר במידה רבה מראש ניתוח גנומי וביו14, בפרט המורכבות נמוך או חוזר-עשיר אזורים של הגנום15.
התכונה הייחודית של רצף nanopore הוא הפוטנציאל ליצירת זמן קורא ללא מגבלה תאורטית אורך. לכן, האורך קריאה הוא תלוי אורך הפיזית של ה-DNA אשר מושפע ישירות איכות תבנית ה-DNA תקינות ורצף. יתר על כן, בהתאם להיקף של מספר הצעדים מעורב, כגון pipetting כוחות ומצבים החילוץ מניפולציה, האיכות של ה-DNA זה משתנה מאוד. לכן, זה מאתגר עבור אחד להניב קריאות ארוך על-ידי החלת רק הפרוטוקולים מיצוי DNA סטנדרטיים ושיטות הבנייה של היצרן ספריית שסופקו. לצורך כך, פיתחנו חזקים של שיטה להפקת ארוכים במיוחד לקרוא (מאות kilobases) רצף נתונים החל מתא שנקטפו כדורי. אימצנו מספר שיפורים בהליכים DNA החילוץ וספריית הכנה. אנחנו אווירודינמית פרוטוקול להוציא נהלים מיותרות הגורמות DNA השפלה ונזקים. פרוטוקול זה מורכב משקל מולקולרי גבוה (HMW) הפקת דנ א, בנייה ספריית הדי ארוכים במיוחד, רצף על פלטפורמה nanopore. עבור ביולוג מולקולרי מאומנים היטב, זה בדרך כלל לוקח 6 שעות מתא הקטיף ועד לסיום של HMW DNA החילוץ, 90 דקות או 8 שעות לבנייה ספריה בהתאם לשיטת ההטיה, ועד של 48 שעות נוספות עבור רצפי DNA. השימוש בפרוטוקול אטיל הקהילה גנומיקה לשפר את ההבנה שלנו של הגנום המורכבות ולהשיג תובנה חדשה הגנום וריאציה של מחלות אנושיות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

דור שלישי יחיד מולקולה DNA רצף טכנולוגיות מציעים באופן משמעותי יותר לקרוא אורך זה יכול להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים וניתוח של משתנים מבניים מורכבים. Nanopore לבצע רצף מולקולה בודדת על-ידי ישירות מדידת השינויים הנוכחיים מתווכת על-ידי ה-DNA מעבר דרך הנקבוביות ופלטפורמות יכול להפיק מאות קריאות kilobase (kb) במינימום עלות ההון. פלטפורמה זו אומץ על ידי חוקרים רבים למגוון רחב של יישומים. השגת עוד רצף אורכי קריאה היא הגורם הקריטי ביותר למנף את הערך של nanopore רצף פלטפורמות. כדי להפיק קריאות ארוכים במיוחד, שיקולים מיוחדים נדרשת כדי למנוע ה-DNA לנזקי השבירה ולהשיג יעילות כדי ליצור רצף פרודוקטיבי תבניות. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול מפורט של רצפי DNA ארוכים במיוחד כולל משקל מולקולרי גבוה (HMW) ה-DNA מיצוי מתאי טרי או קפוא, ספריית בנייה על ידי הטיית מכני או פיצול transposase, וסדר במכשיר nanopore. µG 20-25 של ה-DNA HMW, השיטה ניתן להשיג N50 לקרוא באורך של 50-70 kb עם הטיית מכני, N50 של 90-100 kb לקרוא אורך עם transposase מתווכת פיצול. הפרוטוקול ניתן ליישם DNA מופק בתרבית של תאים כדי לבצע רצף הגנום כולו איתור משתנים מבניים והרכבה הגנום. שיפורים נוספים על מיצוי הדנ א ואת תגובות אנזימטיות נוספת להאריך את אורך הקריאה, להרחיב את השירות שלה.

פרוטוקול ארוכים במיוחד של רצפי דנ א חל HMW DNA לבנייה הספרייה. לכן, חשוב לבחור תאים בתרבית היטב עם יחס בשידור חי > 85% מהתא קציר שלב. כמות התאים המשמש להפקת DNA ישפיעו על האיכות והכמות של ה-DNA HMW. פירוק התא לא עובד טוב אם מתחיל עם תאים רבים מדי. באמצעות תאים מעט מדי אינו יוצר מספיק דנ"א לבנייה ספריית כי המשקעים HMW DNA מתבצע באמצעות סיבוב עדין בעבודת יד במקום צנטריפוגה במהירות גבוהה. דוגמה של ה-DNA HMW לאחר הוספת אתנול 100% קר כקרח וסיבוב הוא כמוצג את התמיסה כמו כותנה לבן באיור2.
חשוב לבדוק את איכות הקלט DNA לפני תחילת בניית ספריה. השפלה, כימות שגוי, זיהום (למשל, חלבונים, RNAs, חומרי ניקוי, חומרים פעילי שטח, ו שיורית פנול או אתנול) ו- DNA משקל מולקולרי נמוך יכולה להיות השפעה משמעותית על ההליכים הבאים ועל הגמר לקרוא אורך. אנו ממליצים על ביצוע הניתוח QC באמצעות ה-DNA ממקומות שונים שלושה בצינור המכילה HMW DNA. מ- UV קריאת תוצאות ה-DNA HMW, הערך280 OD /OD260הוא כ 1.9, הערך230 260OD /OD הוא כ 2.3 (איור 3 אב'). ערכים אלה יחס הם עקביים בין שלושת המבחנים דגימת HMW DNA טוב. שיטות ההטיה שונים דורש בנפחים שונים של DNA קלט. הריכוז של ה-DNA HMW צריך להיות > 200 ng/µL עבור הגז מכני בזמן זה צריך להיות > 1 µg µL transposase שאין בהם פיצול. ריכוז שזוהה על-ידי fluorometer הוא מעט נמוך יותר UV קריאה. עם זאת, המקדם של וריאציה של ריכוז HMW לדנ אותו נדרש להיות פחות מ- 15% את fluorometer וגם את UV קריאת מבחני. הטיית מכני חלה מזרק עם מחט כדי לשבור את ה-DNA HMW כך מספר עובר דרך המחט תשפיע על הגודל של ה-DNA הוטו ולקרוא הסופי אורך. מומלץ לבצע גודל QC לאחר המחט הטיה על מנת להבטיח את הרוב של ה-DNA HMW הוא גדול יותר מאשר 50 קילובייט כמופיע באיור4. שיטת חיתוך מכני, עובר 30 שנוצר התוצאות רצף בהתחשב באורך והן פלט.
N50 של ספריה מבוסס על חיתוך מכני הוא 50-70 kb אמנם ספרייה המבוססת על פיצול transposase 90-100 kb. התוצאות של ארבע ריצות באמצעות קו תא HG00733 מוצגים בטבלה 1. כל ארבע ריצות יש קריאות מעל 2,300 עם אורך יותר מ 100 kb. האורך המקסימלי הוא ארוך יותר בספריות transposase המבוסס על פיצול (455 kb, 489 kb) בהשוואה עם ספריות מבוסס על חיתוך מכני (348 kb ו- 387 kb) בזמן האחרון המיוצר קריאות סכום נוסף, המציין תשואה גבוהה יותר. בניית הספרייה מבוססת-פיצול transposase יש לו פחות שלבים, זמן הכנה קצר יותר כך זה תציג פחות קטעים קצרים. שתי ריצות באמצעות transposase יש אורך מרושע יותר (> 30 kb) ואורך החציוני (> 10 kb). בנוסף, מציג הנתונים גבוהה ועקבית של איכות כל הרצפים (ציון איכות רשע הוא כ 10.0, ~ 90% הבסיס דיוק). יותר מ- 97% הבסיסים סה כ היו המיושר הגנום האנושי הפניה (hg19) באמצעות Minimap216 עם הגדרות ברירת המחדל. ההפצות הגודל הצפוי הקריאות raw מוצגים באיור5. כל הרצפים יש אחוז גדול של נתונים מעל 50 kb transposase המבוסס על פיצול ספריות יש יחס גבוה יותר של קריאות ארוכים במיוחד (למשל > 100 kb). פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר שורות תאים אנושיים (משלים טבלה 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטי של זרימת העבודה רצף ארוך-קריאה (NLR-seq) nanopore. כתום, transposase מורכבים. צהוב ירוק, המתאם nanopore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> איור 2: נציג ה-DNA משקעים של שיטת החילוץ פנול-כלורופורם. החץ הלבן מציין את ה-DNA HMW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> איור 3: דוגמה QC תוצאות ה-dna HMW מקריאה UV. דנ א מ שלב 1.21.1 מוכן לבנייה ספריית מבוסס על חיתוך מכני (א) HMW. דנ א מהשלב 1.21.2 לבנייה הספרייה מבוססת-פיצול transposase (B) HMW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> איור 4: QC תוצאות של המחט לכסנתם HMW DNA על-ידי שדה פעמו בג'ל. L1: מטען מהיר 1 kb סולם הדנ א; L2: מטען מהיר 1 kb להרחיב סולם הדנ א. 1-8: DNA עם פטירתו שונה פעמים דרך המחט אמש. 1-3, לא הטיה; 4, 10 פעמים; 5, 20 פעמים; 6. 30 פעמים; 7, 40 פעמים; 8, 50 פעמים. שלב זה QC היא אופציונלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> איור 5: צפוי הפצות גודל הספריות הדי ארוכים במיוחד של nanopore. MS, ספריות מבוסס על חיתוך מכני. TF, transposase מבוסס על פיצול ספריות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Shearing_rep1 מכני</td>
			<td>Shearing_rep2 מכני</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>תא קו</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 הקריאות</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר הקריאות יותר מ-100 Kb</td>
			<td>2,500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2,355</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר הקריאות סה</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>האורך המרבי (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>כלומר אורך (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך החציוני (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>זאת אומרת איכות הקריאות</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9.9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה כ בסיסים הקריאות raw</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה כ בסיסים הקריאות מיושר</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>יחס ממופה של בסיסים הכולל (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96.9%</td>
			<td>98.0%</td>
			<td>97.7%</td>
			<td>97.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר הנקבוביות פעיל</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סיכום של מדדי ביצועים פועל עם פרוטוקולים חיתוך שונות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ספריית 1</td>
			<td>ספריית 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>תא קו</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>תא פרטי הזמנה</td>
			<td>בקרת האוויר, החתול. לא. CCL-243</td>
			<td>מכון Coriell, חתול. לא. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>פרוטוקול</td>
			<td>הטיית מכני</td>
			<td>הטיית מכני</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 הקריאות</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר הקריאות סה</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך החציוני (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>כלומר אורך (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>האורך המרבי (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה כ בסיסים הקריאות raw</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה כ בסיסים הקריאות מיושר</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>יחס ממופה של בסיסים הכולל (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96.6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר הנקבוביות פעיל</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>משלים טבלה 1: סיכום של שתי ריצות NLR-seq באמצעות שורות תאים אחרים עם פרוטוקול חיתוך מכני.

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

פרוטוקול זה ממלא פער טכני ביכולתנו ליצור מערכי רצף ארוכים במיוחד. היא מאפשרת לנו לבחון את מורכבות הגנום המוגבלת על ידי גישות הנוכחיות לקריאה קצרה בגנומיקה. השיטה ייחודית בביצועים, חוסן, רב-תכליתיות ופוטנציאל להשתלב עם יישומים חדשים ומבטיחים.זה חל על חומרים שונים והוא יכול להיות לווסת עבור גדלים מידיים שונים. טכניקה זו החלה לחולל מהפכה בנוף הקליני. כלי האבחון שלה בהפרעות התרחבות חוזרות התגבר על חסרונות נוכחיים רבים.כמה רישומי השתלות ניצלו הקלדת HLA ברזולוציה גבוהה לתוצאה קלינית טובה יותר. שיטות אלה מספקות מידע ארוך טווח שלא היה נגיש בעבר, כגון phasing ושונות מבנית מורכבת. יחד עם קריאה אפיגנטית במבחן אחד, זה יאפשר רפואה מדויקת.זה פרוטוקול ארוך עם הרבה טכניקות חדשות וקשה לדעת אם זה עובד עד רצף סופי. אני ממליץ לתרגל טעינה על תאי זרימה ישנים לפני הפעלת דגימות. משתפי פעולה אמרו כמה טכניקות מבלבלות בהשוואה לגישות קריאה קצרה.באופן ספציפי, החילוץ הוא עדין יותר בשל איכות גבוהה, משקל מולקולרי גבוה DNA. כדי להתחיל את החילוץ של ה-DNA HMW, תחילה להוסיף 200 microliters של ההשעיה התא ל 10 מיליליטר של חיץ תזה בצינור 50 מיליליטר. לאחר מכן, מערבולת במהירות הגבוהה ביותר במשך שלוש שניות.ו דגירה הפתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, מוסיפים שני מיקרוליטרים של RNS-A לליאזט. בעדינות לסובב את הצינור 50 מיליליטר לערבב את המדגם דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, מוסיפים 10 מיליליטר של שכבת פנול של פנול-כלורופורם-isoamyl אלכוהול תערובת ליסנט. ולשים את הצינור על מסובב ב 20 סל"ד במשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע אדים. לאחר צנטריפוגה עם צינורות ג'ל, בזהירות לשפוך את supernatant לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.לאחר מכן, מוסיפים 25 מיליליטר של אתנול 100% קר כקרח, ומסובבים בעדינות את הצינור ביד, עד שהדנ"א מזרז. לכופף קצה 20 microliter כדי להפוך את וו. באמצעות הקרס, בזהירות להוציא את ה-DNA HMW ולתת לנוזל לרדת.לאחר מכן, מניחים את הדנ"א לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר של 70% אתנול, בעדינות להפוך את הצינור שלוש פעמים כדי לשטוף את ה-DNA. כדי להכין את הספרייה מבוססת ההטיה המכנית, השתמש תחילה במזרק ללא מחטים באורך 100 מיליליטר כדי לשאוף לכל הדנ"א. לאחר מכן, לשים מחט 27 מד על המזרק ולפלט את כל ה-DNA לתוך המנה בעדינות ולאט.חזור 29 פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 143 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים שהושעו מחדש ו-143 מיקרוליטרים של תערובת תגובת תיקון הדנ"א לצינור. מקפיצים את הצינור שש פעמים כדי לערבב בעדינות, ולשים את הצינור על מסובב ב 20 סל"ד במשך 30 דקות.צנטריפוגה הצינור ב 1000G במשך שתי שניות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את המדגם, ולאחר מכן למקם את הצינור על מתלה מגנטי במשך 10 דקות. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי בזמן שהצינור עדיין על המדף. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של אתנול 70%.חכה 30 שניות. ואז להסיר את האתנול. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 1000G במשך שתי שניות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את המדגם.מניחים את הצינור בחזרה על המדף המגנטי ולהסיר כל אתנול שיורית. לייבש את הכדור במשך 30 שניות. לאחר מכן, הסר את הצינור מהמתלה המגנטי והוסף 103 מיקרוליטרים של מאגר T-E.לאחר מכן, להעיף את הצינור בעדינות כדי להבטיח כי חרוזים מכוסים במאגר ולשים את הצינור על המסובב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לבסוף, מניחים את הצינור בחזרה על המדף המגנטי במשך 10 דקות כדי גלולה את חרוזים. השתמש טיפ נשא P200 רחב להעביר 100 microliters של eluate לצינור 0.2 מיליליטר, ולהמשיך סוף תיקון dA-tailing ותגובות קשירה מתאם.כדי להכין את הספרייה מבוססת פיצול טרנספוזאז, תחילה לעשות תגובת תג DNA על ידי הוספת 22 microliters של ה-DNA HMW, מיקרוליטר אחד של 10 מילימולרים טריס, pH 8, עם 0.02% טריטון X-100, ו 1 microliter של תערובת הפיצול, לצינור 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בקצה נשא ברוחב P200 כדי לערבב את התגובה שש פעמים, ותדקרו ב-30 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואחריה 80 מעלות צלזיוס לדקה אחת. החזק בארבע מעלות צלזיוס.לבסוף, השתמש בקצה נשא ברוחב P200 כדי להעביר את התגובה לצינור 1.5 מיליליטר ולהוסיף במהירות 1 microliter של תערובת מתאם מהיר. השתמש טיפ נשא P200 רחב לערבב את התגובה שש פעמים. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ולהמשיך רצף.כדי להתחיל ברצף, הכנס תחילה תא זרימה חדש לאחד הערוצים של התקן Nanopore. לאחר מכן, בתוכנת בקרת רצף הנלווית, סמן את תיבת המיקום של תא הזרימה. בחר את סוג תא הזרימה הנכון ולחץ על זרימת העבודה של תא זרימת הסימון.לחץ על כפתור הבדיקה להתחיל כדי להתחיל את ניתוח QC תא זרימה. לאחר מכן, עם פיפטה P1000 מוגדר 100 microliters, למשוך בחזרה פחות מ 30 microliters של מאגר כדי להסיר בועות מתא הזרימה. הוסף 30 microliters של תערובת priming כדי לכסות את החלק העליון של היציאה priming כדי למנוע החדרת בועות.לאחר מכן, פיפטה 800 מיקרוליטרים של תערובת priming לתוך היציאה priming לטעון את תא הזרימה. מוציאים את הקצה כאשר יש כ -50 microliters של תערובת priming שמאלה, ולהוסיף את שאר תערובת priming על החלק העליון של הנמל priming. לאחר מכן, עם פיפטה P1000, להוסיף 200 microliters של תערובת priming לתוך תא הזרימה.לאחר מכן, ממש לפני הטעינה, השתמש בפיגט P200 מוגדר ל 80 microliters כדי pipette למעלה ולמטה ספריית ה-DNA שש פעמים. לבסוף, טען את הספריה לערבב טיפה חכם לתוך תא הזרימה דרך היציאה לדוגמה, ולהמשיך רצף וניתוח הנתונים. ניתוח QC של DNA מוכן לבניית ספרייה מבוססת גימה מכנית הביא יחס טוהר 260 עד 280 של כ 1.9, ואת היחס 260 כדי 230 של כ 2.3, מראה מדגם DNA טוב.אותה תוצאה נראתה באמצעות בניית ספרייה מבוססת פיצול DNA מוכן להמרה. בקרת איכות גודל של DNA HMW מגונבט מחט על ידי אלקטרופורזה ג'ל שדה הדופק הראה כי רוב ה-DNA HMW היה גדול מ 50 קילו-באז. התוצאות של ארבע ריצות באמצעות תא HG00733 הראו כי N50 של ספריה מבוססת גיזום מכני היה קצר יותר מאשר ספרייה מבוססת פיצול טרנספוסאז.כמו כן, בכל ארבעת הריצות היו מעל 2300 קריאות באורך של יותר מ-100 קילו-בבס. האורך המרבי היה ארוך יותר בספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז עם זמן ההכנה הקצר יותר שלה, בהשוואה לספריות מבוססות ההטעיה המכנית. הספריות המכאניות המבוססות על צביעה יצרו קריאות כוללות יותר בהשוואה לספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז, מה שמצביע על תשואה גבוהה יותר.שתי הספריות הראו איכות גבוהה עקבית ויותר מ -97% מכלל הבסיסים שלהם היו מיושרים עם הגנום התייחסות אנושית. התפלגות הגודל הצפויה הראתה שלרבעת הריצות היה חלק גדול מהנתונים מעל 50 קילו-באז, בעוד שלספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז היה יחס גבוה יותר של קריאות ארוכות במיוחד. המטרה הכוללת היא לשמור על הדנ"א שלם, ולכן חשוב להימנע מטיפול קשה בדנ"א.גורם מפתח שיכול למקסם את ערך השיטה הוא הניתוח החישובי. הצוות שלנו פיתח צינור ניתוח ארוך שנקרא PICKY שיכול לזהות מגוון רחב של רכבי שטח עם רגישות גבוהה. הוא יפתח אפיקים חדשים לאזורים מרגשים כמו זיהוי רכבי שטח מורכבים וסידורים מחדש ושינויים ברמת המולקולה הבודדת.זה ישפר מאוד את ההבנה שלנו של ארכיטקטורת הגנום. פנול מאוד מאכל. אתה חייב לעבוד עם זה ברדס אדים עם ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות, חלוק מעבדה, מכנסיים ארוכים ונעליים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...