Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Авторы благодарят Y. Чжу за ее замечания по рукописи. Исследования, сообщили в настоящем издании частично поддерживается национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P30CA034196. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

<ol>
	<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+at+40:+past,+present+and+future.">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li><li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping.">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li><li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation:+insights+from+and+for+human+disease.">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li><li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+reads:+their+purpose+and+place.">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li><li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing.">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads.">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li><li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing.">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer.">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li><li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+decades+of+nanopore+sequencing.">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li><li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxford+Nanopore+MinION:+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community.">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).</li><li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+view+on+sequencing.">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome.">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li><li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPack:+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data.">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li><li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication.">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615 (2013).</li><li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+(CATCH)+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping.">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+(CATCH).">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

В принципе секвенирование Нанопор способен генерировать 100 КБ до megabase читает в длину11,12,13. Четыре основных фактора влияют на производительность последовательности выполнения и качества данных: 1) числа активных поры и деятельность поры; 2) мотор белок, который контролирует скорость ДНК, проходя через Нанопор; 3) ДНК шаблон (длина, чистоту, качество, массовые); 4) последовательности адаптер лигирование эффективность, которая определяет полезной ДНК из образца ввода. Первые два фактора зависят от версии потока ячейки и комплект последовательности, представленной изготовителем. Вторая два фактора являются важнейшие шаги в настоящем Протоколе (экстракции ДНК HMW, стрижка и маточных труб).
Этот протокол требует терпения и практики. Для ультра-долгий библиотеки ДНК6важно качество HMW ДНК. Протокол начинается с клетки, собранные с высокой жизнеспособности (> 85% жизнеспособных клеток предпочитали), ограничивая деградации ДНК от мертвых клеток. Следует избегать любых суровых процесс, который может ввести повреждений ДНК (например, сильное беспокойство, пожимая, вихря, несколько дозирования, неоднократные замораживания и оттаивания). В разработке протокола мы опускаем, дозирование в весь процесс экстракции ДНК. Широкое отверстие советы должны быть использованы когда закупорить необходим после механической резки во время строительства библиотеки и последовательности. Как Нанопоры чувствительны к химия в камеру буфера12, должна существовать как несколько остаточных загрязнителей (например, моющие средства, ПАВ, фенол, этанол, белки РНК, и т.д.) как можно скорее в ДНК. Учитывая длину и урожайности метод экстракции фенольных показывает лучшие и наиболее воспроизводимые результаты, по сравнению с несколькими различных извлечения методы испытания пока.
Несмотря на способность производить Лонг чтения последовательности, этот протокол по-прежнему остаются некоторые ограничения. Во-первых этот протокол был оптимизирован на основе Нанопор последовательности устройства, имеющиеся на момент публикации; Таким образом он ограничивается выборочной основе Нанопор последовательности химии и может быть неоптимальной, когда выступал в других типов устройств Лонг чтения последовательности. Во-вторых результат сильно зависит от качества ДНК, извлеченные из исходного материала (ткани или клетки). Чтение длина будет снижена, если начальный ДНК уже деградированных или повреждены. В-третьих хотя несколько КК шаги включены в протокол для проверки качества ДНК, окончательный выход и длина гласит могут быть затронуты в ячейку потока и поры деятельность, которая может быть переменной на этой ранней стадии Нанопор виртуализации платформы развития.
Протокол, в описанный здесь использует образцы линии клетки человека подвеска для экстракции ДНК. Мы оптимизировали проходящей раз в иглу, стрижка, соотношение HMW ДНК Транспозаза и перевязка времени для получения результатов, описанных. Протокол может быть расширен четырьмя способами. Во-первых пользователи могут начать с других культивируемых клеток млекопитающих и различное количество клеток, тканей, клинические образцы или других организмов. Потребуется дальнейшая оптимизация на время инкубации лизиса, том реакции и центрифугирования. Во-вторых это трудно предсказать размер целевого для ультра-долгий чтения последовательности. Если чтение длина короче, чем ожидалось, пользователи могут настроить проходящей раз в механический метод, основанный на стрижки или изменить отношение HMW ДНК в Транспозаза в методе Транспозаза на основе фрагментации. Длиннее время привязки и элюции во время очистки шаги полезны, потому что HMW ДНК вязкие. В-третьих с различными Нанопор последовательности устройств, один можно настроить количество и объем ДНК, чтобы соответствовать критериям программы sequencer. В-четвертых будет виртуализированных только ДНК, лигируют последовательности адаптерам. Для дальнейшего повышения эффективности перевязки, одно может попытаться Титруйте адаптер и лигаза концентрации. Изменение лигирование время и молекулярных скоплению агентов, таких как PEG18 может применяться в будущем. Ультра-длинный протокол секвенирования ДНК в сочетании с ТРИФОСФАТЫ19,20 может предложить эффективный инструмент для обогащения последовательности целевого объекта.

За последнее десятилетие массивно параллельной и высокоточные второго поколения высокопроизводительного секвенирования технологии заставили взрыв биомедицинских открытий и технологических инноваций в1,2,3. Несмотря на технический прогресс короткие чтение данных, генерируемых второго поколения платформы являются неэффективными в урегулировании сложных регионах геномной и ограничены в обнаружении геномной структурных вариантов (СВС), которые играют важную роль в человека Эволюция и болезней4,5. Кроме того короткий чтение данных не удается разрешить повторные изменения и непригодны для взыскательных гаплотип поэтапного генетических вариантов6.
Недавний прогресс в одной молекулы последовательности предлагает значительно больше читать длина, которая может облегчить обнаружение полный спектр СВС7,8,9, и предлагает точные и полные собрания комплекса микробов и млекопитающих геномов6,10. Нанопор платформа выполняет секвенирование одной молекулы, непосредственно измерения текущих изменений при посредничестве ДНК прохода через поры11,12,13. В отличие от любых существующих химия секвенирования ДНК, Нанопор последовательности может генерировать Лонг (десятки тысяч kilobases) читает в режиме реального времени, не полагаясь на кинетику полимеразы или искусственные амплификации ДНК образца. Таким образом Нанопор Лонг чтения последовательности (РНБ seq) имеет большие перспективы для создания ультра-чтения длинных далеко за 100 КБ, что значительно ускорит геномных и биомедицинских анализов14, особенно в низкой сложности или повторить богатые регионы в геномах15.
Уникальная особенность Нанопор последовательности является его способность генерировать длинный читает без ограничения теоретическая длина. Таким образом чтение длина зависит от физической длина ДНК, которая напрямую зависит от качества шаблон целостности и последовательности ДНК. Кроме того в зависимости от степени манипуляции и количество шагов, например дозирования сил и условий извлечения, качество ДНК является крайне непостоянны. Таким образом это является сложной задачей для одного, чтобы принести долго читает, просто применив стандартные протоколы извлечения дна и производителя предоставленного библиотеки строительных методов. С этой целью мы разработали надежный метод для создания ультра-долгий читать (сотни kilobases) последовательности данных, начиная от заготовленных клеток окатышей. Мы приняли несколько улучшений в процедуре подготовки ДНК добычи и библиотека. Мы рационализированы протокол для исключения ненужных процедур, которые вызывают деградации ДНК и убытки. Этот протокол состоит из высокой молекулярной массой (HMW) экстракции ДНК, ультра-длинный строительство библиотеки ДНК и последовательности на платформе Нанопор. Для хорошо подготовленных молекулярный биолог обычно занимает 6 h от заготовки до завершения извлечения HMW ДНК, 90 мин или 8 h для строительства библиотеки в зависимости от метода сдвига и еще 48 h для секвенирования ДНК клетки. Использование протокола позволит геномики сообщество для улучшения нашего понимания сложности генома и получить новое понимание изменения генома в заболеваниях человека.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

Третьего поколения, что сингл молекула ДНК последовательности технологии предлагают значительно больше читать длина, которая может содействовать Ассамблея сложных геномов и анализ сложных структурных вариантов. Нанопор платформах выполняют одной молекулы последовательности непосредственно измеряя текущие изменения, при посредничестве ДНК проход через поры и может генерировать сотни читает kilobase (КБ) с минимальными затратами капитала. Эта платформа была принята многими исследователями для различных приложений. Достижения длины последовательности чтения является наиболее важным фактором использовать значение Нанопор виртуализации платформ. Для создания ультра-длинный читает, особое внимание требуется избежать поломки ДНК и повышение эффективности для создания производственной последовательности шаблоны. Здесь мы предоставляем подробный протокол долговечный секвенирования ДНК, включая экстракции ДНК высокой молекулярной массой (HMW) из свежих или замороженных клеток, Библиотека строительство механической резки или Транспозаза фрагментации и виртуализации на устройстве Нанопор. От 20-25 мкг HMW ДНК метод можно добиться N50, читать длиной 50-70 КБ с механической резки и N50 90-100 КБ читать длина с Транспозаза при посредничестве фрагментации. Протокол может применяться к ДНК, извлеченные из клеток млекопитающих для выполнения всего генома для выявления структурных вариантов и геном Ассамблеи. Дополнительные усовершенствования на экстракции ДНК и ферментативных реакций будет далее увеличить длину чтения и расширять его полезности.

Ультра-длинный протокол секвенирования ДНК применяется HMW ДНК на строительство библиотеки. Таким образом, важно выбрать хорошо культивируемых клеток с живой соотношение > 85% в ячейку шаг для сбора урожая. Количество ячеек, которые используются для извлечения ДНК будет влиять на качество и количество HMW ДНК. Лизис клеток не хорошо работать, если начиная с слишком много клеток. Использование слишком мало клеток не создает достаточно ДНК на строительство библиотеки потому что осадков HMW ДНК выполняется с использованием мягкое вращение вручную вместо высокоскоростной центрифуги. Пример HMW ДНК после добавления ледяной 100% этанола и вращения отображается как Белый преципитат хлопок как на рисунке 2.
Важно проверить качество ввода ДНК до начала строительства библиотеки. Деградации, неправильный количественной оценки, загрязнения (например, белки, РНК, моющие средства, ПАВ и остаточные фенол или этанола) и низкомолекулярных ДНК может иметь значительное влияние на последующих процедур и на финале читать длины. Рекомендуется выполнять с помощью ДНК из трех различных мест в пробирку, содержащую HMW ДНК анализ КК. От УФ чтение результатов для HMW ДНК ОД260/OD280 значение приблизительно 1.9 и ОД260/OD230 значение приблизительно 2.3 (Рисунок 3АB). Эти значения коэффициента согласуются среди трех тестов для хорошей HMW ДНК образца. Различные методы стрижка требует различных объемов ввода ДНК. Концентрация ДНК HMW должна быть > 200 нг/мкл для механической резки в то время как она должна быть > 1 мкг/мкл Транспозаза фрагментации. Концентрация определяется флуориметр немного ниже, чем УФ чтения. Однако коэффициент вариации концентрации же HMW ДНК образца должен быть менее 15% с флуориметр и УФ, чтение анализов. Механической резки применяется шприц с иглой сломать HMW ДНК, так что количество проходов через иглу будет влиять размер стриженый ДНК и финал читать длины. Рекомендуется выполнять размер КК, после того, как иглы, Ножницы механические для обеспечения большинства HMW ДНК больше чем 50 КБ, как показано на рисунке 4. В методе механических ножниц 30 проходит созданы наилучшие результаты секвенирования, учитывая длину и вывода.
N50 механических стрижки на основе библиотеки составляет 50-70 КБ Транспозаза библиотека на основе фрагментации при 90-100 КБ. Результаты четырех трасс с использованием линии клетки HG00733 приведены в таблице 1. Все четыре трассы имеют более 2300 читает с длиной более 100 КБ. Максимальная длина больше в Транспозаза на основе фрагментации библиотек (455 kb и 489 kb) по сравнению с механическим библиотеки на основе сдвига (348 КБ и 387 kb) хотя последний больше всего читает, указав более высокую доходность. Строительство на основе фрагментации библиотека Транспозаза имеет меньше шагов и короче время приготовления так, что он представит меньше короткие фрагменты. Две трассы, с помощью Транспозаза имеют больше средней длины (> 30 КБ) и средней длины (> 10 КБ). Кроме того данные показывает высокого качества в всех прогонов (показатель среднего качества является приблизительно 10.0, ~ 90% базовая точность). Более 97% всего баз были выровняны к геном человека ссылки (hg19), с помощью Minimap216 с параметрами по умолчанию. Ожидаемый размер распределения сырья гласит показаны на рисунке 5. Все запуски имеют значительную долю данных выше 50 КБ, а Транспозаза на основе фрагментации библиотеки имеют более высокий коэффициент, ультра-длинный гласит (например > 100 kb). Этот протокол был успешно применяется в нескольких линий клеток человека (Дополнительная таблица 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> Рисунок 1: схема обзор процесса Нанопор Лонг чтения последовательности (РНБ seq). Оранжевый, Транспозаза комплекс. Желто зеленый, Нанопор адаптер. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> Рисунок 2: представитель ДНК осадков от метода извлечения фенол хлороформ. Белая стрелка указывает HMW ДНК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> Рисунок 3: пример QC результаты HMW ДНК от УФ чтения. (A) HMW ДНК из шага 1.21.1 готов для строительства механических стрижки на основе библиотеки. (B) HMW ДНК из шага 1.21.2 для строительства на основе фрагментации библиотеки Транспозаза. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> Рисунок 4: QC результаты иглы стриженый HMW ДНК электрофорезом геля импульсного поля. L1: Быстрый нагрузки 1 kb ДНК лестница; L2: Быстрый нагрузки 1 КБ продлить лестница ДНК. 1-8: ДНК с различными проходящей раз через иглу стрижки. 1-3, не резки; 4, 10 раз; 5, 20 раз; 6, 30 раз; 7, 40 раз; 8, 50 раз. Этот шаг КК является необязательным. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> Рисунок 5: ожидаемый размер распределения библиотек долговечный ДНК Нанопор. MS, механические библиотеки на основе сдвига. TF, Транспозаза на основе фрагментации библиотек. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Механические shearing_rep1</td>
			<td>Механические shearing_rep2</td>
			<td>Транспозаза fragmentation_rep1</td>
			<td>Транспозаза fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Клеточная линия</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 гласит:</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество операций чтения больше чем 100 КБ</td>
			<td>2500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2355</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество всего читает</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>Максимальная длина (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>Средняя длина (bp)</td>
			<td>17.861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>Средней длины (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>Среднее качество гласит:</td>
			<td>10,0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9,9</td>
			<td>10,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая основы сырья чтений</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая основы унифицированных чтений</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сопоставленные соотношение всего баз (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,9%</td>
			<td>98.0%</td>
			<td>97,7%</td>
			<td>97,0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество активных поры</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Резюме от метрики производительности работает с различными протоколами, стрижка.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Библиотека 1</td>
			<td>Библиотека 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Клеточная линия</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ячейка, информация о заказе</td>
			<td>ATCC, Кот. LOL CCL-243</td>
			<td>Институт Coriell, Кот. LOL GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Протокол</td>
			<td>механический стрижка</td>
			<td>механический стрижка</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 гласит:</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество всего читает</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>Средней длины (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>Средняя длина (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>Максимальная длина (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая основы сырья чтений</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая основы унифицированных чтений</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сопоставленные соотношение всего баз (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,6%</td>
			<td>95,0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество активных поры</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>Дополнительная таблица 1: Резюме двух РНБ seq запусков с помощью других клеточных линий с механических ножниц протоколом.

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Лонг чтения последовательности значительно облегчить Ассамблее сложные геномы и характеристика структурных изменения. Мы описываем метод для создания ультра-длинные последовательности на основе Нанопор виртуализации платформ. Этот подход принимает оптимизированный экстракции ДНК, а затем изменение библиотеки препаратов для создания сотен kilobase читает с умеренной покрытие из клеток человека.

Долговечный чтения последовательности для анализа всей геномной ДНК

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Этот протокол заполняет технический пробел в нашей способности генерировать ультра-длинные массивы последовательности. Это позволяет нам исследовать сложность генома, которая ограничена современными подходами к короткому считытию в геномике. Метод уникален по производительности, надежности, универсальности и потенциалу интеграции с перспективными новыми приложениями.Он применим к различным материалам и может модулироваться для различных мгновенных размеров. Этот метод начал революцию в клиническом ландшафте. Его полезность диагностики в повторных расстройств расширения преодолела многие текущие недостатки.Некоторые регистры трансплантации использовали HLA-типирование высокого разрешения для лучшего клинического исхода. Эти методы предоставляют ранее недоступную информацию дальнего радиуса действия, такую как поэтапное и сложное структурное отклонение. В сочетании с эпигенетическим считыванием в одном тесте, это позволит точной медицины.Это длинный протокол со многими новыми методами, и трудно понять, работает ли он до окончательного последовательности. Я рекомендую практиковать нагрузку на старые ячейки потока перед запуском образцов. Сотрудники говорят, что некоторые методы сбивают с толку по сравнению с короткочитаемые подходы.В частности, экстракция мягче из-за высокого качества, высокоя молекулярного веса ДНК. Для начала извлечения ДНК HMW сначала добавьте 200 микролитров клеточной подвески в 10 миллилитров буфера лиза в 50 миллилитровую трубку. Затем вихрь на максимальной скорости в течение трех секунд.И инкубировать раствор при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. В конце инкубации добавьте к лизате два микролитера RNS-A. Аккуратно поверните 50 миллилитровую трубку, чтобы смешать образец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.После инкубации добавьте в лизат 10 миллилитров фенолового слоя фенол-хлороформ-изоамиловой спиртовой смеси. И положить трубку на ротатор при 20 об/мин в течение 10 минут под капотом дыма. После центрифугации гелевых трубок тщательно вылейте супернатант в новую 50-миллилитровую трубку.Затем добавьте 25 миллилитров ледяного 100% этанола и аккуратно поверните трубку вручную, пока ДНК не осаждается. Согните 20 микролитровый наконечник, чтобы сделать крюк. Используя крючок, осторожно вынул ДНК HMW и пусть жидкость упасть.Затем поместите ДНК в 50 миллилитровую трубку, содержащую 40 миллилитров этанола 70%, и аккуратно инвертировать трубку три раза, чтобы вымыть ДНК. Чтобы подготовить библиотеку на основе механического стрижки, сначала используйте шприц без иглы 100 миллилитров, чтобы проработать всю ДНК. Затем положите 27-го калибра иглы на шприц и извлечь все ДНК в блюдо мягко и медленно.Повторите 29 раз. Затем добавьте в трубку 143 микролитера повторно подвешенных магнитных бусин и 143 микролитров смеси реакции ДНК. Флик трубки шесть раз, чтобы смешать осторожно, и положить трубку на ротатор при 20 об / мин в течение 30 минут.Центрифуга трубки на 1000G в течение двух секунд при комнатной температуре, чтобы спина вниз образца, а затем поместить трубку на магнитной стойке в течение 10 минут. Затем отбросьте супернатант, пока трубка все еще на стойке. Добавьте 400 микролитров свежеприготовленного 70% этанола.Подождите 30 секунд. А затем удалить этанол. Затем центрифуга трубки на 1000G в течение двух секунд при комнатной температуре, чтобы спина вниз образца.Поместите трубку обратно на магнитную стойку и удалите остаточный этанол. Высушите гранулы в течение 30 секунд. Затем снимите трубку с магнитной стойки и добавьте 103 микролитров буфера T-E.Затем аккуратно щелкнуть трубку, чтобы убедиться, что бусы покрыты буфером и положить трубку на ротатор при комнатной температуре в течение 30 минут. Наконец, поместите трубку обратно на магнитную стойку в течение 10 минут, чтобы гранулы бисера. Используйте P200 широкий наконечник скважины для передачи 100 микролитров элуата в 0,2 миллилитровую трубку, и приступить к конечному ремонту ДНК-хвост и адаптер перевязки реакций.Чтобы подготовить библиотеку на основе фрагментации транспозазы, сначала сделайте реакцию тегментации ДНК, добавив 22 микролитров ДНК HMW, один микролитр из 10 миллимолейных трисов, рН 8, с 0,02%Triton X-100 и 1 микролитр смеси фрагментации, до 0,2 миллилитровой трубки. Далее, используйте P200 широкий кончик скважины, чтобы смешать реакцию шесть раз, и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение одной минуты, а затем 80 градусов по Цельсию в течение одной минуты. Держите при четырех градусах по Цельсию.Наконец, используйте P200 широкий кончик скважины для передачи реакции на 1,5 миллилитровую трубку и быстро добавить 1 микролитр быстрого адаптера смеси. Используйте P200 широкий кончик скважины, чтобы смешать реакцию шесть раз. Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение одного часа, и приступить к последовательности.Чтобы начать секвенирование, сначала вставьте новую ячейку потока в один из каналов устройства Nanopore. Затем, на сопроводительном программном обеспечении управления секвенированием, проверьте поле расположения ячейки потока. Выберите правильный тип ячейки потока и нажмите на рабочий процесс ячейки потока проверки.Нажмите на кнопку запуска теста, чтобы начать анализ потока ячейки КК. Далее, с P1000 пипетки установлен на 100 микролитров, отступить менее 30 микролитров буфера для удаления пузырьков из потока ячейки. Добавьте 30 микролитров грунтовки, чтобы покрыть верхнюю часть грунтовки порта, чтобы избежать введения пузырьков.Затем пипетка 800 микролитров грунтовки смешиваются в грунтовочном порту для загрузки ячейки потока. Вынюйте наконечник, когда есть около 50 микролитров грунтовки смесь слева, и добавить остальную часть грунтовки смесь на вершине грунтовки порта. Затем, с P1000 пипеткой, добавьте 200 микролитров грунтовки смеси в ячейку потока.Затем, непосредственно перед погрузкой, используйте P200 пипетки набор до 80 микролитров для пипетки вверх и вниз по библиотеке ДНК шесть раз. Наконец, загрузите библиотечную смесь в ячейку потока через порт выборки и приступайте к секвенированию и анализу данных. КК анализ ДНК готовы к механической стрижки основе библиотечной конструкции привело к 260 до 280 соотношение чистоты примерно 1,9, и 260 до 230 соотношение примерно 2,3, показывая хороший образец ДНК.Тот же результат был замечен с использованием ДНК готовы к транспозазы фрагментации на основе библиотечной конструкции. Контроль качества иглы с помощью импульсного поля гель-электрофорез показал, что большая часть ДНК HMW была больше 50 килобазы. Результаты четырех запусков с использованием ячейки HG00733 показали, что N50 библиотеки на основе механического стрижки был короче, чем библиотека на основе фрагментации транспозазы.Кроме того, все четыре трассы имели более 2300 считых с длиной более 100 килобаза. Максимальная длина была больше в библиотеках на основе фрагментации транспозазы с более коротким временем подготовки, по сравнению с библиотеками на основе механического стрижки. Библиотеки на основе механического стрижки производили больше общих считывания по сравнению с библиотеками на основе фрагментации транспозазы, что свидетельствует о более высокой урожайности.Обе библиотеки показали стабильное высокое качество, и более 97% их общих оснований были приведены в соответствие с геномом человека. Ожидаемые распределения размеров показали, что все четыре трассы имели большую долю данных свыше 50 килосаз, в то время как библиотеки на основе фрагментации транспонзы имели более высокое соотношение ультра-длинных считывай. Общая цель состоит в том, чтобы сохранить ДНК нетронутыми, поэтому важно, чтобы избежать каких-либо суровых обработки ДНК.Ключевым фактором, который может максимизировать значение метода, является вычислительный анализ. Наша команда разработала долгосрочный аналитический конвейер под названием PICKY, который может обнаружить полный спектр внедорожников с высокой чувствительностью. Это откроет новые возможности для захватывающих областей, таких как обнаружение сложных SVs и поэтапной перестановки и модификации на уровне одной молекулы.Это значительно улучшит наше понимание архитектуры генома. Фенол очень коррозионный. Вы должны работать с ним в дымовой капот с личным защитным оборудованием, в том числе перчатки, защитные очки, лабораторное пальто, длинные брюки и обувь.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization и Recellularization Целых Печень

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Проектирование Bio-отзывчивый робота из ДНК-оригами

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Всего тела Масс-спектрометрия обработки изображений с помощью ИК-Matrix-активированная лазерная десорбция ионизацией электрораспылением (ИК-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Полностью автоматизированный центробежный Микрожидкостных Устройство для сверхчувствительного обнаружения белка из цельной крови

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...