Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het nationale Instituut van artritis en Musculoskeletal en ziekten van de huid, < https://www.niams.nih.gov/>, award nummer P30-AR053503; De Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; Nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekte, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Ierland programma voor de gezondheid van de longen (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Alle studies van menselijke materialen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins institutionele Review Board onder de Health Insurance Portability and Accountability Act. Patiënt en controle monsters waren-geïdentificeerde. PBMCs en bloed van gezonde controles werden verkregen door de geïnformeerde toestemming.
Opmerking: Dit protocol is getest op vers of bevroren geïsoleerde perifere bloedcellen en bloed.
1. cel voorbereiding
<ol><li>
...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerd is aangetoond dat het heel flexibel en ongevoelig voor veranderingen in de kleuring van de buffer, de temperatuur en de perifere bloedcellen voorbereiding als gevolg van de hoge uitdrukking van geslacht markeringen op het celoppervlak. De meest kritische stap voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige, reproduceerbare gegevens is titratie van antilichamen. Van de nota, aangezien de titratie van antilichamen moet altijd worden uitgevoerd tijdens de installatie van een stroom cytometri...

Stroom cytometry is een techniek die is ontwikkeld om te analyseren van meerdere parameters op enkele deeltjes met een snelheid van enkele duizenden evenementen per tweede1. Voorbeelden van monsters geanalyseerd door stroom cytometry omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cellen, kralen, bacteriën, blaasjes en chromosomen. Een fluidic systeem regisseert deeltjes op het punt van de ondervraging waar elk deeltje zijn pad kruist met een of meer lasers, en meerdere parameters worden opgenomen voor verdere analyse. Voorwaartse en zijdelingse verstrooit, gegenereerd door de verstrooiing van het zuivere laserlicht, worden gebruikt voor het identificeren van de doelpopulatie en ophalen van informatie over de relatieve omvang en interne complexiteit/granulariteit van deeltjes, respectievelijk. Alle andere parameters, die goed zijn voor het merendeel van de gegevens in een flow cytometrische analyse, worden afgeleid door fluorescerende-geëtiketteerden sondes die worden herkend en binden aan specifieke doelstellingen op de deeltjes van belang.
Stroom cytometry is een primaire hulpmiddel voor immunologische studies te identificeren en te karakteriseren cel populaties. Om te ontleden de complexiteit van het immuunsysteem, multicolor panelen zijn voortdurend in ontwikkeling om uit te breiden het aantal markeringen gelijktijdig opgenomen voor diepe immunophenotyping voor cel populaties1. Dit leidt tot de ontwikkeling van krachtigere instrumenten en fluorochromes, met recente high-end flow cytometers meer dan 20 TL parameters. Dit resulteert in complexe studie ontwerp als gevolg van fluorescerende spectrale overlap en in hogere kosten in verband met aangepaste antilichaam etikettering en bekwame operatoren. In meerdere gevallen, worden complexiteit en kosten verlaagd door gebruik te maken van afzonderlijke panelen van markers voor andere cel populaties. Deze aanpak, echter is foutgevoelig, vermindert de informatie in elk paneel, en moeilijk toe te passen op monsters met een beperkt aantal cellen kan zijn. Bovendien, verhoging van het aantal markeringen verzet zich tegen diepe immunophenotyping op instrumenten met minder fluorescerende parameters. Eerder ontwikkelden we een kleuring protocol ter identificatie van de grote menselijke immuun populaties (CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door het combineren van zeven lineage markeringen gebruiken slechts twee fluorochromes in plaats van de zeven nodig met behulp van de traditionele "een fluorescerende-een marker" aanpak (www.hcdm.org)2,3. Ons eerste verslag onderzocht en gevalideerd de notie van het combineren van zeven markers in twee fluorochromes voor diepe immunophenotyping. In dit verslag presenteren wij een stap door stap protocol om te isoleren en vlek perifere bloedcellen, zich te concentreren op het praktische aspect en de stappen om een succesvolle kleuring voor probleemoplossing.
Dit protocol is gebaseerd op de observatie dat geslacht markeringen een constante expressie op het celoppervlak hebben en dat de bevolking van elke cel een exclusieve combinatie van lineage markers heeft. In PBMCs, CD3 expressie immuuncellen onderverdeelt in twee hoofdcategorieën: CD3-positieve T-lymfocyten en CD3-negatieve cellen. Binnen de CD3 positieve deelgroep, CD4+, CD8+ en γδ T cellen kunnen worden gescheiden met behulp van antilichamen die uitsluitend gericht zijn op CD4, CD8 en de γδ receptor. Op een vergelijkbare manier, binnen de CD3 negatieve deelgroep, kunnen B-cellen, NK-cellen en monocyten uniek worden aangeduid met behulp van antilichamen tegen CD19, CD56 en CD14, respectievelijk. In een standaard aanpak voor een fluorescerende-een marker, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 en -TCR γδ antilichamen worden gedetecteerd met zeven verschillende fluorochromes. Onze aanpak combineert anti-CD3 - CD56 en -TCR γδ antilichamen in een fluorescerende (gelabeld voor gemak fluorescerende A) en anti-CD4,-CD8, -CD14 en - CD19 antilichamen in een verschillende fluorescerende (fluorescerende B). Dit is mogelijk door een combinatie van titratie van antilichamen en differentiële antigeen expressie. Beide CD4+ en CD8+ T cellen zijn positief voor het anti-CD3 antilichaam in fluorescerende A, maar zij kunnen worden gescheiden in fluorescerende B maximaliseren van de expressie van de CD8-signaal terwijl het plaatsen, met een ad hoc-titratie, de CD4-signaal tussen de CD8 en de cellen van de positieve-CD4/CD8 dubbel negatief CD3. Γδ T-cellen spreekt hoger niveau van CD3 dan CD4 en CD8 en daarom kunnen zij worden geïdentificeerd als CD3 hoge4. Dit signaal wordt verder versterkt door het labelen van γδ T-cellen in fluorescerende A met een anti-TCR γδ antilichamen, dus verbetering van de scheiding tussen CD3 lage T-cellen en CD3 hoge γδ T cellen. B cellen kunnen worden geïdentificeerd als CD3- in fluorescerende A en CD19+ in fluorescerende B. Als u wilt scheiden CD3 negatieve NK cellen van B-cellen, werd een anti-CD56 antistof gebruikt in fluorescerende A als de anti-CD3. Dit is mogelijk omdat CD56 op NK-cel op een veel lager niveau dan CD3 op T cellen5 uitgedrukt. Ten slotte, monocyten kunnen worden geïdentificeerd via een combinatie van vooruit-kant scatter eigenschappen en expressie van CD14 in fluorescerende B.
Het idee van het combineren van maximaal vier markeringen met behulp van twee fluorochromes heeft al met succes geprobeerd voordat6,7,8, en is gebruikt in een protocol voor klinische te identificeren van kwaadaardige lymfatische populaties9 . Een vorig rapport ook gecombineerd zeven markeringen (met verschillende specificiteit van de markers dan wij in ons protocol gebruikt) met behulp van twee fluorochromes, maar deze aanpak gebaseerd op een complexe etikettering van elke antilichaam met variërende hoeveelheid fluorescerende10. Dit is in tegenstelling tot onze methode die gebruik maakt van verkrijgbare antilichamen en kan worden aangepast aan de configuratie van het instrument en kunt profiteren van de nieuwe generatie van polymeer fluorochromes.
Het algemene doel van deze methodiek is om uit te breiden van de optische grenzen van meeste flow cytometers waardoor de opname van vijf extra markers te ondervragen van complexe cel populaties. Dientengevolge, geavanceerde immunologische analyse kan worden uitgevoerd op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en 2-3 fluorescerende veld instrumenten kunnen bereiken opmerkelijke resultaten op gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse en maken de modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten bij de dezelfde tijd11. Dit kan potentieel het aantal panelen die worden gebruikt in de modulaire immunophenotyping stroom cytometry verminderen en verminderen kosten, fouten en verwerkingstijd. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Immuun cel karakterisering is sterk afhankelijk van multicolor stroom cytometry te identificeren subpopulaties gebaseerd op differentiële expressie van oppervlakte markers. Setup voor een klassieke multicolor panel vereist high-end instrumenten, aangepaste gelabelde antilichamen en zorgvuldige studie ontwerp om te minimaliseren van spectrale overlap. Ontwikkelden we een multiparametric analyse om te identificeren grote menselijke immuun populaties (CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifeer bloed door het combineren van zeven lineage markeringen met behulp van slechts twee fluorochromes. Onze strategie is gebaseerd op de observatie dat lineage markeringen voortdurend worden uitgedrukt in een unieke combinatie van elke celpopulatie. Het combineren van deze informatie met een zorgvuldige titratie van de antistoffen kan onderzoekers graag vijf extra markeringen, uitbreiding van de optische limiet van meeste flow cytometers. Head-to-Head comparison is aangetoond dat de overgrote meerderheid van immuun cel populaties in perifeer bloed kan worden gekarakteriseerd met vergelijkbare nauwkeurigheid tussen onze methode en de klassieke "een fluorescerende-een marker benadering", hoewel de laatste nog steeds is nauwkeuriger voor het identificeren van populaties zoals NKT cellen en γδ T cellen. Het combineren van zeven markeringen met behulp van twee fluorochromes zorgt voor de analyse van complexe immuun cel populaties en klinische monsters op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en zelfs op 2-3 fluorescerende veld instrumenten in gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt voor het screenen van verschillende cel populaties in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.

Setup en analyse van een experiment stroom cytometry van menselijke perifere bloedcellen gekleurd met zeven lineage markeringen (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 en -TCR γδ antilichamen) met behulp van slechts twee fluorochromes worden gepresenteerd.
Representatieve resultaten worden voor het anti-CD8 en -CD56 titratie van antilichamen beschreven. Voor elke antilichaam (in dit voorbeeld anti-CD8), gegevens van tien 2-fol...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Het algemene doel van deze methodologie is om verder te gaan dan de optische limiet van de meeste stroomcytometers door een onderzoeker in staat te stellen vijf extra markers op te nemen om complexe celpopulaties te ondervragen. Met behulp van deze techniek is het mogelijk om een diepe immunophenotypering te bereiken bij het werken met instrument met een laag aantal detectoren of monsters met een beperkt aantal cellen. Begin deze procedure door het zorgvuldig overbrengen van getrokken bloed in een 50-milliliter conische buis.Verdun het bloed met een gelijke hoeveelheid PBS zonder calcium en magnesium. Voeg 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de bodem van een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Overlay het verdunde bloed voorzichtig bovenop het dichtheidsgradiëntmedium, waardoor het mengen tussen het dichtheidsgradiëntmedium en verdund bloed wordt vermeden.Centrifuge op 400 keer g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder rem om verstoring van de interface te voorkomen. Gebruik na centrifugatie een pipet om de bovenste laag zorgvuldig aan te trekken en weg te gooien, met aandacht voor het niet verwijderen van cellen op de interface tussen het plasma- en dichtheidsgradiëntmedium. Verzamel zoveel mogelijk perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMC's, mogelijk uit de interface zonder de rode celpellet aan de onderkant van de 50-milliliter conische buis aan te raken en over te brengen naar een nieuwe buis.Voeg PBS toe om het uiteindelijke volume op 25 milliliter te brengen en om te keren meerdere keren om te mengen. Was vervolgens de PBMCs twee keer zoals aangegeven in de tekst. Na het verwijderen van de bloedplaatjes en het tellen van de PBMCs zoals beschreven in de tekst, resuspend de cellen in PBS, 0,1% natrium azide tot een concentratie van een keer 10 tot de zevende cellen per milliliter.Om de PBMCs voor te bereiden op vlekken, breng je 100 microliter van elk monster over naar een 96-well V-bodemplaat. Centrifugeren de plaat op 350 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Breng de supernatant voorzichtig aan zonder de celpellet te verstoren.Voeg aan elke put 100 microliter PBS toe met een levende/dode fixeerbare kleurstof die reageert met gratis amine op eiwitten en het PBMC-mengsel zorgvuldig opnieuw opschort. Laat de plaat vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur zitten voor het labelen van dode cellen. Bereid voor elk monster 30 microliter van een mix met alle zeven antilichamen.In dit stadium kunnen getitreerde antilichamen tegen verschillende doelmoleculen en in verschillende fluorchromen ook worden toegevoegd. Centrifugeer de 96-put plaat op 350 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur, en zorgvuldig aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet. Voeg de antilichaamcocktail toe aan elke put en maak voorzichtig opnieuw op te dagen zonder bellen te genereren.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg na 30 minuten 150 microliter kleuringsbuffer toe aan elke put en vercentrifugeert de plaat drie minuten lang op 350 keer g bij kamertemperatuur. Zorgvuldig aanzuigen van de supernatant zonder verstoring van de cel pellet, en resuspend de cellen in 200 microliter van PBS.De cellen zijn nu klaar voor flow cytometrie analyse. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 en TCR gamma delta antilichamen worden getitreerd met een maximale kleuring index curve. Antilichaam titratie is de meest kritische stap in dit protocol om goed te identificeren zeven immuuncel subset met behulp van twee fluorchromen.Om een tweevoudige verdunning van antilichamen voor te bereiden, vul 10 putten van een 96-putplaat met 40 microliter kleuringbuffer per put. Voor de toepassing van deze video wordt alleen de titratie van anti-CD8 getoond. In de eerste put, verhoging van het uiteindelijke volume tot 80 microliter van kleuring buffer, en voeg anti-CD8 bij een concentratie vier keer de concentratie voorgesteld door de fabrikant.Meng goed en breng 40 microliter naar de tweede put. Meng goed en herhaal deze stap voor alle andere putten. Vlek 10 monsters van PBMCs of volbloed met 30 microliter van de 10 verschillende tweevoudige verdunningen van anti-CD8 volgens het protocol eerder aangetoond.Verkrijg gegevens met een stroomcytometer en plot het signaal van elke verdunning. Na het berekenen van de vlekindex voor elke concentratie van antilichamen zoals beschreven in de tekst, zet u de vlekindex ten opzichte van de concentratie van antilichamen, uitgedrukt als een fractie van de verdunning van het antilichaam, in kaart en identificeert u de concentratie van het antilichaam met de maximale vlekindexwaarde. Om de anti-CD4 en anti-CD56 antilichamen te titreren, begin met de tweevoudige verdunningsstrategie die eerder werd aangetoond, waarbij extra concentraties tussenin worden toegevoegd om het concentratiebereik dat scheiding van CD4-positieve T-cellen en NK-cellen van de andere celpopulaties mogelijk maakt, fijn te identificeren.Titreert het anti-CD4 antilichaam door het anti-CD4 signaal te plaatsen tussen het dubbele CD8-positieve, CD3-positieve signaal en de CD3 enkele positieve populatie. Titreer het anti-CD56-antilichaam volgens een strategie die vergelijkbaar is met de anti-CD4-antilichaam titratie, door NK-cellen tussen de CD3-negatieve en de CD3-positieve populaties te plaatsen. Om te beginnen met deze twee-fluorochrome, zeven-marker gating strategie, selecteer de lymfocyten poort, en maak een stip plot met een van de twee fluorchromen gebruikt in dit protocol op elke as.Poort op CD8-positieve T-cellen geïdentificeerd als CD3 en CD8 dubbele positieve cellen in de rechterbovenhoek van de stip plot. Sluit de dim-CD8-populatie uit die NKT-cellen kan bevatten. Poort op CD4-positieve T cellen geïdentificeerd als de populatie tussen CD8-positieve T-cellen en de CD3 enkele positieve populaties.Poort op gamma delta T cellen geïdentificeerd als hoge CD3 cellen. Subdivide gamma delta T cellen naar CD8 positief en CD8 negatief. Poort op NK cellen geïdentificeerd als de populatie tussen CD3-positieve en CD3-negatieve cellen.Verdeel de NK-cellen onder cd8-positief en CD8-negatief. Poort op B-cellen geïdentificeerd als de CD3-negatieve, CD19-positieve populatie op de rechterbenedenhoek van de stip plot. Selecteer de monocytpoort en maak een stipplot met een van de twee fluorchromen die in dit protocol op elke as worden gebruikt.Poort op de CD3-negatieve, CD14-positieve bevolking. Met behulp van deze strategie werden lymfocyten van een patiënt met multipel myeloom afgesloten op basis van hun voorwaartse spreiding en zijverstrooiing en hun stromingscytometrisch profiel. CD8-positieve geheugen subpopulaties en naïeve T-cellen werden geïdentificeerd door de expressie van CD45RA en CCR7.Expressie van HLA-DR en CD57 werd gebruikt om T-celactivering te bestuderen in CD8-positieve naïeve, geheugen, centraal geheugen, effectorgeheugen en effectorgeheugen CD45RA-positieve cellen. Op een vergelijkbare manier werden CD4-positieve naïeve en geheugen T-cellen geïdentificeerd. Binnen de geheugenpopulatie werden CCR4 en CCR6 gebruikt om T-helper-subpopulaties in CD4-positieve T-cellen te identificeren.Subpopulaties van NK-cellen werden gekenmerkt door CD16 en CD57 expressie. Deze strategie werd gebruikt om de dynamiek in immuunpopulaties van longitudinale monsters van een donor met multipel myeloom die een stamceltransplantatie kreeg, te onderzoeken. Karakterisering van CD8 en CD4 subpopulaties na verloop van tijd toonde een aanhoudende CD4-positieve en CD8-positieve T-cel activering en een scheeftrekking van T helper om een T-helper-een fenotype.Maar op dag 60, het percentage van B-cellen drastisch verhoogd, het voorspellen van de patiënt terugval. Een goede celvoorbereiding en antilichaam titratie zijn cruciale stappen om betrouwbare resultaten te bereiken met behulp van deze techniek. Antilichaam gericht op andere markers kan worden toegevoegd om diepere stroom cytometrie analyse te bereiken en om modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten op hetzelfde moment te creëren.Soortgelijke benaderingen die gericht zijn op het uitbreiden van het aantal opneembare merkers kunnen ook worden ontwikkeld met behulp van verschillende sets marker of voor gebruik in verschillende diermodellen. Vergeet niet dat natriumaedide brandwonden kan veroorzaken aan huid en ogen. Daarom moeten een labjas, een beschermende bril en handschoenen altijd worden gedragen bij het hanteren van dit reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...