Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Haut-Krankheiten, < Https://www.niams.nih.gov/>, Prämiennummer P30-AR053503; Die Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina-Irland-Programm für Lunge Gesundheit (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Alle Studien der menschlichen Materialien wurden von der Johns Hopkins Institutional Review Board unter der Health Insurance Portability and Accountability Act genehmigt. Patienten und Kontrolle Proben wurden anonymisierte. PBMCs und Blut von gesunden Kontrollpersonen wurden durch Einwilligung erhalten.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde getestet auf frisch oder gefroren isoliert peripheren Blutzellen und Vollblut.
1. Zelle-Vorbereitung
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<str...

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	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Die hier vorgestellten Protokoll hat sich gezeigt, ganz flexibel und unempfindlich gegen Änderungen in der Färbung, Puffer, Temperatur und peripheren Blutzellen Vorbereitung durch die hohe Expression der Linie Marker auf der Zelloberfläche. Der wichtigste Schritt für den Erhalt qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten ist Antikörper-Titration. Der Hinweis Da die Titration der Antikörper immer während der Installation von einem Fluss durchflusszytometrischen Panel durchgeführt werden sollte wird dieser Sch...

Durchflusszytometrie ist eine Technik, die entwickelt wurde, um mehrere Parameter auf einzelne Teilchen mit einer Geschwindigkeit von mehreren tausend von Ereignissen pro Sekunde1zu analysieren. Beispiele von Flow Cytometry analysierten Proben enthalten, aber sind nicht beschränkt auf, Perlen, Bakterien, Vesikel, Zellen und Chromosomen. Fluidische System leitet Partikel zum Verhör Zeitpunkt jedes Partikels kreuzt ihren Weg mit einem oder mehreren Lasern, wobei mehrere Parameter sind für die weitere Analyse aufgezeichnet. Nach vorne und seitliche Streuungen, durch Streuung von der reinen Laserlicht erzeugt werden verwendet, um die Zielgruppe zu identifizieren und Abrufen von Informationen über die relative Größe und interne Komplexität/Granularität der Teilchen, bzw.. Alle anderen Parameter, die meisten Daten in einer durchflusszytometrischen Analyse Rechnung zu tragen, werden durch Fluorochrom-markierte Sonden abgeleitet, die erkennen und binden an spezifische Ziele auf die Partikel von Interesse.
Durchflusszytometrie ist ein wichtiges Werkzeug für immunologische Studien zu identifizieren und zu charakterisieren, Zell-Populationen. Um die Komplexität des Immunsystems zu sezieren, werden mehrfarbige Tafeln ständig weiterentwickelt, erweitern die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig für tiefe Immunphänotypisierung der Zelle Bevölkerungen1aufgezeichnet. Dies führt zu der Entwicklung leistungsfähiger Instrumente und Fluorochromes, mit den letzten High-End-fließen Cytometers von mehr als 20 fluoreszierenden Parameter. Dies führt zu komplexen Studiendesign aufgrund Fluorochrom spektrale Überlappung und höhere Kosten im Zusammenhang mit benutzerdefinierten Antikörper Kennzeichnung und qualifizierte Betreiber. In mehreren Fällen Komplexität und Kosten werden reduziert, mit separaten Feldern Marker für verschiedene Zellpopulationen. Dieser Ansatz jedoch fehleranfällig ist, reduziert die Information in jeder Gruppe und kann schwierig sein, auf Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen anwenden. Darüber hinaus schließt die Erhöhung der Anzahl der Marker Tiefe Immunphänotypisierung auf Instrumente mit weniger fluoreszierende Parametern. Wir zuvor entwickelt Färbung Protokoll um große Bevölkerungsgruppen immun zu identifizieren (CD4+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch die Kombination von sieben Linie Markierungen mit nur zwei Fluorochromes anstelle von den sieben erforderlich mit Hilfe der traditionellen "ein Fluorochrom-One Marker" Ansatz (www.hcdm.org)2,3. Unserem erste Bericht untersucht und bestätigt das Konzept der Kombination von sieben Markierungen in zwei Fluorochromes für tiefe Immunphänotypisierung. In diesem Bericht stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu isolieren und peripheren Blutzellen beflecken mit Schwerpunkt auf den praktischen Aspekt und Problembehandlung Schritte, um eine erfolgreiche Färbung zu erreichen.
Dieses Protokoll basiert auf der Beobachtung, dass Linie Marker einen konstanten Ausdruck auf der Zelloberfläche und dass jede Zellpopulation eine exklusive Kombination von Linie Marker hat. In PBMCs, CD3 Ausdruck Immunzellen in zwei Hauptkategorien unterteilt: CD3-positiven T-Lymphozyten und CD3-negativen Zellen. Innerhalb der CD3 positiven Untergruppe, CD4+, CD8+ und γδ T-Zellen mit Antikörpern, die ausschließlich CD4, CD8 und der γδ-Rezeptor getrennt werden können. In vergleichbarer Weise, innerhalb der CD3 negativen Untergruppe können B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten eindeutig identifiziert werden mit Antikörpern gegen CD19, CD56 und CD14, beziehungsweise. In einen standardisierten Ansatz für ein Fluorochrom-One Marker Anti-CD3-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 und -TCR γδ-Antikörper mit sieben verschiedenen Fluorochromes erkannt werden. Unser Ansatz kombiniert Anti-CD3 - CD56 und -TCR γδ Antikörper in einem Fluorochrom (für Bequemlichkeit Fluorochrom A beschriftet) und Anti-CD4-CD8, -CD14 und - CD19-Antikörper in einer unterschiedlichen Fluorochrom (Fluorochrom B). Dies ist möglich durch eine Kombination von Antikörper-Titration und differenzielle Antigen Ausdruck. Beide CD4+ und CD8+ T Zellen sind für den Anti-CD3-Antikörper in Fluorochrom A positiv, aber sie trennten sich im Fluorochrom B den Ausdruck des CD8-Signals während des Einsetzens mit einer ad-hoc-Titration, die CD4-Signal zwischen der CD8 zu maximieren und die CD3 positiven-CD4/CD8 doppelt Negative Zellen. Γδ T-Zellen drückt höheres Maß an CD3 CD4 und CD8, und daher als CD3 hoch4ausgewiesen werden können. Dieses Signal wird weiter verstärkt durch Kennzeichnung γδ T-Zellen in Fluorochrom A mit einer Anti-TCR γδ-Antikörpern, die Trennung zwischen niedrigen T-Zellen CD3 und CD3 hohe γδ T Zellen so zu verbessern. B-Zellen erkennen Sie als CD3– in Fluorochrom A und CD19+ in Fluorochrom B. Um negative NK-Zellen CD3 von B-Zellen zu trennen, wurde ein Anti-CD56-Antikörper in Fluorochrom A als Anti-CD3 verwendet. Dies ist möglich, weil CD56 auf NK-Zellen auf einem viel niedrigeren Niveau als CD3 auf T-Zellen-5zum Ausdruck gebracht. Zu guter Letzt sind Monozyten über eine Kombination von vorwärts-Side Scatter Eigenschaften und Expression von CD14 in Fluorochrom B. erkennbar
Die Idee der Kombination von bis zu vier Marker mit zwei Fluorochromes hat bereits erfolgreich vor6,7,8versucht worden und wurde in ein klinisches Protokoll verwendet, um bösartige lymphatische Populationen9 identifizieren . Ein früheren Bericht auch kombiniert sieben Markierungen (mit unterschiedlicher Spezifität von den Markern als wir in unser Protokoll verwendet) mit zwei Fluorochromes, aber dieser Ansatz auf eine komplexe Kennzeichnung jedes Antikörpers mit unterschiedliche Höhe der Fluorochrom10verlassen. Dies steht im Gegensatz zu unserer Methode, die im Handel erhältlichen Antikörper verwendet und kann angepasst werden, um die Gerätekonfiguration und profitieren von der neuen Generation von Polymer-Fluorochromes.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optischen Grenzen der meisten fließen Cytometers für die Aufzeichnung von fünf zusätzliche Markierungen ermöglichen komplexe Zellpopulationen zu verhören zu erweitern. Infolgedessen erweiterte immunologische Analysen auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers durchgeführt werden kann, und 2-3 Fluorochrom Feldgeräte können bemerkenswerte Ergebnisse in Regionen mit begrenzten Ressourcen erreichen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, durch zusätzliche Fluorochromes tiefer Flow-Zytometrie-Analyse durchzuführen und um modulare Fluss durchflusszytometrischen Panels auf mehreren Linien an der gleichen Zeit11zu erstellen. Dies kann potenziell reduzieren die Anzahl der Platten in modularen Immunphänotypisierung Durchflusszytometrie verwendet und Umgang mit Zeit, Kosten und Fehler. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut bei klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Immunzelle Charakterisierung stützt sich stark auf multicolor Durchflusszytometrie, basierte auf differentielle Expression der Oberflächenmarker Subpopulationen zu identifizieren. Setup von einem klassischen multicolor Panel erfordert High-End-Instrumente, benutzerdefinierte beschriftete Antikörper und sorgfältiges Studiendesign spektrale Überlappung zu minimieren. Wir entwickelten eine multiparametric Analyse, um die großen menschliche Immunsystem Populationen zu identifizieren (CD4+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) im peripheren Blut durch die Kombination von sieben Linie Marker mit nur zwei Fluorochromes. Unsere Strategie basiert auf der Beobachtung, dass Linie Markierungen ständig in einer einzigartigen Kombination von jeder Zellenbevölkerung ausgedrückt werden. Kombinieren diese Informationen mit einer sorgfältige Titration der Antikörper ermöglicht Ermittler, fünf weitere Symbole erweitert die optische Grenze von den meisten fließen Cytometers aufzuzeichnen. Direktvergleich gezeigt, dass die überwiegende Mehrheit der immun-Zell-Populationen im peripheren Blut mit vergleichbarer Genauigkeit zwischen unsere Methode und die klassische "ein Fluorochrom-One Marker Approach", charakterisiert werden kann, obwohl letztere ist nach wie vor genauer gesagt zur Identifizierung von Bevölkerungsgruppen wie NKT und γδ T-Zellen. Kombination von sieben Marker mit zwei Fluorochromes ermöglicht die Analyse von komplexen immun-Zell-Populationen und klinischen Proben auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers und sogar auf 2-3 Fluorochrom Feldgeräte in Gebieten mit begrenzten Ressourcen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, mit zusätzlichen Fluorochromes, um tiefer Flow-Zytometrie-Analyse zu erreichen. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut für das screening von mehreren Zellpopulationen im Falle von klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.

Einrichtung und Analyse eines Flow Cytometry Experiments des menschlichen peripheren Blutzellen gebeizt mit sieben Linie Marker (Anti-CD3-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 und -TCR γδ-Antikörper) mit nur zwei Fluorochromes werden vorgestellt.
Repräsentative Ergebnisse sind für Anti-CD8 und -CD56-Antikörper-Titration beschrieben. Für jeden Antikörper (in diesem Beispiel Anti-CD8), Daten aus zehn aufeinander folgenden 2-fold Ve...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, über die optische Grenze der meisten Durchflusszytometer hinaus zu expandieren, indem es einem Forscher ermöglicht wird, fünf zusätzliche Marker aufzuzeichnen, um komplexe Zellpopulationen zu hinterhören. Mit dieser Technik ist es möglich, eine tiefe Immunophenotypisierung zu erreichen, wenn man mit einem Instrument mit einer geringen Anzahl von Detektoren oder Proben mit begrenzter Anzahl von Zellen arbeitet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie gezogenes Blut sorgfältig in eine 50-Milliliter-Konustube übertragen.Das Blut mit einer gleichen Menge PBS ohne Kalzium und Magnesium verdünnen. Fügen Sie 15 Milliliter DichteGradient mittel an den Boden eines neuen 50-Milliliter konischen Rohrs hinzu. Überlagern Sie vorsichtig das verdünnte Blut über dem Dichtegradientenmedium, wodurch eine Vermischung zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem verdünnten Blut vermieden wird.Zentrifuge bei 400 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse, um Störungen der Schnittstelle zu vermeiden. Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine Pipette, um die obere Schicht sorgfältig zu aspirieren und zu verwerfen, wobei darauf zu achten ist, dass Zellen an der Schnittstelle zwischen Plasma- und Dichtegradientenmedium nicht entfernt werden. Sammeln Sie so viele periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMCs wie möglich von der Schnittstelle, ohne das rote Zellpellet an der Unterseite des 50-Milliliter-Konischen Rohrs zu berühren, und übertragen Sie es in ein neues Rohr.Fügen Sie PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf 25 Milliliter zu bringen, und invertieren Sie mehrmals, um es zu mischen. Waschen Sie dann die PBMCs doppelt wie im Text angegeben. Nach dem Entfernen der Thrombozyten und zählen die PBMCs, wie im Text beschrieben, setzen Sie die Zellen in PBS, 0,1% Natriumazid auf eine Konzentration von ein mal 10 bis die siebte Zelle pro Milliliter.Um die PBMCs für die Färbung vorzubereiten, übertragen Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf eine 96-Well-V-Bodenplatte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 350 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören.Zu jedem Brunnen, fügen Sie 100 Mikroliter PBS mit einem lebenden / toten fixierbaren Farbstoff, der mit freiem Amin auf Proteine reagiert, und setzen Sie die PBMC-Mischung sorgfältig aus. Anschließend lassen Sie die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur für die Kennzeichnung von abgestorbenen Zellen sitzen. Für jede Probe 30 Mikroliter einer Mischung vorbereiten, die alle sieben Antikörper enthält.In diesem Stadium können auch titrierte Antikörper gegen verschiedene Zielmoleküle und in verschiedenen Fluorchromen hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 350-fachem g für drei Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie den Antikörper-Cocktail zu jedem Brunnen hinzu und setzen Sie ihn sorgfältig wieder aus, ohne Blasen zu erzeugen.30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach 30 Minuten 150 Mikroliter Färbepuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte bei Raumtemperatur drei Minuten lang 350 mal g zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören, und die Zellen in 200 Mikroliter PBS wieder aussetzen.Die Zellen sind nun bereit für die Analyse der Durchflusszytometrie. Anti-CD3-, CD8-, CD14-, CD19- und TCR-Gammadelta-Antikörper werden mit einer maximalen Färbeindexkurve titriert. Die Antikörpertitration ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll, um sieben Immunzellen-Submenge mit zwei Fluorchromen richtig zu identifizieren.Um eine zweifache Antikörperverdünnung vorzubereiten, füllen Sie 10 Brunnen einer 96-Well-Platte mit 40 Mikroliter Neinen Färbepuffer pro Brunnen. Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Titration von Anti-CD8 angezeigt. Erhöhen Sie im ersten Brunnen das Endvolumen auf 80 Mikroliter Färbepuffer, und fügen Sie Anti-CD8 in einer Konzentration hinzu, die viermal so hoch ist wie der Hersteller.Gut mischen und 40 Mikroliter auf den zweiten Brunnen übertragen. Mischen Sie gut und wiederholen Sie diesen Schritt für alle anderen Brunnen. Stain 10 Proben von PBMCs oder Vollblut mit 30 Mikroliter der 10 verschiedenen zweifachen Verdünnungen von Anti-CD8 nach dem Zuvor gezeigten Protokoll.Erfassen Sie Daten mit einem Durchflusszytometer, und zeichnen Sie das Signal aus jeder Verdünnung. Nach der Berechnung des Fleckenindex für jede Antikörperkonzentration, wie im Text beschrieben, zeichnen Sie den Fleckenindex im Vergleich zur Antikörperkonzentration, ausgedrückt als Bruchteil der Antikörperverdünnung, und identifizieren Sie die Konzentration des Antikörpers mit dem maximalen Fleckenindexwert. Um die Anti-CD4- und Anti-CD56-Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der zuvor gezeigten zweifachen Verdünnungsstrategie, indem sie zusätzliche Konzentrationen dazwischen hinzufügt, um den Konzentrationsbereich, der eine Trennung von CD4-positiven T-Zellen und NK-Zellen von den anderen Zellpopulationen ermöglicht, fein zu identifizieren.Titrate den Anti-CD4-Antikörper, indem das Anti-CD4-Signal zwischen dem Doppel-CD8-positiven, CD3-positiven Signal und der CD3-Einzel-positiven Population platziert wird. Titrate den Anti-CD56-Antikörper nach einer Strategie ähnlich der Anti-CD4-Antikörpertitration, indem NK-Zellen zwischen den CD3-negativen und den CD3-positiven Populationen platziert werden. Um diese Zwei-Fluorchrome-, Sieben-Marker-Gating-Strategie zu beginnen, wählen Sie das Lymphozytentor aus, und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem der beiden Fluorchrome, die in diesem Protokoll auf jeder Achse verwendet werden.Gate auf CD8-positiven T-Zellen, die als CD3- und CD8-Doppel-Positive-Zellen in der oberen rechten Ecke des Punktdiagramms identifiziert wurden. Schließen Sie die dim CD8-Population aus, die NKT-Zellen enthalten könnte. Gate auf CD4-positiven T-Zellen identifiziert als die Population zwischen CD8-positive T-Zellen und die CD3 einzelne positive Populationen.Gate auf Gamma-Delta-T-Zellen, die als hohe CD3-Zellen identifiziert wurden. Unterteilen Sie Gamma-Delta-T-Zellen in CD8-positiv und CD8-negativ. Gate auf NK-Zellen identifiziert als die Population zwischen CD3-positive und CD3-negative Zellen.Unterteilen Sie die NK-Zellen in CD8-positiv und CD8-negativ. Gate auf B-Zellen, die als CD3-negative, CD19-positive Population in der unteren rechten Ecke des Punktdiagramms identifiziert wurden. Wählen Sie das Monozytentor aus, und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem der beiden Fluorchrome, die in diesem Protokoll auf jeder Achse verwendet werden.Gate auf der CD3-negativen, CD14-positiven Population. Mit dieser Strategie wurden Lymphozyten eines Patienten mit multiplem Myelom auf der Grundlage ihrer Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung und ihres zytometrischen Flussprofils abgegrenzt. CD8-positive Speichersubpopulationen und naive T-Zellen wurden durch die Expression von CD45RA und CCR7 identifiziert.Expression von HLA-DR und CD57 wurde verwendet, um T-Zell-Aktivierung in CD8-positive naive, Speicher, zentralem Speicher, Effektorspeicher und Effektorspeicher CD45RA-positive Zellen zu untersuchen. In ähnlicher Weise wurden CD4-positive naive und Speicher-T-Zellen identifiziert. Innerhalb der Speicherpopulation wurden CCR4 und CCR6 verwendet, um T-Helfer-Subpopulationen in CD4-positiven T-Zellen zu identifizieren.Subpopulationen von NK-Zellen wurden durch CD16- und CD57-Expression charakterisiert. Diese Strategie wurde verwendet, um die Dynamik in Immunpopulationen von Längsproben von einem Spender mit multiplem Myelom zu untersuchen, der eine Stammzelltransplantation erhält. Die Charakterisierung von CD8- und CD4-Subpopulationen im Laufe der Zeit zeigte eine anhaltende CD4-positive und CD8-positive T-Zellaktivierung und eine Neigung des T-Helfers zu einem T-Helfer-eins-Phänotyp.Aber am 60. Tag erhöhte sich der Prozentsatz der B-Zellen dramatisch und prognostizierte den Patienten-Rückfall. Richtige Zellvorbereitung und Antikörpertitration sind wichtige Schritte, um zuverlässige Ergebnisse mit dieser Technik zu erzielen. Antikörper, die auf andere Marker abzielen, können hinzugefügt werden, um eine tiefere Flusszytometrieanalyse durchzuführen und modulare zytometrische Durchflusspanels zu erstellen, die mehrere Linien gleichzeitig ansprechen.Ähnliche Ansätze zur Erweiterung der Anzahl der beschreibbaren Marker könnten auch mit unterschiedlichen Markersätzen oder für den Einsatz in verschiedenen Tiermodellen entwickelt werden. Vergessen Sie nicht, dass Natriumazid Verbrennungen an Haut und Augen verursachen kann. Daher sollten bei der Handhabung dieses Reagenzes immer ein Labormantel, eine Schutzbrille und Handschuhe getragen werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Forschung

Immunologie und Infektion

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Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

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