Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme, < https://www.niams.nih.gov/>, award antallet P30-AR053503; De Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; National Institute for allergi og smitsomme sygdomme, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge sundhed (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Alle studier af menneskers materialer blev godkendt af Johns Hopkins institutionelle Review Board under Health Insurance mobilitet og Accountability Act. Patienten og kontrol prøver blev de identificerede. PBMC og blod fra raske kontrolpersoner blev indhentet af informeret samtykke.
Bemærk: Denne protokol er blevet testet på frisk eller frossen isolerede perifere blodceller og fuldblod.
1. celle forberedelse
<ol><li>
Isolering af perife...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Protokollen præsenteres her har vist sig at være ganske fleksible og ufølsomme over for ændringer i farvning buffer, temperatur og perifere blod celle forberedelse på grund af den høje udtryk af lineage markører på cellens overflade. Det mest afgørende skridt for at opnå høj kvalitet, reproducerbare data er antistoftitrering. At bemærke, da titrering af antistoffer bør altid udføres under installationen af et flow cytometric panel, føjer dette trin ikke ekstra bænk-tid til vores to-fluorokrom tilgang. Tit...

Flowcytometri er en teknik, der blev udviklet for at analysere flere parametre på én partikler med en hastighed på flere tusinde af begivenheder pr. anden1. Eksempler på prøver analyseret ved flowcytometri omfatter, men er ikke begrænset til, celler, perler, bakterier, vesikler og kromosomer. En fluidic system dirigerer partikler på forhør punkt, hvor hver partikel skærer sin vej med en eller flere lasere, og flere parametre registreres for yderligere analyse. Frem og side scatters, genereret af spredning af ren laserlys, der bruges til at identificere målgruppen og hente oplysninger om den relative størrelse og indre kompleksitet/granulering af partikler, henholdsvis. Alle de andre parametre, der tegner sig for de fleste af data i et flow cytometric analyse, er afledt af fluorokrom-mærket sonder, der genkender og binder til specifikke mål for partikler af interesse.
Flowcytometri er en primære værktøj til at identificere og karakterisere cellepopulationer immunologiske undersøgelser. For at dissekere kompleksiteten af immunsystemet, Multifarve paneler under konstant udvikling for at udvide antallet af markører samtidig registreres for dyb Immunofænotypning af celle populationer1. Dette fører til udvikling af bedre i stand til instrumenter og fluorokromer, med de seneste high-end flow cytometers overstiger 20 fluorescerende parametre. Dette resulterer i komplekse undersøgelse design på grund af fluorokrom spektrale overlapning og højere omkostninger i forbindelse med brugerdefinerede antistof mærkning og kvalificerede operatører. I flere tilfælde reduceres kompleksitet og omkostninger ved at bruge separate paneler af markører for forskellige cellepopulationer. Denne tilgang, men er fejl liggende, reducerer oplysninger i hvert panel, og kan være vanskelig at anvende til prøver med begrænset antal celler. Desuden øge antallet af markører til hinder for dyb Immunofænotypning på instrumenter med færre fluorescerende parametre. Vi tidligere udviklet en farvnings-protokol til at identificere store immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv kræves ved hjælp af den traditionelle "en fluorokrom-en markør" tilgang (www.hcdm.org)2,3. Vores indledende rapport undersøgt og godkendt begrebet kombinerer syv markører i to fluorokromer til dyb Immunofænotypning. I denne betænkning præsenterer vi en trin for trin protokol for at isolere og plette perifere blod celler, med fokus på det praktiske aspekt og fejlfindingstrin for at opnå en vellykket farvning.
Denne protokol er baseret på den iagttagelse, at lineage markører har et konstant udtryk på cellens overflade, og at hver celle befolkning har en eksklusiv kombination af lineage markører. I PBMC, CD3 udtryk underinddeler immunceller i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negative celler. Inden for den positive undergruppe i CD3, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan adskilles ved hjælp af antistoffer, der er udelukkende rettet mod CD4 og CD8 γδ receptor. I en sammenlignelig måde i CD3 negative undergruppe, kan B-celler, NK-celler og monocytter identificeres entydigt ved hjælp af antistoffer mod CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorokrom-en markør tilgang, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer er fundet med syv forskellige fluorokromer. Vores tilgang kombinerer anti-CD3, - CD56 og -TCR γδ antistoffer i et fluorokrom (mærket for bekvemmelighed fluorokrom A) og anti-CD4-CD8, -CD14 og - CD19 antistoffer i en anden fluorokrom (fluorokrom B). Dette er muligt ved en kombination af antistoftitrering og differentieret antigen udtryk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive for anti-CD3-antistof i fluorokrom A, men de kan adskilles i fluorokrom B maksimering udtryk for CD8 signal samtidig lægge, med en ad hoc-titrering, CD4 signalet mellem CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbelt negativ celler. Γδ T celler udtrykker højere niveau af CD3 end CD4 og CD8, og derfor kan identificeres som CD3 høj4. Dette signal er yderligere styrket ved mærkning γδ T-celler i fluorokrom A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre adskillelse mellem CD3 lav T-celler og CD3 høj γδ T celler. B-celler kan identificeres som CD3- i fluorokrom A og CD19+ i fluorokrom B. For at adskille CD3 negative NK celler fra B-celler, blev en anti-CD56 antistof brugt i fluorokrom A som anti-CD3. Dette er muligt fordi CD56 udtrykt på NK celler på et meget lavere niveau end CD3 på T celler5. Endelig, monocytter kan identificeres via en kombination af fremad-side scatter egenskaber og udtryk af CD14 i fluorokrom B.
Idé om at kombinere op til fire markører ved hjælp af to fluorokromer allerede med held har forsøgt før6,7,8, og er blevet brugt i en klinisk protokol til at identificere maligne lymfatisk populationer9 . En tidligere rapport også kombineret syv markører (med forskellige specificitet fra markører end vi brugte i vores protokol) ved hjælp af to fluorokromer, men denne tilgang har påberåbt sig en kompleks mærkning af hver enkelt antistof med varierende mængde af fluorokrom10. Dette er i modsætning til vores metode, som benytter kommercielt tilgængelige antistoffer og kan tilpasses til konfigurationen af instrument og kan drage fordel af den nye generation af polymer fluorokromer.
Det overordnede mål med denne metode er at udvide de optisk grænserne for de fleste flow cytometers giver mulighed for optagelse af fem ekstra markører til at afhøre komplekse cellepopulationer. Som en konsekvens, avancerede immunologiske analyse kan udføres på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og 2-3 fluorokrom feltinstrumenter kan nå bemærkelsesværdige resultater i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri og skabe modulære flow cytometric paneler målretning flere slægter på den samme tid11. Dette kan potentielt reducere antallet af paneler bruges i modulære Immunofænotypning flowcytometri og reducere omkostninger, fejl og håndtering tid. Denne tilgang er også meget godt egnet for kliniske prøver med begrænset antal celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Immun celle karakterisering afhængig stærkt af flerfarvet flowcytometri at identificere delpopulationer baseret på differentierede udtryk af overflade markører. Opsætning af en klassiske flerfarvet panel kræver high-end instrumenter, brugerdefinerede mærkede antistoffer og omhyggelig undersøgelse design at minimere spektrale overlapning. Vi udviklede en multiparametric analyse for at identificere større immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer. Vores strategi er baseret på den iagttagelse, at lineage markører konstant er udtrykt i en unik kombination af hver celle befolkning. Ved at kombinere denne information med en omhyggelig titrering af antistoffer gør det muligt for efterforskerne at registrere fem ekstra markører, udvide den optiske grænse for de fleste flow cytometers. Head-to-head sammenligning viste, at langt størstedelen af immun cellepopulationer i perifert blod kan karakteriseres med tilsvarende nøjagtighed mellem vores metode og den klassiske "en fluorokrom-en markør tilgang", selvom sidstnævnte er stadig mere præcist for at identificere befolkningsgrupper som NKT celler og γδ T celler. Kombinerer syv markører ved hjælp af to fluorokromer giver mulighed for analyse af komplekse immun cellepopulationer og kliniske prøver på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og selv på 2-3 fluorokrom feltinstrumenter i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri. Denne tilgang er også meget godt egnet til screening flere cellepopulationer ved kliniske prøver med begrænset antal celler.

Setup og analyse af et flow flowcytometri eksperiment af humane celler, perifere blod farves med syv lineage markører (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer) ved hjælp af kun to fluorokromer præsenteres.
Repræsentative resultater er beskrevet for anti-CD8 og -CD56 antistoftitrering. For hver antistof (i dette eksempel, anti-CD8), data fra ti successive 2-fold fortyndinger blev registreret for at be...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Her præsenterer vi et flow cytometric protokol for at identificere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter i humant perifert blod ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv. Med denne tilgang, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flow cytometers.

Forskelsbehandling af syv immun celle Subsets ved to-fluorokrom Flow flowcytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Det overordnede mål med denne metode er at udvide ud over den optiske grænse for de fleste flow cytometre ved at tillade en forsker at registrere fem ekstra markører til at afhøre komplekse cellepopulationer. Ved hjælp af denne teknik er det muligt at opnå en dyb immunofenotyping, når du arbejder med instrument med et lavt antal detektorer eller prøve med begrænset antal celler. Begynd denne procedure ved omhyggeligt at overføre trukket blod ind i en 50-milliliter konisk rør.Blodfortyndes med en tilsvarende mængde PBS uden calcium og magnesium. Der tilsættes 15 milliliter densitetsgradientmedium til bunden af et nyt konisk rør på 50 milliliter. Overlejr omhyggeligt det fortyndede blod oven på tæthedens gradientmedium, så man undgår at blande sig mellem tæthedens gradientmedium og fortyndet blod.Centrifuge ved 400 gange g i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse for at undgå afbrydelse af grænsefladen. Efter centrifugering, bruge en pipette til omhyggeligt at aspirere og kassere det øverste lag, være opmærksom på ikke at fjerne celler på grænsefladen mellem plasma og tæthed gradient medium. Indsamle så mange perifere blod mononukleare celler, eller PBPC'er, som muligt fra grænsefladen uden at røre den røde celle pellet i bunden af 50-milliliter koniske rør, og overføre til et nyt rør.Tilsæt PBS for at bringe det endelige volumen til 25 milliliter, og invertere flere gange for at blande. Vask derefter PBM'erne dobbelt så meget som angivet i teksten. Efter fjernelse af blodpladerne og optælling af PBPC'erne som beskrevet i teksten, resuspend cellerne i PBS, 0,1% natrium azide til en koncentration på en gange 10 til den syvende celler pr milliliter.For at forberede PBM'erne til farvning skal du overføre 100 mikroliter af hver prøve til en 96-brønd V-bundplade. Centrifuge pladen ved 350 gange g i tre minutter ved stuetemperatur. Inspirer forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet.Til hver brønd, tilsættes 100 mikroliter af PBS indeholder en levende / døde fixable farvestof, der reagerer med gratis amin på proteiner, og resuspend pbmc blandingen omhyggeligt. Lad derefter pladen sidde i 10 minutter ved stuetemperatur til mærkning af døde celler. For hver prøve tilberedes 30 mikroliter af en blanding, der indeholder alle syv antistoffer.På dette stadium, titrerede antistoffer mod forskellige målmolekyler og i forskellige fluorokromer kan tilføjes så godt. Centrifuge 96-brøndpladen ved 350 gange g i tre minutter ved stuetemperatur, og inspirer forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet. Tilsæt antistof cocktail til hver brønd, og resuspend omhyggeligt uden at generere bobler.Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter 30 minutter tilsættes 150 mikroliter farvningsbuffer til hver brønd, og pladen centrifuges ved 350 gange g i tre minutter ved stuetemperatur. Inspirer forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet, og resuspenderede cellerne i 200 mikroliter AF PBS.Cellerne er nu klar til flow cytometri analyse. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 og TCR gamma delta antistoffer er titreret med en maksimal farvning indeks kurve. Antistoftitrering er det mest kritiske trin i denne protokol til korrekt at identificere syv immuncelledelsæt ved hjælp af to fluorkromer.For at forberede en dobbelt antistoffortynding skal du fylde 10 brønde af en 96-brøndplade med 40 mikroliter farvningsbuffer pr. brønd. I forbindelse med denne video vises kun titrering af anti-CD8. I den første brønd skal du øge det endelige volumen til 80 mikroliter af farvningsbufferen og tilsætte anti-CD8 ved en koncentration, der er fire gange den koncentration, som producenten har foreslået.Bland godt og overføre 40 mikroliter til den anden brønd. Bland godt og gentag dette trin for alle de andre brønde. Pletten 10 prøver af PBPC'er eller fuldblod med 30 mikroliter af de 10 forskellige tofoldige fortyndinger af anti-CD8 efter den protokol, der blev påvist tidligere.Indskaf data med et flowcytometer, og afbild signalet fra hver fortynding. Efter beregning af pletindekset for hver antistofkoncentration som beskrevet i teksten afbildes pletindekset i forhold til antistofkoncentrationen udtrykt som en brøkdel af antistoffortyndingen, og koncentrationen af antistof med den maksimale pletindeksværdi identificeres. For at titrere anti-CD4 og anti-CD56 antistoffer, skal du starte med den tofoldige fortyndingsstrategi demonstreret tidligere, tilføje yderligere koncentrationer i mellem for fint at identificere det koncentrationsområde, der vil tillade adskillelse af CD4-positive T-celler og NK-celler fra de andre cellepopulationer.Det anti-CD4-antistof titrerer ved at placere anti-CD4-signalet mellem det dobbelte CD8-positive, CD3-positive signal og CD3-enkeltansitiv populationen. Titrere anti-CD56 antistoffet efter en strategi svarende til anti-CD4 antistof titrering, ved at placere NK celler mellem CD3-negative og CD3-positive populationer. For at begynde denne to-fluorochrome, syv-markør gating strategi, skal du vælge lymfocyt porten, og skabe en prik plot med en af de to fluorochromes, der anvendes i denne protokol på hver akse.Gate på CD8-positive T-celler identificeret som CD3 og CD8 dobbelt positive celler i øverste højre hjørne af prik plot. Udeluk den dim CD8-population, der kan indeholde NKT-celler. Gate på CD4-positive T-celler identificeret som populationen i mellem CD8-positive T-celler og CD3 enkelt positive populationer.Gate på gamma delta T-celler identificeret som høje CD3-celler. Underinddelt gamma delta T-celler til CD8 positive og CD8 negativ. Gate på NK celler identificeret som populationen i mellem CD3-positive og CD3-negative celler.Underinddel NK-cellerne til CD8 positive og CD8 negative. Gate på B-celler identificeret som CD3-negative, CD19-positive population i nederste højre hjørne af prik plot. Vælg monocytporten, og opret et prikplot med et af de to fluorokromer, der bruges i denne protokol, på hver akse.Gate på CD3-negative, CD14-positive population. Ved hjælp af denne strategi, lymfocytter fra en patient med myelomatose blev gated på grundlag af deres fremad scatter og side scatter og deres flow cytometrisk profil. CD8-positive hukommelsesunderpopulationer og naive T-celler blev identificeret ved ekspressionen af CD45RA og CCR7.Ekspression af HLA-DR og CD57 blev brugt til at studere T-celleaktivering i CD8-positive naive celler, hukommelse, central hukommelse, effektorhukommelse og effektorhukommelse CD45RA-positive celler. På samme måde blev CD4-positive naive og hukommelseS-T-celler identificeret. Inden for hukommelsespopulationen blev CCR4 og CCR6 anvendt til at identificere T-hjælper-delpopulationer i CD4-positive T-celler.Delpopulationer af NK-celler var karakteriseret ved CD16 og CD57 udtryk. Denne strategi blev brugt til at undersøge dynamikken i immunpopulationer af langsgående prøver fra en donor med myelomatose, der fik en stamcelletransplantation. Karakterisering af CD8 og CD4 delpopulationer over tid viste en vedvarende CD4-positiv og CD8-positiv T-celle aktivering og en skævvridning af T hjælper til en T-hjælper-en fænotype.Men på dag 60, den procentdel af B-celler dramatisk udvidet, forudsige patientens tilbagefald. Korrekt celleforberedelse og antistoftitrering er kritiske skridt til at opnå pålidelige resultater ved hjælp af denne teknik. Antistof rettet mod andre markører kan tilføjes for at opnå dybere flow cytometri analyse og for at skabe modulære flow cytometriske paneler rettet mod flere slægter på samme tid.Lignende metoder med henblik på at udvide antallet af rekordbare markører kunne også udvikles ved hjælp af forskellige sæt markør eller til brug i forskellige dyremodeller. Glem ikke, at natriumazid kan forårsage forbrændinger på hud og øjne. Derfor bør der altid bæres en laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og handsker, når dette reagens håndteres.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...