Name: ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Författarna vill tacka Y. Zhu för hennes synpunkter på manuskriptet. Forskning som redovisas i denna publikation var delvis stöds av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P30CA034196. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Obs: NLR-seq protokollet består av tre på varandra följande steg: 1) utvinning av högmolekylära vikt (HMW) genomisk DNA; (2) ultralång DNA bibliotek konstruktion, som inkluderar fragmentering av HMW DNA in i önskad storlek och ligering av sekvensering adaptrar till DNA slutar; och 3) lastning av adapter-sammanskrivna DNA på arrayer av nanopores (figur 1).
1. HMW DNA-extraktion
<ol><li>Reagens setup. Gör 1 x buffrad saltlösning (PBS) fosfatbuffert (1000 mL) genom att tillsätta 100 mL PBS (10 x) till 900 mL vatten och blanda väl. Gör lyseringsbuffert (50 mL) genom att lägga till 43,5 mL vatten i en 50 mL tub. Tillsätt 500 μl av Tris (1 M, pH 8,0), 1 mL natriumklorid (NaCl) (5 M), 2,5 mL av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (0,5 M, pH 8,0) och 2,5 mL av sodium dodecyl sulfate (SDS) (10%, wt/vol) till röret och blanda väl. Obs: Detta PBS-bufferten kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader. Den premade lysisbuffert kan lagras på RT för upp till 2 månader.</li>
	<li>Kontrollera cellen dödligheten och räkna cellerna. Säkerställa att levande förhållandet är > 85% och den totala mobilnummer är 30 x 106. Obs: Cellerna som används i detta protokoll är från HG00733 cell-linjen, en mänsklig lymfoblastoida cellinje av puertoricanska ursprung ofta används i 1000 genomet konsortiet för strukturell variation analys (se tabell av material för beställningsinformation), som tillhör till internationella genomet prov resurs.</li>
	<li>Samla cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min på RT. Kassera medium och resuspendera cellpelleten (30 x 106 celler) med 5 mL 1 x PBS-bufferten. Centrifugera igen vid 200 x g i 5 min på RT och kasta bort supernatanten. Obs: 25-35 x 106 celler är godtagbara för detta tillvägagångssätt. Ytterligare kommer att variation av mängden celler som används behöva ytterligare optimering. Cellpelleten kan lagras vid −80 ° C i upp till 6 månader.</li>
	<li>Återsuspendera cellpelleten i 200 μL 1 x PBS-bufferten. Om du använder en fryst cellpelleten, tvätta med 5 mL av 1 x PBS-bufferten. Centrifugera lösningen vid 200 x g i 5 min på RT, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 μL 1 x PBS-bufferten.</li>
	<li>Förbereda 10 mL lyseringsbuffert i en 50 mL tub. Tillsätt 200 μl cellsuspension till lyseringsbuffert och vortex på högsta hastighet för 3 s. Inkubera lösningen vid 37 ° C i 1 h.</li>
	<li>Tillsätt 2 μL av RNase A (100 mg/mL) till den lysate. Rotera försiktigt 50 mL röret för att blanda provet. Inkubera lösningen vid 37 ° C i 1 h.</li>
	<li>Tillsätt 50 μL proteinas K (20 mg/mL) till den lysate. Rotera försiktigt 50 mL röret för att blanda provet. Inkubera lösningen vid 50 ° C i 2 h. Under ruvningen, blanda försiktigt provet varje 30 min.</li>
	<li>Ta 50 mL röret från 50 ° C och låt stå i RT för 5 min.</li>
	<li>Tillsätt 10 mL av fenol lagret av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1, vol-/ vol-/ vol) till den lysate och vrid röret på en rotator mixer (se Tabell för material) på RT i dragskåp vid 20 rpm för 10 min. Wrap tube locket med parafilm att förhindra läckage under rotation.</li>
	<li>Förbered två 50 mL gel rör (se Tabell för material) genom centrifugering vid 1500 x g under 2 minuter vid RT. Obs: Gelen bildar en stabil barriär mellan nukleinsyra-innehållande vattenfasen och det organiska lösningsmedlet.</li>
	<li>Häll över provet/fenol lösningen i en av de beredda 50 mL gel rör från steg 1.10. Centrifugera lösningen vid 3 000 x g i 10 min vid RT.</li>
	<li>Häll supernatanten i en ny 50 mL tub. Tillsätt 10 mL av fenol lagret av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1, vol-/ vol-/ vol) och vrid röret på en rotator mixer på RT i dragskåp vid 20 rpm i 10 min.</li>
	<li>Upprepa steg 1.11 en gång med andra beredda gel tube.</li>
	<li>Häll supernatanten i en ny 50 mL tub. Tillsätt 25 mL iskallt 100% etanol och rotera försiktigt röret för hand tills DNA påskyndar (figur 2). Obs: Den nederbörd strategin hjälper till att stabilisera HMW DNA.</li>
	<li>Böj ett 20 μL tips att göra en krok. Försiktigt ta ut HMW DNA med kroken och låt vätska droppa.</li>
	<li>Placera HMW DNA i en 50 mL tub som innehåller 40 mL 70% etanol. Tvätta DNA genom att försiktigt vända röret 3 gånger.</li>
	<li>Upprepa steg 1.15 en gång för att samla in DNA från 70% etanol röret.</li>
	<li>Placera HMW DNA i en 2 mL tub som innehåller 1,8 mL 70% etanol.</li>
	<li>Centrifugera tvättade HMW DNA vid 10 000 x g för 3 s vid RT. ta bort så mycket av återstående etanolen som möjligt genom pipettering. Obs: Stör inte DNA pelleten när pipettering återstående etanolen.</li>
	<li>Inkubera 2 mL röret vid 37 ° C i ca 10 min med locket öppet torka provet.<ol>
<li>Om fortsätter med steg 2.1 (med mekanisk klippning och 1 D Ligation sekvensering Kit), tillsätt 1 mL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0) till 2 mL-röret.</li>
		<li>Om du fortsätter med steg 2.2 (med transposase-baserade fragmentering och snabba sekvensering Kit), tillsätt 200 μl 10 mm Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton x-100. Obs: Stör inte DNA pelleten. Att låta röret stå vid 4 ° C i mörker för 48 h hjälper provet fullt omsuspendera. HMW DNA kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor. Längre lagringstid eller andra lagringsförhållanden kan införa fler korta fragment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. extremt lång DNA bibliotek konstruktion
Obs: Det finns två sätt att konstruera extremt lång DNA biblioteken utifrån två olika klippning metoder tillsammans med nanopore sekvensering kit. En mekanisk klippning-baserat bibliotek producerar uppgifter med en N50 50-70 KB, tar ca 8 h för bibliotek byggande. En transposase fragmentering-baserat bibliotek producerar en N50 90-100 kb data, tar bara 90 min för bibliotek byggande. Mekanisk klippning protokollet ger högre avkastning från samma DNA ingång med identiska versioner av sekvensering adapter och kvaliteten på nanopore flödesceller.
<ol><li>Mekanisk klippning-baserat bibliotek konstruktion<ol>
<li>Blidväder och blanda reagenserna från ligering kit (se Tabell för material). Blidvädret FFPE DNA reparation buffert och slutet reparation/dA-tailing buffert på isen, sedan vortex och snurra ner till mix. Tina adapter mix (AMX) och adapter pärla bindande buffert (ABB) på isen, sedan pipetten och spinn ner för att blanda. Blidvädret kör buffert med bränsle blandning (RBF) och eluering buffert (ELB) på RT, sedan vortex och spinn för att blanda. Tina bibliotek laddar pärlor (LLB) på RT och pipett för att blanda före användning.<ol>
<li>När Tinas, hålla alla paketkomponenterna på is. Ta ut enzymerna endast när det behövs. Ta de magnetiska pärlorna till RT använda. Obs: För rekommendationer på magnetiska pärlor att använda se tabellen av material.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kontrollera kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA från steg 1.21.1. Pipett ut 20 μL av DNA i nya 1,5 mL rör från tre olika platser i HMW DNA röret med P200 brett bar tips. Ta 1 μL från de tre delprover att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer och kvalitet med hjälp av en UV läsning. Kontrollera flera gånger för att bekräfta resultaten. Obs: De förväntade resultaten visas i figur 3A. OD260/280 värdet är ca 1,9 och OD260/230 värdet är cirka 2,3.</li>
		<li>Överföra de återstående 940 μL av HMW DNA i en 50 mL tub mössa med ett brett P1000 bore tip.</li>
		<li>Sug upp alla DNA i en 1 mL spruta utan nålen.</li>
		<li>Stick in 27 G nålen på sprutan och mata ut alla DNA i locket försiktigt och långsamt (~ 10 s). Ta bort 27 G nålen från sprutan.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.4 och 2.1.5 för 29 gånger för totalt 30 passerar genom nålen. Obs: Klippt HMW DNA kan lagras vid 4 ° C i mörker i upp till 24 h. kvalitetskontroll (QC) rekommenderas av pulsade fält gelelektrofores, men det är dyrt och tidskrävande. Om utför QC på en automatiserad pulse field gel electrophoresis maskin Använd en 5-150 kb-protokollet för en 20 h kör. De förväntade resultaten visas i figur 4.</li>
		<li>Förbereda DNA reparation reaktionen i en 0,2 mL tub genom att tillsätta 100 μL av klippt HMW DNA (20 μg), 15 μL av FFPE DNA reparation buffert, 12 μL av FFPE DNA reparation mix och 16 μl nuclease-gratis vatten. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger och snurra ner till ta bort bubblor.</li>
		<li>Inkubera reaktionen vid 20 ° C i 60 min. överför provet till en ny 1,5 mL tub med P200 brett bore spets.</li>
		<li>Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Lägg till 143 μL pärlor (1 x) i DNA reparation reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.</li>
		<li>Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. plats röret på en magnetisk rack för 10 min. Håll röret på magnetiska racket och kasta bort supernatanten.</li>
		<li>Att hålla röret på magnetiska racket, tillsätt 400 μL av nylagade 70% etanol utan att störa pelleten. Ta bort 70% etanol efter 30 s.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.11 en gång.</li>
		<li>Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. Ställ röret igen på det magnetiska racket. Ta bort eventuella kvarvarande etanol och lufttorka för 30 s. Torka inte över pelleten.</li>
		<li>Ta bort röret från magnetiska rack och tillsätt 103 μL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0). Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten, och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.</li>
		<li>Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 100 μL av eluatet med ett brett P200 bore tip till en 0,2 mL rör.</li>
		<li>Förbereda slutet reparation och dA-tailing reaktion på 0,2 mL tub genom att tillsätta 100 μL av reparerade HMW DNA, 14 μL av slutet reparation/dA-tailing buffert och 7 μL av slutet reparation/dA-tailing mix. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger och snurra ner till ta bort bubblor.</li>
		<li>Inkubera reaktionen vid 20 ° C i 60 min följt av 65 ° C i 20 min och håller sedan på 22° C. Överför provet till en ny 1,5 mL tub med en bred P200 bore tips.</li>
		<li>Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Tillsätt 48 μl av pärlor (0,4 x) till slutet reparation/dA-tailing reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.10-2.1.13 en gång.</li>
		<li>Ta bort röret från magnetiska rack och tillsätt 33 μL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0). Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten, och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.</li>
		<li>Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 30 μL av eluatet med ett brett P200 bore spets in i en ny 1,5 mL tub. Ta den extra 1-2 μL att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer. Obs: Väntas återhämtning på 5-6 μg i detta steg.</li>
		<li>Förbereda ligering reaktionen i 1,5 mL prov röret genom att lägga till 30 μL av slut-repareras HMW DNA, 20 μL av adapter mix (AMX 1D), och 50 μL av blunt/TA ligering master mix. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger mellan varje sekventiella tillägg och spinn ner till ta bort bubblor.</li>
		<li>Inkubera reaktionen vid RT för 60 min.</li>
		<li>Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Lägga till 40 μl pärlor (0,4 x) till ligatur reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.10 en gång.</li>
		<li>Tillsätt 400 μL av adapter pärla bindande (ABB) buffert i röret. Sveper du röret försiktigt 6 gånger för att resuspendera pärlorna. Placera röret tillbaka på det magnetiska racket att separera pärlorna från bufferten och Kassera supernatanten.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.26 en gång.</li>
		<li>Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. Ställ röret igen på det magnetiska racket. Ta bort eventuella kvarvarande buffert och lufttorka för 30 s. Torka inte över pelleten.</li>
		<li>Ta bort röret från magnetiska rack och återsuspendera pelleten i 43 μL av eluering buffert. Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.</li>
		<li>Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 40 μl av eluatet med ett brett P200 bore spets in i en ny 1,5 mL tub. Ta den extra 1-2 μL att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer. Obs: Väntas återhämtning i 1-2 μg i detta steg. Mekanisk klippning-baserade bibliotek är redo för lastning. Biblioteket kan förvaras på is för upp till 2 h tills lastning för sekvensering vid behov.</li>
	</ol></li>
	<li>Transposase fragmentering-baserat bibliotek konstruktion
	<ol>
<li>Blidvädret reagenser från transposase kit (se Tabell för material). Tina fragmentering mix (FRA) och snabb adapter (RAP) på is och pipetten att blanda. Tina sekvensering buffert (SQB), lastning pärlor (LB), spola buffert (FLB) och spola tjuder (FLT) på RT och pipett för att blanda. Tina lastning pärlor (LB) på RT och pipett för att blanda före användning. När Tinas, hålla alla paketkomponenterna på is. Ta ut enzymerna endast när det behövs.</li>
		<li>Kontrollera kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA från steg 1.21.2. Pipett ut 20 μL av DNA i nya 1,5 mL rör från tre olika platser i HMW DNA röret med P200 brett bar tips. Ta 1 μL från de tre delprover att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer och kvalitet med hjälp av en UV läsning. Kontrollera flera gånger för att bekräfta resultaten. Obs: De förväntade resultaten visas i figur 3B. OD260/280 värdet är ca 1,9 och OD260/230 värdet är cirka 2,3.</li>
		<li>Förbereda DNA tagmentation reaktionen i en 0,2 mL tub genom att lägga till 22 μL av HMW DNA, 1 μL 10 mm Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton X-100 och 1 μL av fragmentering blanda (FRA). Mix av pipettering med ett brett P200 bar tips så långsamt som möjligt 6 gånger, noga med att inte införa bubblor.</li>
		<li>Inkubera reaktionen vid 30 ° C i 1 min följt av 80 ° C i 1 min och håll sedan vid 4 ° C. Överföring blandningen in i en ny 1,5 mL tub med en bred P200 bore spets och gå till nästa steg omedelbart.</li>
		<li>Tillsätt 1 μL av snabb adapter (RAP) till 1,5 mL prov röret. Mix av pipettering med ett brett P200 bar tips så långsamt som möjligt 6 gånger, noga med att inte införa bubblor.</li>
		<li>Inkubera reaktionen vid RT för 60 min. Obs: Transposase fragmentering-baserade biblioteket är redo för lastning. Biblioteket kan förvaras på is för upp till 2 h tills lastning för sekvensering vid behov.</li>
	</ol></li>
</ol>3. sekvensering på nanopore enheten
<ol><li>Kontrollera enhetens nanopore sekvensering (se Tabell för material). Kontrollera att både den programvara och maskinvara fungerar och det finns tillräckligt med lagringsutrymme.</li>
	<li>Kontrollera cellen flöde. Öppna ett nytt flöde cell och infoga cellen flöde i nanopore enheten. Kontrollera rutan platsen cellen flöde infogades i (X1-X5). Välj vilken rätt flöde cell. Klicka på Kontrollera flöde celler arbetsflödet. Klicka på knappen Starta Test att starta cellen flöde QC analys. Obs: Om antalet rapporterade totala aktiva porerna är mindre än 800, använda en annan ny flöde cell för sekvensering.</li>
	<li>Förbereda priming bufferten. För en mekanisk klippning-baserat bibliotek, tillsätt 576 μL kör buffert med bränsle blandning (RBF) och 624 μL nuclease-fritt vatten i en 1,5 mL tub. Vortex och snurra ner till mix priming bufferten. För ett transposase fragmentering-baserade bibliotek, tillsätt 30 μL av flush tjuder (FLT) till röret spola buffert (FLB). Vortex och snurra ner till mix priming bufferten.</li>
	<li>På flöde cell, flytta priming port locket medurs för att exponera port grundning.</li>
	<li>Ange P1000 pipett till 100 μL och för in i port grundning. Dra tillbaka en liten volym av buffert (mindre än 30 μL) ta bort alla bubblor från cellen flöde. Stoppa pipettering när en liten mängd gul vätska går in i spetsen.</li>
	<li>Använda P1000 pipett för att läsa in 800 μL av priming mixen i cellen flöde via port grundning. Undvik att införa bubblor, tillsätt 30 μL av priming mixen täcker toppen av port grundning först, sedan infoga spetsen i port grundning och sakta lägga resten av priming mixen. Ta ut tipset när det finns ca 50 μL vänster. Tillsätt resten av priming mix på toppen av port grundning. Vätskan kommer gå in av sig själv.</li>
	<li>Lämna setup till Inkubera i 5 min. Under tiden förbereda bibliotek mixen i 1,5 mL röret som innehåller biblioteket. Obs: För en mekanisk klippning-baserat bibliotek tillsätt 35 µL kör buffert med bränslemixen (RBF) till 40 µL av DNA biblioteket. För en transposase fragmentering-baserat bibliotek lägga till 34 µL av sekvensering buffert (SQB) och 16 µL nuclease-fritt vatten till 25 µL av DNA biblioteket.</li>
	<li>Öppna luckan flöde cell provet port försiktigt för att exponera den prov-porten. Använda P1000 pipett för att lägga 200 μL av priming mixen genom port grundning i cellen flöde som beskrivs i steg 3.5. Kontrollera att priming mixen inte läses in i cellen flöde genom uttaget prov.</li>
	<li>Ange P200 pipett till 80 μl. Blanda biblioteket försiktigt med ett brett bore tips genom pipettering upp och ner 6 gånger precis före lastning.</li>
	<li>Ladda biblioteket mixen droppvis genom uttaget prov i cellen flöde. Lägg varje droppe först efter den föregående droppe är helt laddad i porten.</li>
	<li>Sätt tillbaka provet port locket försiktigt och se till att uttaget prov är helt täckt. Flytta priming port locket moturs för att omfatta priming hamnen. Stäng locket för enheten.</li>
	<li>Klicka på Nytt Experiment arbetsflödet. Ange biblioteksnamnet, Välj rätt kit enligt förfaranden som används och kontrollera att inställningarna är korrekta (48 h kör, realtid base-calling ON).</li>
	<li>Klicka på Start Kör. Efter 10 min, registrera flöde cell ID och active nanopore nummer (totalt antal och varje fyra gruppernas nummer) från den kör informationen.</li>
	<li>Analys av data. Kopiera data till en lokal dator eller ett kluster när som helst av sekvensering eller när körningen är klar. Använd Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) för att justera sekvensdata till referens genomet. Sammanfatta den sekvensering prestandan från råsekvensdata och anpassningar av NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+at+40:+past,+present+and+future.">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li><li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping.">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li><li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation:+insights+from+and+for+human+disease.">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li><li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+reads:+their+purpose+and+place.">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li><li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing.">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads.">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li><li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing.">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer.">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li><li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+decades+of+nanopore+sequencing.">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li><li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxford+Nanopore+MinION:+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community.">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).</li><li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+view+on+sequencing.">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome.">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li><li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPack:+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data.">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li><li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication.">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615 (2013).</li><li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+(CATCH)+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping.">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+(CATCH).">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Nanopore-sekvensering är i princip kunna generera 100 kb megabase lydelse i längd11,12,13. Fyra viktiga faktorer kommer att påverka prestanda av sekvensering kör och data kvalitet: 1) aktiv pore siffror och aktiviteten av porerna; (2) motor protein, som styr hastigheten av DNA som passerar genom nanopore; (3) DNA mall (längd, renhet, kvalitet, massa); (4) sekvensering adapter ligering effektivitet, som bestämmer den användbara DNA från ingång provet. De två första faktorerna beror på vilken version av cellen flöde och sekvensering kit som tillhandahålls av tillverkaren. De andra två faktorerna är viktiga steg i detta protokoll (HMW DNA-extraktion, klippning och ligatur).
Detta protokoll kräver tålamod och öva. Kvaliteten på HMW DNA är viktigt för ultralång DNA bibliotek6. Protokollet börjar med celler som samlas in med hög lönsamhet (> 85% livskraftiga cell program), begränsa försämrat DNA från döda celler. Alla hårda process som kan införa skador i DNA (t.ex. stark störande, skakar, vortex, flera pipettering, upprepad frysning och upptining) bör undvikas. I utformningen av protokollet utelämnar vi pipettering i hela processen för DNA-extraktion. Brett bore tips behöver användas när pipettering är nödvändigt efter mekanisk klippning under bibliotek konstruktion och sekvensering. Som nanopores är känsliga för de kemiska sammansättningar i kammaren buffert12, bör det finnas så få kvarvarande föroreningar (t.ex. rengöringsmedel, ytaktiva ämnen, fenol, etanol, proteiner RNAs, etc.) som möjligt i DNA. Med tanke på längden och avkastning visar fenol utvinning metoden de bästa och mest reproducerbara resultat jämfört med flera olika extraktionsmetoder testat hittills.
Trots detta protokoll förmåga att producera långa-Läs sekvenser, kvar flera begränsningar fortfarande. Först, detta protokoll var optimerad utifrån nanopore sekvensering enheten tillgänglig vid tidpunkten för offentliggörandet. Således, den är begränsad till selektiv nanopore-baserade sekvensering kemi och kan vara suboptimal när de utförs i andra typer av lång-Läs sekvensering enheter. Det andra är resultatet starkt beroende av kvaliteten på DNA extraheras från utgångsmaterialet (vävnader eller celler). Läs längd kommer att äventyras om start DNA är redan förstörd eller skadad. För det tredje, även om flera QC steg ingår i protokollet att kontrollera DNA kvaliteten, den slutliga avkastning och längd av läser kan påverkas av cellen flöde och pore aktivitet, vilket kunde vara variabel i detta tidiga skede av nanopore sekvensering plattform utveckling.
Protokollet beskrivs använder här mänskliga suspension cell linje prover för DNA-extraktion. Vi har optimerat de förbigående gånger i nålen klippning, förhållandet mellan HMW DNA till transposase och ligatur tid att producera beskrivs resultaten. Protokollet kan byggas på fyra sätt. Först, förbrukaren kanna börja med andra odlade däggdjursceller och med olika mängd celler, vävnader, kliniska prover eller andra organismer. Att kommer behövas ytterligare optimering på LYS inkubationstiden, reaktionsvolym och centrifugering. Andra, det är svårt att förutsäga målstorleken för ultralång Läs sekvensering. Om Läs längderna är kortare än väntat, kan användarna justera de förbigående gånger i mekanisk klippning-baserade metoden eller ändra förhållandet mellan HMW DNA till transposase i metoden transposase fragmentering-baserade. Bindande och eluering längre under rensning steg är användbara eftersom HMW DNA är mycket trögflytande. För det tredje, med olika nanopore sekvensering enheter, man kan justera mängden och mängden DNA att uppfylla kriterierna i sequencer. För det fjärde kommer endast de DNA sammanskrivna till sekvensering adaptrar sekvenseras. För att ytterligare effektivisera ligatur, kan man försöka titrera adapter och ligase koncentrationerna. Modifierade ligering tid och molekylär trängsel medel såsom PEG18 kan tillämpas i framtiden. Ultra lång DNA sekvensering protokollet kombinerat med CRISPR19,20 kan erbjuda ett effektivt verktyg för målet anrikning sekvensering.

Under det senaste årtiondet, parallella massivt och noggranna andra generationens hög genomströmning sekvensering teknik har drivit en explosion av biomedicinska upptäckten och teknisk innovation1,2,3. Trots de tekniska framstegen, de kort-Läs data som genereras av de andra generationens plattformarna är ineffektiva i att lösa komplexa genomisk regioner och är begränsade för detektion av genomisk strukturella varianter (SVs), som spelar viktiga roller i mänskliga evolution och sjukdomar4,5. Dessutom kort-läsa data inte kan lösa återkommande variation och är olämpliga för kräsna haplotyp utfasning av genetiska varianter6.
Senaste framsteg i singel-molekyl sekvensering erbjuder betydligt längre Läs längd, som kan underlätta upptäckt av hela spektrumet av SVs7,8,9, och erbjuder korrekt och komplett montering av komplex mikrobiell och däggdjur genom6,10. Nanopore plattformen utför singel-molekyl sekvensering genom att direkt mäta de aktuella ändringarna medieras av DNA passage genom porer11,12,13. Till skillnad från någon befintlig DNA sekvensering kemi, nanopore sekvensering kan generera långa (TEN till tusentals kilobases) läser i realtid utan att förlita sig på polymeras kinetik eller konstgjorda amplifiering av DNA-provet. Därför nanopore lång-Läs sekvensering (NLR-seq) rymmer mycket lovande för att generera ultralång Läs längder långt utöver 100 kb, som skulle kraftigt förväg genomisk och biomedicinska analyser14, särskilt i låg-komplexitet eller repeat-rika regioner av genomen15.
Det unika med nanopore sekvensering är dess potential att generera långa läser utan en teoretisk längd begränsning. Läs längd är därför beroende av den fysiska längden av DNA som påverkas direkt av DNA integritet och sekvensering mall kvaliteten. Dessutom, beroende på omfattningen av manipulation och antalet steg inblandade, såsom pipettering styrkor och utvinning, kvaliteten på DNA är mycket varierande. Därför är det svårt för en att ge lång läser genom att bara tillämpa standardprotokollen DNA extraktion och tillverkarens medföljande bibliotek byggmetoder. Mot detta har vi utvecklat en robust metod att generera extremt lång läsa (hundratals kilobases) sekvensering data från skördade cell pellets. Vi antog flera förbättringar i DNA extraktion och bibliotek förberedelse. Vi effektiviserat protokollet för att utesluta onödiga förfaranden som orsakar DNA nedbrytning och skador. Detta protokoll är sammansatt av hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion, ultralång DNA bibliotek konstruktion och sekvensering på en nanopore plattform. För välutbildade molekylärbiolog tar det vanligtvis 6 h från cellen skörd till avslutningen av HMW DNA extraktion, 90 min eller 8 h för bibliotek konstruktion beroende på metoden klippning, och upp till en ytterligare 48 h för DNA-sekvensering. Användning av protokollet kommer att ge genomik gemenskapen att förbättra vår förståelse av genomet komplexitet och få nya insikter i genomet variation i mänskliga sjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XPbeads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>magnetic beads for cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD conventional needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305136</td>
			<td>27G, for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>for mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106</td>
			<td>R9.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG00773 cells</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>cells used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>nanopore ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>gel tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M6630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10X, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:IAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorometer assays for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Sequencing Kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-RAD004</td>
			<td>nanopore transposase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9822</td>
			<td>10% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9759</td>
			<td>5.0 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>pH 8.0, 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>~10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnetic rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>for incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LHP-5-UFMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GridION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>GridION X5</td>
			<td>nanopore device used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>rotator mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>for UV reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Pulse</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td>PPI0200</td>
			<td>pulsed-field gel electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>LABHP-5-URBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-A236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-464</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-long read sequencing for whole genomic dna analysis

Tredje generationen singel-molekylen DNA sekvensering teknik erbjuda betydligt längre Läs längd som kan underlätta monteringen av komplexa genomen och analys av komplexa strukturella varianter. Nanopore plattformar utföra singel-molekyl sekvensering genom att direkt mäta de aktuella ändringarna medieras av DNA passage genom porerna och kan generera hundratals kilobase (kb) läser med minimal kapitalkostnad. Denna plattform har antagits av många forskare för en mängd tillämpningar. Att uppnå längre sekvensering Läs längder är den mest kritiska faktorn att utnyttja värdet av nanopore sekvensering plattformar. Generera ultralång läsningar, krävs särskild hänsyn att undvika DNA brytskador och ökar effektiviteten för att generera produktiva sekvensering mallar. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokollet av extremt lång DNA-sekvensering inklusive hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion från färska eller frysta celler, bibliotek konstruktion av mekaniska klippning eller transposase fragmentering, och sekvensering på en nanopore enhet. Från 20-25 µg HMW DNA, metoden kan uppnå N50 Läs längd 50-70 kB med mekanisk klippning och N50 90-100 kb Läs längd med transposase medierad fragmentering. Protokollet kan tillämpas på DNA extraheras från däggdjursceller att utföra hela Genomsekvensering för att upptäcka strukturella varianter och genomet montering. Ytterligare förbättringar på DNA-extraktion och enzymatiska reaktioner kommer att ytterligare öka Läs längden och expandera sin verktyg.

Ultra lång DNA sekvensering protokollet gäller HMW DNA för bibliotek konstruktion. Därför är det kritiskt att välja väl odlade celler med levande förhållandet > 85% vid cellen skörd steg. Mängden celler som används för DNA-extraktion påverkar kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA. Cellys fungerar inte bra om börjar med alltför många celler. Med för få celler genererar inte tillräckligt med DNA för bibliotek konstruktion eftersom HMW DNA nederbörden utförs med varsam rotering för hand i stället för höghastighetståg centrifugering. Ett exempel på HMW DNA efter lägga till iskall 100% etanol och roterande visas som vita bomullsliknande fällningen i figur 2.
Det är viktigt att kontrollera kvaliteten på indata DNA innan du börjar bibliotek byggandet. Nedbrytning, felaktiga kvantifiering, förorening (t.ex. proteiner, RNAs, rengöringsmedel, surfaktant, och kvarvarande fenol eller etanol) och låg molekylvikt DNA kan ha en betydande inverkan på de efterföljande förfaranden och finalen Läs längd. Vi rekommederar QC analysen med DNA från tre olika platser i röret som innehåller HMW DNA. Från UV avläsning resultaten för HMW DNA, OD260/OD280 värdet är ca 1,9 och OD260/OD230 värdet är cirka 2,3 (figur 3AB). Baserat på värdena är konsekvent mellan de tre testerna för en bra HMW DNA-provet. Olika metoder för klippning kräver olika volymer av ingående DNA. Koncentrationen av HMW DNA måste vara > 200 ng/µL för mekanisk klippning medan det måste vara > 1 µg/µL för transposase fragmentering. Den koncentration som upptäcks av en fluorometer är lite lägre än UV läsning. Variationskoefficienten av koncentrationen av samma HMW DNA prov krävs dock att vara mindre än 15% med både fluorometer och UV läsa analyser. Mekanisk klippning gäller en spruta med en nål att bryta HMW DNA så att antalet passeringar genom nålen kommer att påverka storleken på klippt DNA och finalen Läs längd. Det rekommenderas att utföra storlek QC efter nålen klippning för att säkerställa att majoriteten av HMW DNA är större än 50 kb som illustreras i figur 4. I metoden mekanisk klippning genererade 30 passerar bästa sekvensering resultat med tanke på både längd och utdata.
N50 av en mekanisk klippning-baserat bibliotek är 50-70 kb medan en transposase fragmentering-baserat bibliotek är 90-100 kb. Resultaten av fyra löprundor med raden HG00733 cell visas i tabell 1. Alla fyra körningar har över 2 300 läser med längd som är längre än 100 kb. Maxlängden är längre i transposase fragmentering-baserade bibliotek (455 kb och 489 kb) jämfört med mekanisk klippning-baserade bibliotek (348 kb och 387 kb) medan den senare produceras mer totalt läser, vilket indikerar en högre avkastning. Transposase fragmentering-baserat bibliotek byggandet har färre steg och kortare förberedelsetid så att det kommer att medföra färre korta fragment. De två löprundor med transposase har en längre Genomsnittlig längd (> 30 kb) och median längd (> 10 kb). Dessutom visar data konsekvent hög kvalitet i alla körningar (genomsnittlig kvalitetsresultat är cirka 10,0, ~ 90% bas noggrannhet). Mer än 97% av de totala baserna anpassades till mänsklig referens genomet (hg19) med Minimap216 med standardinställningarna. De beräknade storlek distributionerna av raw läser visas i figur 5. Alla körningar har en stor andel av data över 50 kb och transposase fragmentering-baserade bibliotek har en högre andel av ultralång läsningar (t.ex. > 100 kb). Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt i flera mänskliga cellinjer (kompletterande Tabell1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över arbetsflödet nanopore lång-Läs sekvensering (NLR-seq). Orange, den komplexa transposase. Gul-grön, nanopore adaptern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> Figur 2: representativa DNA nederbörd från fenol-kloroform extraktionen metod. Den vita pilen anger HMW DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> Figur 3: exempel QC-resultat av HMW DNA från UV behandlingen. (A) HMW DNA från steg 1.21.1 redo för mekanisk klippning-baserat bibliotek konstruktion. (B) HMW DNA från steg 1.21.2 för transposase fragmentering-baserat bibliotek konstruktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> Figur 4: QC-resultat av nålen klippt HMW DNA med pulsade fält gelelektrofores. L1: Quick-load 1 kb DNA stege; L2: Quick-load 1 kb förlänga DNA stege. 1-8: DNA med olika passerar tider genom den nål klippning. 1-3, ingen klippning; 4, 10 gånger; 5, 20 gånger; 6, 30 gånger; 7, 40 gånger; 8, 50 gånger. Detta QC steg är valfritt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> Figur 5: förväntade storlek distributioner av nanopore Ultra lång DNA biblioteken. MS, mekanisk klippning-baserade bibliotek. TF, transposase fragmentering-baserade bibliotek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Mekaniska shearing_rep1</td>
			<td>Mekaniska shearing_rep2</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellinje</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 av läser</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98 237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal läsningar längre än 100 Kb</td>
			<td>2 500</td>
			<td>3 082</td>
			<td>2 386</td>
			<td>2 355</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal totalt läser</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21 032</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maxlängd (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genomsnittlig längd (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>Median längd (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>Betyder kvalitet av läser</td>
			<td>10,0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9,9</td>
			<td>10,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totala baserna av raw-läsningar</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totala baser av arrangera i rak linje läser</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mappade förhållandet mellan totala baser (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,9%</td>
			<td>98,0%</td>
			<td>97,7%</td>
			<td>97,0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal aktiva porer</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning från-prestandamätningar körs med olika klippning protokoll.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Bibliotek 1</td>
			<td>Bibliotek 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellinje</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cell beställningsinformation</td>
			<td>ATCC, katt. Nej. CCL-243</td>
			<td>Coriell Institute, cat. Nej. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokollet</td>
			<td>mekanisk klippning</td>
			<td>mekanisk klippning</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 av läser</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal totalt läser</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>Median längd (bp)</td>
			<td>1 843</td>
			<td>4 688</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genomsnittlig längd (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maxlängd (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totala baserna av raw-läsningar</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totala baser av arrangera i rak linje läser</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mappade förhållandet mellan totala baser (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,6%</td>
			<td>95,0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal aktiva porer</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>Kompletterande tabell 1: Sammanfattning av två NLR-seq löprundor med andra cellinjer med mekanisk klippning protokollet.

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis at JoVE.com

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Lång-Läs sekvenser i hög grad underlätta monteringen av komplexa genomen och karakterisering av strukturell variation. Vi beskriver en metod för att generera ultralång sekvenser av nanopore-baserade sekvensering plattformar. Metoden antar en optimerad DNA-extraktion som följt av modifierade bibliotek preparat att generera hundratals kilobase läsningar med måttlig täckning från mänskliga celler.

Ultra lång Läs sekvensering för hela genomiskt DNA analys

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Detta protokoll fyller en teknisk lucka i vår förmåga att generera ultralånga sekvensmatriser. Det gör det möjligt för oss att undersöka genomkomplexitet som begränsas av nuvarande kortlästa metoder inom genomik. Metoden är unik i prestanda, robusthet, mångsidighet och potential att integrera med lovande nya tillämpningar.Den är tillämplig på olika material och kan moduleras för olika ögonblicksstorlekar. Denna teknik har börjat revolutionera det kliniska landskapet. Dess diagnos nytta i upprepa expansion störningar har övervunnit många aktuella brister.Vissa transplantation register har utnyttjat högupplösta HLA-typing för bättre kliniska resultatet. Dessa metoder ger tidigare otillgängliga långväga information såsom fasning och komplexa strukturella varians. Tillsammans med epigenetisk avläsning i ett enda test, kommer det att möjliggöra precisionsmedicin.Det är ett långt protokoll med många nya tekniker och det är svårt att veta om det fungerar tills slutlig sekvensering. Jag rekommenderar att öva lastning på gamla flödesceller innan du kör prover. Medarbetare har sagt att vissa tekniker är förvirrande jämfört med kortlästa metoder.Specifikt är extraktionen skonsammare på grund av den höga kvaliteten, högmolekylärvikt DNA. För att påbörja utvinningen av HMW DNA, först lägga 200 mikroliter av cellen suspensionen till 10 milliliter av lysbuffert i en 50 milliliter rör. Sedan, virvel i högsta hastighet i tre sekunder.Och inkubera lösningen vid 37 grader celsius i en timme. I slutet av inkubationen, tillsätt två mikroliter av RNS-A till lysate. Rotera försiktigt 50 milliliterröret för att blanda provet och inkubera i 37 grader celsius i en timme.Efter inkubation, tillsätt 10 milliliter av fenolskiktet av fenol-kloroform-isoamyl alkoholblandning till lysate. Och sätta röret på en rotator på 20 rpm i 10 minuter under en rök huva. Efter centrifugeringen med gelrör häller du försiktigt översuparen i ett nytt 50 milliliterrör.Tillsätt sedan 25 milliliter iskall 100%etanol, och försiktigt rotera röret för hand, tills DNA fälls ut. Böj en 20 mikroliter spets för att göra en krok. Ta försiktigt ut HMW DNA och låt vätskan släppa av.Placera sedan DNA i ett 50 milliliter rör som innehåller 40 milliliter 70%etanol, och försiktigt invertera röret tre gånger för att tvätta DNA. För att förbereda det mekaniska skjuvningsbaserade biblioteket använder du först en nålfri spruta på 100 milliliter för att aspirera på allt DNA. Sätt sedan en 27 gauge nål på sprutan och mata ut allt DNA i skålen försiktigt och långsamt.Upprepa 29 gånger. Därefter lägger du till 143 mikroliter av de återuppdragna magnetiska pärlorna och 143 mikroliter av DNA-reparationsreaktionsblandningen till ett rör. Snärta röret sex gånger för att blanda försiktigt, och sätta röret på en rotator på 20 rpm i 30 minuter.Centrifugera röret vid 1000G i två sekunder vid rumstemperatur för att snurra ner provet, och sedan placera röret på ett magnetiskt rack i 10 minuter. Därefter kasta supernatanten medan röret fortfarande är på racket. Tillsätt 400 mikroliter av den nyberedda 70%etanol.Vänta i 30 sekunder. Och sedan ta bort etanol. Sedan centrifugera röret vid 1000G i två sekunder vid rumstemperatur för att snurra ner provet.Placera tillbaka röret på magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande etanol. Lufttorka pelleten i 30 sekunder. Därefter tar du bort röret från det magnetiska stället och lägger till 103 mikroliter av T-E-buffert.Sedan, snärta röret försiktigt för att säkerställa att pärlor är täckta i bufferten och sätta röret på rotatorn vid rumstemperatur i 30 minuter. Slutligen, placera röret tillbaka på den magnetiska rack i 10 minuter att pellet pärlorna. Använd en P200 bred tråkspets för att överföra 100 mikroliter av eluatet till ett 0,2 milliliterrör, och fortsätt till end-repair dA-tailing och adapter ligation reaktioner.För att förbereda transposase fragmentering-baserade biblioteket, först göra en DNA-tagmentation reaktion genom att lägga till 22 mikroliter av HMW DNA, en mikroliter på 10 millimolar Triss, pH 8, med 0,02%Triton X-100, och 1 mikroliter av fragmentering mix, till en 0,2 milliliter rör. Därefter använder en P200 bred tråkspets för att blanda reaktionen sex gånger, och inkubera vid 30 grader celsius i en minut, följt av 80 grader celsius i en minut. Håll vid fyra grader celsius.Slutligen, använd en P200 bred tråkspets för att överföra reaktionen till ett 1,5 milliliter rör och snabbt lägga till 1 mikroliter snabb-adapter mix. Använd en P200 bred tråkspets för att blanda reaktionen sex gånger. Inkubera reaktionen i rumstemperatur i en timme, och fortsätt till sekvensering.För att börja sekvensera, sätt först in en ny flödescell i en av kanalerna i Nanopore-enheten. Sedan, på den medföljande sekvensering kontroll programvara, kontrollera placeringsrutan för flödescellen. Välj rätt flödescelltyp och klicka på checkflödescellens arbetsflöde.Klicka på starttestknappen för att starta flödescellens QC-analys. Nästa, med en P1000 pipetter inställd på 100 mikroliter, dra tillbaka mindre än 30 mikroliter av buffert för att ta bort bubblor från flödescellen. Tillsätt 30 mikroliter av priming mixen för att täcka toppen av priming porten för att undvika att införa bubblor.Sedan, pipetter 800 mikroliter av priming mix i priming porten för att ladda flödet cellen. Ta ut spetsen när det finns cirka 50 mikroliter av priming mix kvar, och tillsätt resten av priming mix på toppen av priming porten. Därefter, med en P1000-pipetten, tillsätt 200 mikroliter av primingblandningen i flödescellen.Sedan, strax före lastning, använd en P200 pipetter inställd på 80 mikroliter för att pipettera upp och ner DNA-biblioteket sex gånger. Slutligen, ladda biblioteket blanda drop-vis i flödet cellen genom provporten, och fortsätt till sekvensering och dataanalysen. QC-analys av DNA redo för mekanisk skjuvning-baserade bibliotek konstruktion resulterade i 260 till 280 renhet förhållandet på cirka 1,9, och 260 till 230 förhållandet på cirka 2,3, visar ett bra DNA-prov.Samma resultat sågs med hjälp av DNA ready-for-transposase fragmentering-baserade bibliotek konstruktion. Storlekskvalitetskontroll av nål-skjuvnings HMW DNA av puls fältgelelektrofores visade att majoriteten av HMW DNA var större än 50 kilobases. Resultaten av fyra körningar med hjälp av HG00733 cellen visade att N50 av en mekanisk skjuvning-baserade bibliotek var kortare än en transposase fragmentering-baserade bibliotek.Dessutom hade alla fyra körningar över 2300 läsningar med längd längre än 100 kilobases. Den maximala längden var längre i de transposasfragmentationsbaserade biblioteken med sin kortare tillredningstid, jämfört med de mekaniska skjuvningsbaserade biblioteken. De mekaniska skjuvningsbaserade biblioteken producerade fler totala läsningar jämfört med de transponeringsbaserade biblioteken, vilket indikerar en högre avkastning.Båda biblioteken visade jämn hög kvalitet och mer än 97% av deras totala baser var i linje med den mänskliga referensgenomet. De förväntade storleksfördelningarna visade att alla fyra körningar hade en stor andel data över 50 kilobases, medan transposas fragmenteringsbaserade bibliotek hade ett högre förhållande av ultralånga läsningar. Det övergripande målet är att hålla DNA intakt, så det är viktigt att undvika hård hantering av DNA.En nyckelfaktor som kan maximera metodens värde är beräkningsanalysen. Vårt team har utvecklat en lång läst analyspipeline som kallas PICKY som kan upptäcka ett komplett utbud av SVs med hög känslighet. Det kommer att öppna nya vägar till spännande områden som att upptäcka komplexa SVs och fasa rearrangements och ändringar på den enda molekylen nivå.Detta kommer att avsevärt förbättra vår förståelse av arvsmassan arkitektur. Fenol är mycket frätande. Du måste arbeta med den i en draghuva med personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, skyddsglasögon, en labbrock, långa byxor och skor.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization och Recellularization av Whole Lever

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatueringar som ett nytt sätt för DNA-vaccin Leverans

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Designa en Bio-lyhörd robot från DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikroflödes Plattform för Mätning Neutrophil Chemotaxis från Cement helblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En mikroflödesbaserad Elektro Biochip för Label-fritt DNA hybridisering Analys

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Hela kroppen masspektrometri Imaging av Infrared Matrix-assisterad laserdesorption elektrosprayjonisering (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatiska centrifugala mikroflödessystem enhet för Ultraproteindetektion från helblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorör som ett mångsidigt verktyg för att studera Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...