Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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这项研究得到了国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所的支持, < http://www.niams.nih.gov/>, 奖项编号 p30-ar053503;www.stablerfoundation.org 的斯台伯尔基金会;国家过敏和传染病研究所, www.niaid.nih.gov, t32ai007247;nina 爱尔兰肺健康方案 (niplh), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。

所有对人体材料的研究都得到了约翰·霍普金斯大学机构审查委员会根据《健康保险可移植性和问责制法》进行的批准。患者和对照样本被取消鉴定。pbmc 和血液是在知情同意的情况下获得的。
请注意:该方案已在新鲜或冷冻分离的外周血细胞和全血上进行了测试。
1. 细胞制备
<ol><li>
全血外周血细胞 (pbmc) 的分离
	<ol>
<li>在含有?...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

这里介绍的协议已经被证明是相当灵活和不敏感的变化染色缓冲液, 温度和外周血细胞的准备, 由于在细胞表面的血统标记的高表达。获得高质量、可重现数据的最关键的步骤是抗体滴定法。值得注意的是, 由于抗体的滴定应始终在流式细胞仪面板的设置过程中进行, 因此此步骤不会为我们的双氟铬方法增加额外的基准时间。对 cd3、-cd8、-cd14、-cd19 和-tcr γ进行滴定, 遵循标准程序, 通过最大染色指?...

流式细胞术是一种以每秒几千个事件1的速率分析单个粒子上的多个参数的技术.流式细胞仪分析的标本包括但不限于细胞、珠子、细菌、囊泡和染色体。流体系统在审讯点引导粒子, 在那里, 每个粒子与一个或多个激光相交其路径, 并记录多个参数进行进一步分析。利用纯激光散射产生的正向散射和侧散射分别用于识别目标群体并检索有关粒子相对大小和内部复合度的信息。所有其他参数, 这些参数占流式细胞仪分析中的大部分数据, 都是由荧光色标记的探针得出的, 这些探头识别并绑定到感兴趣粒子上的特定目标。
流式细胞术是免疫学研究的主要工具, 用于识别和表征细胞群。为了剖析免疫系统的复杂性, 多色面板不断进化, 以扩大同时记录的标记数量, 用于细胞群的深度免疫表型 1.这导致了更有能力的仪器和荧光素的开发, 最近的高端流式细胞仪超过20个荧光参数。这导致了复杂的研究设计, 由于氟铬光谱重叠, 并在更高的成本与定制抗体标签和熟练的操作人员。在某些情况下, 通过对不同的细胞群使用单独的标记面板, 可以降低复杂性和成本。但是, 这种方法容易出错, 会减少每个面板中的信息, 并且可能很难应用于单元格数量有限的示例。此外, 由于标记数量的增加, 在荧光参数较少的仪器上进行了深度免疫表型。我们之前开发了一个染色协议, 以确定主要的人类免疫群体 (cd4+和 cd8+ t 细胞, γ t 细胞, b 细胞, nk 细胞和单核细胞) 结合使用的七个谱系标记只有两个含氟铬, 而不是使用传统的 "一-一标记" 方法 (www.hcdm.org)2,3所需的七个。我们的初步报告探讨并验证了将七个标记组合在两个荧光素中用于深免疫表型的概念。在本报告中, 我们提出了一个逐步分离和染色外周血细胞的协议, 重点介绍了实际方面和故障排除步骤, 以实现成功的染色。
该协议基于这样的观察, 即谱系标记在细胞表面有一个恒定的表达式, 并且每个细胞群都有一个排他的谱系标记组合。在 pbmc 中, cd3 表达将免疫细胞细分为两大类: cd3 阳性 t 淋巴细胞和 cd3 阴性细胞。在 cd3 阳性亚群中, cd4+、cd8+和γ t 细胞可以使用仅针对 cd4、cd8 和γ受体的抗体分离。以类似的方式, 在 cd3 阴性亚群中, b 细胞、nk 细胞和单核细胞可以分别使用抗 cd19、cd56 和 cd14 的抗体进行唯一的鉴定。在标准的一荧光色标记方法中, 用七种不同的荧光色检测到抗 cd3、-cd4、-cd8、-cd14、-cd19、-cd56 和-tcr γ抗体。我们的方法将抗 cd3、-cd56 和-tcr γ抗体结合在一个荧光素 (标记为方便氟铬 a) 和抗 cd4、cd8、-cd14 和-cd19 抗体中的不同氟铬 (氟铬 b) 中。这是可能的抗体滴定和差异抗原表达的组合。cd4+和 cd8+ t 细胞对氟铬 a 中的抗 cd3 抗体呈阳性, 但它们可以在荧光 b 中分离, 最大限度地提高 cd8 信号的表达, 同时在 cd8 和 cd8 之间放置 cd4 信号。正 cd3 正 cd--cd8 双负细胞。与 cd4 和 cd8 相比, γ t 细胞的 cd3 表达水平更高, 因此可以识别为 cd3 高4。通过在荧光 a 中标记带有抗 tcr γ抗体的 h2 t 细胞, 进一步增强了这一信号, 从而改善了 cd3 低 t 细胞与 cd3 高γ t 细胞之间的分离。b 细胞可以被识别为 cd3-在荧光铬 a 和 cd19+在荧光铬 b。为了将 cd3 阴性 nk 细胞与 b 细胞分离, 在氟铬 a 中使用了抗 cd56 抗体作为抗 cd3 抗体。这是可能的, 因为 cd56 在 nk 细胞上的表达水平远远低于 t 细胞5上的 cd3。最后, 单核细胞可以通过向前散射特性和 cd14 在氟铬 b 中的表达的组合来识别。
在6、7、8之前, 已经成功地尝试了使用两种荧光素组合四个标记的想法, 并在临床协议中使用了这一想法, 以确定恶性淋巴细胞群 9.以前的一份报告还使用了两个荧光色素 (与我们的协议中使用的标记不同的特异性), 但这种方法依赖于对每个抗体进行复杂的标记, 其中的荧光铬量不同。这与我们使用市售抗体的方法形成鲜明对比, 该方法可根据仪器配置进行调整, 并可利用新一代聚合物荧光色。
这种方法的总体目标是扩大大多数流式细胞仪的光学极限, 允许记录五个额外的标记, 以询问复杂的细胞群。因此, 先进的免疫分析可以在经济实惠的6-10 氟铬流式细胞仪上进行, 2-3 个氟铬现场仪器可以在资源有限的领域取得显著成果。高端仪器也可以受益于这种方法, 通过使用额外的荧光色, 以完成更深入的流式细胞仪分析, 并创建模块化流式细胞仪面板, 同时针对多个血统11。这可能会减少模块化免疫表型流式细胞术中使用的面板数量, 并减少成本、错误和处理时间。这种方法也非常适用于细胞数量有限的临床样本。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

免疫细胞特征在很大程度上依赖于多色流式细胞术, 以基于表面标记的微分表达来识别亚群。经典多色面板的设置需要高端仪器、定制标记抗体和仔细的研究设计, 以最大限度地减少光谱重叠。我们开发了一种多参数分析, 通过使用两个荧光标记组合 7个沿线标记, 确定外周血中的主要人体免疫群 (cd4 + 和 cd8 + t 细胞、γ t细胞、b 细胞、nk 细胞和单核细胞)。我们的策略是基于这样的观察, 即血统标记不断以每个细胞群的独特组合来表达。将这些信息与对抗体的仔细滴定相结合, 可以让研究人员记录另外五个标记, 从而扩大大多数流式细胞仪的光学极限。头部与头部的比较表明, 外周血中绝大多数免疫细胞群的特征与我们的方法和经典的 "一种荧光-铬-一标记方法" 相当, 尽管后者仍然是这样。更精确的识别群体, 如 nkt 细胞和γ t 细胞。使用两个荧光素组合七个标记, 可以在负担得起的6-10 氟铬流细胞仪上分析复杂的免疫细胞群和临床样本, 甚至可以在资源有限的地区使用 2-3-2-2---氟铬现场仪器。高端仪器也可以受益于这种方法, 通过使用额外的荧光色素完成更深入的流式细胞仪分析。这种方法也非常适合在细胞数量有限的临床样本中筛选几个细胞群。

本文介绍了仅使用两种荧光色素的人外周血细胞流式细胞仪染色实验, 该实验采用了7个谱系标记 (抗 cd3、cd4、-cd8、-cd14、-cd19、-cd56 和-tcr γ抗体)。
介绍了抗 cd8 和-cd56 抗体滴定法的代表性结果。对于每个抗体 (在本例中, 抗 cd8), 记录了10次连续2倍稀释的数据, 以计算染色指数曲线 (图 1a-c)。最佳抗体浓...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

在这里, 我们提出了一个流式细胞仪协议, 以识别 cd4+和 cd8 + t 细胞, γ t细胞, b 细胞, nk 细胞和单核细胞在人外周血中只使用两个荧光色素, 而不是七个。通过这种方法, 可以在大多数流式细胞仪上记录五个附加标记。

双氟铬流式细胞仪对七种免疫细胞子集的判别

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

这种方法的总体目标是通过允许研究人员记录五个附加标记来询问复杂的细胞群，从而扩展到大多数流动细胞计的光学极限之外。使用这种技术，使用检测器数量小或细胞数量有限的样品时，可以实现深度免疫抑制。通过小心地将抽血转移到 50 毫升锥形管中开始此过程。在不含有钙和镁的情况下，用等量的PBS稀释血液。将 15 毫升密度梯度介质添加到新的 50 毫升锥形管的底部。小心地将稀释的血液覆盖在密度梯度介质上，避免密度梯度介质和稀释血液之间的任何混合。在室温下以 400 倍 g 离心 30 分钟，无需制动，以避免界面中断。离心后，使用移液器小心吸气并丢弃上层，注意不要去除等离子体和密度梯度介质之间接口的细胞。从界面收集尽可能多的外周血单核细胞或PBMC，而不接触50毫升锥形管底部的红细胞颗粒，并转移到新的管。添加 PBS 使最终体积达到 25 毫升，并反转多次混合。然后，将 PBMC 洗涤两次，如文本中所示。去除血小板并计算文本中描述的 PBMC 后，将 PBS 中的细胞重新暂停，0.1% 的亚兹德钠浓度为每毫升 10 倍，达到第七细胞。要准备用于染色的 PBMC，请将每个样品的 100 微升转移到 96 井 V 底板中。在室温下以 350 倍 g 离心板三分钟。小心吸制上一提液，而不干扰细胞颗粒。在每一个井，加入100微升PBS含有活/死可修复染料，与蛋白质上的自由胺反应，并仔细重新暂停PBMC混合物。随后，让板在室温下坐10分钟，以标记死细胞。对于每个样品，制备30微升的混合物，包含所有7个抗体。在这个阶段，对不同目标分子和不同氟化物的滴定抗体也可以添加。在室温下以350倍g将96井板离心3分钟，并小心吸进上一提液，而不会干扰细胞颗粒。将抗体鸡尾酒加入到每个井中，并小心地重新暂停，而不会产生气泡。在黑暗中室温下孵育30分钟。30分钟后，在每一个井中加入150微升染色缓冲液，并在室温下以350倍g离心，3分钟。小心吸升液，而不干扰细胞颗粒，并在200微升PBS中重新产生细胞。细胞现在已准备好进行流式细胞测量分析。抗CD3、CD8、CD14、CD19和TCR伽马三角洲抗体以最大染色指数曲线滴定。抗体滴定是该协议中最关键的一步，即使用两个氟化物正确识别七个免疫细胞子集。要准备双重抗体稀释，请将 96 孔板的 10 孔填充，每孔填充 40 微升染色缓冲液。就本视频而言，仅显示防 CD8 的滴定。在第一个井中，将最终体积增加至80微升染色缓冲液，并添加防CD8的浓度是制造商建议的浓度的四倍。混合好，将40微升转移到第二个井。混合好，并重复这一步为所有其他井。按照前面证明的协议，用10种不同双倍稀释的10种双倍稀释剂中的30微升将10个PBMC或全血样本染色。使用流量环测仪获取数据，并绘制每个稀释的信号。计算文本中详述的每个抗体浓度的染色指数后，绘制污渍指数与抗体浓度，以抗体稀释的一小部分表示，并识别具有最大染色指数值的抗体浓度。要滴定抗CD4和抗CD56抗体，首先从前面演示的两倍稀释策略开始，在两者之间添加额外的浓度，以精细地确定允许CD4阳性T细胞和NK细胞与其他细胞群分离的浓度范围。通过在双CD8阳性、CD3阳性信号和CD3单阳性群体之间放置抗CD4信号，对抗CD4抗体进行滴答。通过将NK细胞置于CD3阴性细胞和CD3阳性群体之间，对抗CD56抗体进行类似策略的滴定。要开始这种双氟色、七标记门控策略，请选择淋巴细胞门，并创建一个点图，其中一个点图与该协议中使用的两个氟圆角之一在每个轴上。在点图右上角的 CD8 阳性 T 细胞上的门标识为 CD3 和 CD8 双阳性细胞。排除可能包含 NKT 细胞的昏暗 CD8 总体。CD4阳性T细胞的门被确定为CD8阳性T细胞和CD3单阳性细胞之间的种群。伽马三角洲T细胞的门被识别为高CD3细胞。将伽马三角洲T细胞细分为CD8阳性和CD8阴性。NK细胞的门被确定为CD3阳性和CD3阴性细胞之间的种群。将 NK 细胞细分为 CD8 阳性和 CD8 阴性。B 单元格上的栅极标识为点图右下角的 CD3 负值 CD19 阳性总体。选择单核门，并创建一个点图，其中两个氟圆在该协议中使用的每个轴上。CD3 负值、CD14 阳性总体的门。使用这种策略，来自多发性骨髓瘤患者的淋巴细胞根据其向前散射和侧散射及其流动细胞测量轮廓进行封闭。CD8阳性记忆亚细胞和天真T细胞通过CD45RA和CCR7的表达被识别。HLA-DR 和 CD57 的表达用于研究 CD8 阳性天真、记忆、中央记忆、效应器记忆和效应器记忆 CD45RA 阳性细胞中的 T 细胞激活。以类似的方式，CD4阳性天真和记忆T细胞被识别。在记忆量中，CCR4 和 CCR6 用于识别 CD4 阳性 T 细胞中的 T 帮助器子组。NK细胞的亚细胞以CD16和CD57表达为特征。这一策略用于研究接受干细胞移植的多发性骨髓瘤捐赠者的纵向样本免疫群的动态。随着时间的推移，CD8和CD4亚细胞的特征显示CD4阳性和CD8阳性T细胞活化，T帮助器向T-帮助器-一个表型倾斜。但在第60天，B细胞的百分比显著增加，预测患者复发。正确的细胞制备和抗体滴定是使用这种技术实现可靠结果的关键步骤。可以添加针对其他标记的抗体，以完成更深入的流量细胞学分析，并同时创建针对多个血统的模块化流式细胞测量面板。也可以使用不同的标记集或用于不同的动物模型，以扩大可记录标记的数量的类似方法。不要忘记，阿齐德钠可导致皮肤和眼睛灼伤。因此，在处理这种试剂时，应始终佩戴实验室外套、防护眼镜和手套。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

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