Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

وأيده هذه الدراسة بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال والأمراض الجلدية، < https://www.niams.nih.gov/>، جائزة رقم P30-AR053503؛ مؤسسة استقرارا، www.stablerfoundation.org; الوطني معهد الحساسية والأمراض المعدية، www.niaid.nih.gov، T32AI007247؛ نينا أيرلندا برنامج لصحة الرئة (نيبله)، https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

وافق "جونز هوبكنز مجلس المراجعة المؤسسية" تحت قانون المساءلة وقابلية التأمين الصحي جميع الدراسات للمواد البشرية. وكانت عينات المريض ومراقبة إزالة الألغام التي تم تحديدها. تم الحصول على ببمكس والدم من ضوابط صحية بالموافقة المستنيرة.
ملاحظة: هذا البروتوكول تم اختبا...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

وقد ثبت البروتوكول المعروضة هنا مرنة جداً وحساس للتغيرات في تلطيخ المخزن المؤقت، ودرجة الحرارة وإعداد خلايا الدم المحيطية بسبب التعبير ارتفاع نسب علامات على سطح الخلية. أن الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه من معايرة الأجسام المضادة. من المذكرة، حيث ينبغي دائ?...

التدفق الخلوي هو أسلوب الذي استحدث لتحليل معلمات متعددة في جزيئات مفردة بمعدل عدة آلاف من الأحداث في كل ثانية1. أمثلة للعينات التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي وتشمل، ولكن لا تقتصر على، خلايا، والخرز، والبكتيريا وحويصلات والكروموسومات. نظام فلويديك توجيه الجسيمات عند نقطة الاستجواب حيث يتقاطع كل الجسيمات طريقها مع ليزر واحد أو أكثر، وتسجل معلمات متعددة لمزيد من التحليل. تنتشر إلى الأمام والجانب، المتولدة عن تشتت ضوء الليزر نقية، تستخدم لتحديد السكان المستهدفين واسترداد المعلومات حول الحجم النسبي وتعقيد/تقسيمات داخلية من الجسيمات، على التوالي. يتم اشتقاق كافة المعلمات الأخرى، التي تستأثر بمعظم البيانات في تحليل تدفق سيتوميتريك، بتحقيقات المسمى فلوروتشرومي أن تعترف وربط أهداف محددة على الجسيمات ذات الاهتمام.
التدفق الخلوي أداة أساسية للدراسات المناعية تحديد وتوصيف السكان الخلية. تشريح تعقيد النظام المناعي، هي لوحات متعددة الألوان في تطور مستمر لتوسيع عدد العلامات المسجلة في نفس الوقت إيمونوفينوتيبينج العميق للخلية السكان1. يؤدي هذا إلى وضع صكوك أكثر قدرة وفلوروتشروميس، مع سيتوميتيرس تدفق الراقية الأخيرة تتجاوز 20 الفلورية المعلمات. هذه النتائج في تصميم الدراسة معقدة بسبب التداخل الطيفي فلوروتشرومي وارتفاع التكاليف المرتبطة بجسم مخصص مشغلي الوسم والمهرة. في العديد من الحالات، يتم تقليل التعقيد والتكاليف باستخدام لوحات منفصلة لعلامات للسكان خلية مختلفة. هذا النهج، هو عرضه للخطأ ومع ذلك، ويقلل من المعلومات الموجودة في كل لوحة، ويمكن أن يكون صعباً لتطبيقه على عينات مع عدد محدود من الخلايا. وعلاوة على ذلك، تزايد عدد علامات يحول دون إيمونوفينوتيبينج العميق على الصكوك مع معلمات الفلورسنت أقل. أننا سبق أن وضعت بروتوكولا المصبوغة لتحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من السبعة المطلوبة باستخدام نهج (www.hcdm.org) "علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة" التقليدية2،3. تقريرنا الأولى استكشاف والتحقق من صحة مفهوم الجمع بين علامات سبعة في اثنين فلوروتشروميس إيمونوفينوتيبينج العميق. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول خطوة خطوة لعزل ووصمة عار خلايا الدم المحيطية، مع التركيز على الجانب العملي، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها خطوات لتحقيق تلطيخ ناجحة.
ويستند هذا البروتوكول على ملاحظة أن علامات النسب يكون تعبير ثابت على سطح الخلية، وأن كل السكان خلية مزيج حصري من علامات النسب. في ببمكس، والتعبير CD3 الخلايا المناعية تقسم إلى فئتين رئيسيتين هما: لمفاوية T CD3--الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4+، CD8+ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي. في نهج واحد فلوروتشرومي ماركر واحد قياسية، مكافحة-CD3،-CD4،--، CD8-CD14،-يتم الكشف عن الأجسام γδ CD19-CD56 وتكر مع سبعة فلوروتشروميس مختلفة. لدينا نهج يجمع بين مكافحة-CD3-CD56 وأجسام γδ-تكر في أحد فلوروتشرومي (المسمى للراحة فلوروتشرومي A) ومكافحة-CD4،--، CD8-CD14-والأجسام المضادة CD19 في فلوروتشرومي مختلفة (فلوروتشرومي ب). وهذا ممكن عن طريق الجمع بين أضداد معايرة والتعبير مستضد التفاضلية. كلا CD4+ و CD8+ تي الخلايا إيجابية للأجسام المضادة-CD3 في فلوروتشرومي أ، ولكن يمكن فصلهم في فلوروتشرومي ب تحقيق الحد الأقصى من التعبير عن إشارة CD8 بينما تضع، مع معايرة مخصصة، إشارة CD4 بين CD8 و الخلايا النفي المزدوج إيجابية-CD4/CD8 CD3. الخلايا التائية γδ تعرب عن مستوى أعلى من CD3 CD4 و CD8، وذلك يمكن التعرف عليهم ك عالية CD34. كذلك عزز هذه الإشارات بوصفها γδ خلايا تي في فلوروتشرومي أ مع أضداد γδ تكر المضادة، وبالتالي تحسين الفصل بين CD3 منخفضة تي الخلايا والخلايا عالية γδ تي CD3. يمكن تحديد الخلايا ب ك CD3– في فلوروتشرومي أ و CD19+ في فلوروتشرومي ب لفصل CD3 السلبية ناغورني كاراباخ الخلايا من الخلايا باء، كمكافحة-CD3 جسم CD56 المضادة في فلوروتشرومي أ. وهذا ممكن لأنه أعرب عن CD56 في ناغورني كاراباخ الخلايا على مستوى أقل بكثير من CD3 على خلايا تي5. وأخيراً، يمكن تحديد وحيدات عبر مزيج من خصائص مبعثر جانب الأمام والتعبير عن CD14 في فلوروتشرومي ب
فكرة الجمع بين أربع علامات باستخدام فلوروتشروميس اثنين سعت بنجاح قبل6،،من78، وقد استخدمت في بروتوكول سريرية لتحديد السكان اللمفاوية الخبيثة9 . تقرير سابق أيضا ضم سبع علامات (مع خصوصية مختلفة من العلامات مما كنا في أعمالنا البروتوكول) باستخدام اثنين من فلوروتشروميس، ولكن هذا النهج يعتمد على العلامات المعقدة لكل جسم مع كمية متفاوتة من فلوروتشرومي10. هذا هو على النقيض لدينا أسلوب الذي يستخدم الأجسام المضادة المتاحة تجارياً ويمكن تكييفها لتكوين أداة ويمكن الاستفادة من الجيل الجديد من فلوروتشروميس البوليمر.
والهدف العام لهذه المنهجية توسيع حدود بصري لمعظم تدفق سيتوميتيرس تسمح بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب السكان خلية معقدة. نتيجة لذلك، يمكن إجراء تحليل المناعية متقدمة في المتناول 6-10 fluorochrome تدفق سيتوميتيرس، والصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 يمكن أن تحقق نتائج ملحوظة في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس إضافية لإنجاز التدفق الخلوي تحليل أعمق وإنشاء وحدات تدفق الألواح سيتوميتريك استهداف الأنساب عدة في الوقت نفسه11. هذا يحتمل أن تقلل عدد اللوحات المستخدمة في وحدات إيمونوفينوتيبينج التدفق الخلوي، وخفض التكاليف، والأخطاء والتعامل مع الوقت. وهذا النهج أيضا جيد جداً مناسبة في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

خصائص الخلايا المناعية يعتمد بشدة على قياس التدفق متعدد الألوان لتحديد الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى التعبير التفاضلية من علامات السطحية. يتطلب برنامج الإعداد للوحة متعددة الألوان الكلاسيكية الراقية الصكوك والأجسام المضادة المسماة مخصصة، وتصميم الدراسة المتأنية للتقليل من التداخل الطيفي. قمنا بتطوير إجراء تحليل مولتيباراميتريك تحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في الدم عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط. استراتيجيتنا يستند إلى الملاحظة التي أعرب علامات النسب عن باستمرار في مزيج فريد من كل سكان الخلية. الجمع بين هذه المعلومات مع معايرة دقيقة للأجسام المضادة يسمح للمحققين بتسجيل خمس علامات إضافية، توسيع حدود معظم تدفق سيتوميتيرس الضوئية. وجها لوجه المقارنة أظهرت أن الغالبية العظمى من السكان الخلايا المناعية في الدم يمكن أن توصف بدقة قابلة للمقارنة بين أسلوب لدينا والكلاسيكية "نهج علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة"، على الرغم من أن هذا الأخير لا يزال أكثر دقة لتحديد السكان مثل NKT الخلايا والخلايا γδ تي. الجمع بين سبع علامات استخدام اثنين فلوروتشروميس يسمح لتحليل السكان الخلايا المناعية المعقدة والعينات السريرية على سيتوميتيرس تدفق fluorochrome معقولة 6-10، وحتى على الصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس الإضافية لتحقيق التدفق الخلوي تحليل أعمق. هذا النهج أيضا مناسبة لفحص العديد من السكان خلية في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا جيدا.

إعداد وتحليل تجربة التدفق الخلوي لخلايا الدم المحيطية الإنسان ملطخة بسبع نسب علامات (مكافحة-CD3،-CD4،-، CD8-CD14،-أضداد γδ CD19-CD56 وتكر) استخدام اثنين فقط تعرض فلوروتشروميس.
يتم وصف النتائج الممثل لمكافحة--CD8-ومعايرة أضداد CD56. لكل جسم (في هذا المثال...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

نقدم هنا، بروتوكول سيتوميتريك تدفق لتحديد خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات في الدم المحيطي البشري باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من سبعة. مع هذا النهج، يمكن تسجيل خمس علامات إضافية على معظم تدفق سيتوميتيرس.

التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

الهدف العام لهذه المنهجية هو توسيع نطاق ما هو أبعد من الحد البصري لمعظم أجهزة قياس التدفق من خلال السماح للباحث بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب مجموعات الخلايا المعقدة. باستخدام هذه التقنية ، من الممكن تحقيق مناعي عميق عند العمل مع جهاز مع عدد قليل من أجهزة الكشف أو عينة مع عدد محدود من الخلايا. ابدأ هذا الإجراء عن طريق نقل الدم المسحوب بعناية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.تمييع الدم مع كمية مساوية من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 15 ملليلتر من كثافة المتوسطة التدرج إلى أسفل أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. تراكب بعناية الدم المخفف على رأس متوسط التدرج الكثافة، وتجنب أي خلط بين متوسط التدرج الكثافة والدم المخفف.أجهزة الطرد المركزي عند 400 مرة ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل لتجنب تعطيل واجهة. بعد الطرد المركزي، استخدم ماصة لpirate بعناية وتجاهل الطبقة العليا، مع إيلاء الاهتمام لعدم إزالة الخلايا في واجهة بين البلازما وكثافة المتوسط التدرج. جمع العديد من خلايا الدم أحادية النوى الطرفية، أو PBMCs، ممكن من واجهة دون لمس بيليه الخلية الحمراء في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، ونقلها إلى أنبوب جديد.إضافة برنامج تلفزيوني لتحقيق حجم النهائي إلى 25 ملليلتر، وعكس عدة مرات لخلط. ثم، قم بغسل PBMCs مرتين كما هو مشار إليه في النص. بعد إزالة الصفائح الدموية والعد PBMCs كما هو موضح في النص، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ أزيميد الصوديوم إلى تركيز واحد مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.لإعداد PBMCs لتلطيخ، نقل 100 ميكرولترات من كل عينة إلى 96 بئر V-أسفل لوحة. الطرد المركزي لوحة في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. pirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية.إلى كل بئر، إضافة 100 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني تحتوي على صبغة حية / ميتة قابلة للإصلاح التي تتفاعل مع أمين الحرة على البروتينات، وإعادة تثبيت خليط PBMC بعناية. في وقت لاحق، والسماح لوحة للجلوس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لوضع العلامات من الخلايا الميتة. لكل عينة، إعداد 30 ميكرولترات من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة السبعة.في هذه المرحلة، يمكن إضافة الأجسام المضادة المعايرة ضد جزيئات مستهدفة مختلفة وفي الفلوروكرومات المختلفة أيضا. الطرد المركزي لوحة 96-جيدا في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، وpirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل بئر، و resuspend بعناية دون توليد فقاعات.احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد 30 دقيقة، إضافة 150 ميكرولترات من ضوء البقع العازلة إلى كل بئر، والطرد المركزي لوحة في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطامح بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.الخلايا جاهزة الآن لتحليل تدفق الخلايا. يتم معاير الأجسام المضادة لـ ANTI DELTA ANTI-CD3 و CD8 و CD14 و TCR delta مع الحد الأقصى لمنحنى مؤشر البقع. تعدّل الجسم المضاد هي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول لتحديد سبع مجموعات فرعية من الخلايا المناعية باستخدام اثنين من الفلوروكررومات بشكل صحيح.لإعداد تخفيف الأجسام المضادة ذات شقين ، تعبئة 10 آبار من لوحة 96-well مع 40 ميكرولترات من عازلة تلطيخ في البئر. لأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض المعايرة المضادة لـ CD8 فقط. في البئر الأول، زيادة حجم النهائي إلى 80 ميكرولترات من المخزن المؤقت تلطيخ، وإضافة المضادة ل-CD8 بتركيز أربعة أضعاف التركيز المقترح من قبل الشركة المصنعة.تخلط جيدا ونقل 40 ميكرولترات إلى البئر الثانية. تخلط جيدا وكرر هذه الخطوة لجميع الآبار الأخرى. وصمة 10 عينات من PBMCs أو الدم كله مع 30 ميكرولترات من 10 مختلفة اثنين أضعاف التخفيف من CD8 المضادة بعد البروتوكول أظهرت في وقت سابق.الحصول على البيانات مع جهاز قياس التدفق، ومؤامرة إشارة من كل تخفيف. بعد حساب مؤشر وصمة عار لكل تركيز الأجسام المضادة كما هو مفصل في النص، رسم مؤشر وصمة عار مقابل تركيز الأجسام المضادة أعرب عن جزء من تخفيف الأجسام المضادة، وتحديد تركيز الأجسام المضادة مع الحد الأقصى لقيمة مؤشر وصمة عار. لتماهي الأجسام المضادة CD4 وC56 المضادة، تبدأ مع استراتيجية التخفيف ذات شقين أظهرت في وقت سابق، إضافة تركيزات إضافية بين لتحديد بدقة نطاق التركيز الذي سيسمح فصل الخلايا T CD4 إيجابية وخلايا NK من مجموعات الخلايا الأخرى.Titrate الأجسام المضادة لـ CD4 بوضع إشارة CD4 المضادة بين إشارة CD8-positive مزدوجة، CD3-positive وSD3- السكان إيجابية واحدة. تماثل الجسم المضاد لـ CD56 باتباع استراتيجية مشابهة لتكميل الأجسام المضادة لـ CD4 ، عن طريق وضع خلايا NK بين الخلايا CD3-negative وSD3-positives. لبدء هذه الفلوروكروم، سبعة علامة اتّباع الغات، حدد بوابة الخلايا اللمفاوية، وإنشاء مؤامرة نقطة مع واحدة من الفلوروكررومات اثنين المستخدمة في هذا البروتوكول على كل محور.بوابة على CD8 إيجابية الخلايا T التي تم تحديدها كD3 و CD8 الخلايا الإيجابية المزدوجة في الزاوية اليمنى العليا من مؤامرة نقطة. استبعاد عدد الفئات الخافتة CD8 التي قد تحتوي على خلايا NKT. بوابة على CD4 إيجابية الخلايا التائية التي تم تحديدها على أنها السكان بين الخلايا T CD8 إيجابية وSD3 السكان إيجابية واحدة.بوابة على خلايا T دلتا غاما التي تم تحديدها كخلايا CD3 عالية. تقسيم الخلايا التائية دلتا غاما إلى CD8 إيجابية وD8 السلبية. بوابة على خلايا NK التي تم تحديدها على أنها مجموعة السكان بين الخلايا CD3-positive-positive وD3-سالبة.تقسيم الخلايا NK إلى CD8 إيجابية و CD8 السلبية. بوابة على الخلايا B التي تم تحديدها على أنها مجموعة مضغوطة CD3، إيجابية CD19 في الزاوية اليمنى السفلى من مؤامرة نقطة. حدد بوابة أحادية، وقم بإنشاء رسم نقطة مع أحد الفلوروكرومات المُستخدمين في هذا البروتوكول على كل محور.بوابة على CD3 السلبية، CD14-positive السكان. باستخدام هذه الاستراتيجية، تم اسور الخلايا الليمفاوية من مريض مصاب بالورم النخاعي المتعدد على أساس مبعثرها إلى الأمام ومبعثر الجانب وتدفقها الملف السيتومتري. تم تحديد الخلايا الفرعية للذاكرة المدمجة في CD8 والخلايا التائية الساذجة من خلال التعبير عن CD45RA و CCR7.تم استخدام التعبير عن HLA-DR و CD57 لدراسة تنشيط الخلية T في CD8-positive السذاجة والذاكرة والذاكرة المركزية، وذاكرة التأثير، وذاكرة CD45RA إيجابية. وبطريقة مماثلة، تم تحديد الخلايا السذاجة والذاكرة T CD4 الإيجابية. ضمن الذاكرة السكانية، CCR4 وCCR6 واستخدمت لتحديد السكان الفرعية T مساعد في خلايا T إيجابية CD4.وتتميز الاكتظاظ الفرعي لخلايا NK بتعبير CD16 و CD57. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية للتحقيق في ديناميات في مجموعات المناعة من العينات الطولية من متبرع مع المايلوما متعددة تلقي زرع الخلايا الجذعية. وصف لC8 و CD4 الاكتظاظ الفرعي مع مرور الوقت أظهرت CD4 المستمرة إيجابية و CD8-positive T خلية التنشيط وانحراف T المساعد إلى النمط الظاهري T-helper-one.ولكن في اليوم 60 ، زادت النسبة المئوية للخلايا B بشكل كبير ، مما توقع الانتكاس المريض. إعداد الخلايا المناسبة و معايرة الأجسام المضادة هي خطوات حاسمة لتحقيق نتائج موثوقة باستخدام هذه التقنية. يمكن إضافة الأجسام المضادة التي تستهدف علامات أخرى لإنجاز تحليل أعمق لقياس التدفق وإنشاء لوحات cytometric للتدفق المعياري تستهدف العديد من الفئات في نفس الوقت.ويمكن أيضاً وضع نُهج مماثلة ترمي إلى توسيع عدد العلامات القابلة للتسجيل باستخدام مجموعات مختلفة من العلامات أو لاستخدامها في نماذج حيوانية مختلفة. لا ننسى أن أزيد الصوديوم يمكن أن يسبب حروقا للجلد والعينين. لذلك، ينبغي دائما ارتداء معطف المختبر، والنظارات الواقية، والقفازات عند التعامل مع هذا الكاشف.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...