Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ועל מחלות עור, < https://www.niams.nih.gov/>, פרס מספר P30-AR053503; קרן גם אני, www.stablerfoundation.org; לאומי המכון לאלרגיה, מחלות זיהומיות, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; נינה אירלנד תוכנית עבור ריאות בריאות (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

כל המחקרים חומרים אנושיים אושרו על-ידי ג'ונס הופקינס מוסדיים ועדת הבדיקה תחת ביטוח בריאות ניידות דין וחשבון. דוגמאות החולה ושליטה היו de-מזוהה. PBMCs ודם מפני פקדי בריא התקבלו על ידי הסכמה מדעת.
הערה: פרוטוקול זה נבדק על טריות או קפואות מבודדות תאי דם היקפיים, דם מלא.
<...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

פרוטוקול המובאת כאן הוכח להיות די גמיש וחסר רגישות לשינויים מכתים מאגר בטמפרטורה, תא דם היקפיים הכנה בשל ביטוי גבוהה של שושלת היוחסין סמנים על פני התא. השלב הקריטי ביותר עבור קבלת נתונים באיכות גבוהה, לשחזור הוא נוגדן טיטור. ראוי לציין, מאז טיטרציה של נוגדנים תמיד להתבצע במהלך ההגדרה של לו?...

Cytometry זרימה היא טכניקה שפותחה כדי לנתח פרמטרים מרובים על חלקיקי יחיד בשיעור של אלפי אירועים לכל השני1. דוגמאות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה כוללים, אך אינם מוגבלים, תאים, חרוזים, חיידקים, שלפוחית, כרומוזומים. מערכת fluidic מנחה את החלקיקים בשלב החקירה שבו כל חלקיק חותך הנתיב שלו עם לייזרים אחד או יותר, פרמטרים מרובים נרשמים לצורך ניתוח נוסף. קדימה ואת הצד בסורקים, שנוצר על ידי פיזור של האור לייזר טהור, משמשים כדי לזהות אוכלוסית היעד ולאחזר מידע על גודלו היחסי פנימיות מורכבות צפיפות החלקיקים, בהתאמה. כל הפרמטרים האחרים, זה חשבון עבור רוב הנתונים בניתוח cytometric זרימה, נגזרים על ידי הגששים התווית על-ידי fluorochrome מזהה, לאגד מטרות ספציפיות על החלקיקים עניין.
Cytometry זרימה הוא כלי ראשי ללימודי אימונולוגי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים. לנתח את המורכבות של מערכת החיסון, לוחות ססגוניות מתפתחים כל הזמן כדי להרחיב את מספר סמנים שנרשם בו-זמנית עבור immunophenotyping עמוק של אוכלוסיות תא1. זה מוביל להתפתחות של fluorochromes, והכלים כשרוני עם האחרונים cytometers זרימה באיכות גבוהה העולה על 20 פרמטרים פלורסנט. התוצאה היא תכנון המחקר מורכבים בשל חפיפה ספקטרלי fluorochrome, עלויות גבוהות יותר הקשורים עם מפעילי labelling ומיומנים נוגדנים מותאמים אישית. במספר מקרים, מורכבות ועלויות מופחתים באמצעות לוחות נפרדים של סמנים עבור אוכלוסיות תאים שונים. גישה זו, עם זאת, מועדת לשגיאות, מפחית את המידע בחלונית כל אחד, יכול להיות קשה להחיל על דגימות עם מספר מצומצם של תאים. יתר על כן, הגדלת מספר סמנים מונע עמוק immunophenotyping על מכשירים עם פרמטרים פלורסנט פחות. קודם לכן פיתחנו פרוטוקול מכתימים לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בתוך תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות רק שני fluorochromes במקום ה-7 הנדרש באמצעות המסורתי "סמן אחד fluorochrome אחד" הגישה (www.hcdm.org)2,3. הדו ח הראשוני שלנו חקר ואומת הרעיון של שילוב סמני שבע שני fluorochromes עבור immunophenotyping עמוק. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול צעד צעד-מאת לבודד, כתם כדוריות דם היקפיים, התמקדות בהיבט המעשי ופתרון צעדים כדי להשיג מכתים מוצלחת.
פרוטוקול זה מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני יש ביטוי קבוע על פני התא, כי האוכלוסייה בכל תא יש שילוב בלעדי של שושלת היוחסין סמנים. ב- PBMCs, ביטוי CD3 subdivides תאים חיסוניים לשתי קטגוריות עיקריות: CD3-חיובי T לימפוציטים ותאי CD3-שלילי. בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4+, CD8+ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה. בגישה fluorochrome-אחד סמן סטנדרטי אחד, נגד-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ו- TCR נוגדנים γδ מזוהים עם שבעה fluorochromes שונים. הגישה שלנו משלבת אנטי CD3-CD56, ו- - TCR נוגדנים γδ אחד fluorochrome (הנקראת עבור נוחות fluorochrome A), אנטי-CD4,-CD8, - CD14 ו- CD19 נוגדנים בבית fluorochrome שונים (fluorochrome B). הדבר אפשרי ע י שילוב של נוגדן טיטור וביטוי אנטיגן דיפרנציאלית. CD4 בשני+ ו CD8+ T תאים הן חיוביות עבור נוגדן anti-CD3 ב- fluorochrome A, אבל הם יכולים להיות מופרדים ב- fluorochrome B למקסם את הביטוי של האות CD8 תוך הצבת, עם טיטור אד הוק, האות CD4 בין CD8, התאים חיובי-CD4/CD8 כפול שלילי CD3. תאי T γδ מבטא רמה גבוהה יותר של CD3 מאשר CD4 ו CD8, ולכן הם יכולים להיות מזוהה CD3 גבוהה4. האות הזה הוא מועלה על ידי תיוג γδ תאי T ב- fluorochrome A עם נוגדנים γδ anti-TCR, ובכך לשפר את ההפרדה בין תאי T נמוך CD3 CD3 גבוהה γδ T תאים. בתאי B יכול להיות מזוהה CD3– ב fluorochrome A ו- CD19+ ב- fluorochrome B. כדי להפריד CD3 שליליים תאי NK מתאי B, נוגדן anti-CD56 שימש ב- fluorochrome A האנטי-CD3. דבר זה אפשרי משום CD56 הביע על תאי NK ברמה נמוכה יותר מאשר CD3 על תאי T5. לבסוף, ומונוציטים ניתן לזהות באמצעות שילוב של מאפיינים לפנים לצד פיזור וביטוי של CD14 ב- fluorochrome B.
הרעיון של שילוב עד ארבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes יש ניסיון כבר בהצלחה לפני6,7,8, נעשה שימוש ב פרוטוקול קליני כדי לזהות אוכלוסיות לימפוציטית ממאיר9 . הדוח הקודם גם משולב 7 סמנים (עם ירידה לפרטים שונים של הסמנים פעם בפרוטוקול שלנו) באמצעות שתי fluorochromes, אך גישה זו התבססה על תוויות מתחם של כל נוגדן עם כמות משתנה של fluorochrome10. זהו לעומת השיטה שלנו, אשר משתמשת נוגדנים זמינים מסחרית, ניתן להתאים את תצורת המכשיר והוא יכול לנצל הדור החדש של פולימר fluorochromes.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הגבולות אופטי של רוב cytometers זרימה המאפשר ההקלטה של חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבים. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוח אימונולוגי מתקדמים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, 2-3 fluorochrome שדה מכשירים ניתן להשיג תוצאות יוצא דופן באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה כדי ליצור זרימה מודולרי cytometric לוחות מיקוד מספר שושלות באותו הזמן11. זה יכול באופן פוטנציאלי להפחית את מספר לוחות המשמשים cytometry זרימה immunophenotyping מודולרית, להפחית עלויות, שגיאות זמן טיפול. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

איפיון תאים חיסוניים מסתמך בכבדות על cytometry זרימה ססגוניות לזהות subpopulations מבוסס על ביטוי דיפרנציאלי של סמני פני השטח. ההתקנה של לוח ססגוניות הקלאסי דורש כלים באיכות גבוהה, נוגדנים עם תוויות מותאמות אישית ועיצוב ללמוד בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלי. פיתחנו ניתוח multiparametric לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בדם היקפי על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות fluorochromes רק שני. האסטרטגיה שלנו מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני כל הזמן לידי ביטוי שילוב ייחודי לכל אוכלוסיית תאים. שילוב של מידע זה עם טיטור זהיר של הנוגדנים מאפשרת החוקרים להקליט חמישה סמנים נוספים, להרחיב את מגבלת אופטי של רוב cytometers זרימה. השוואה עפות הוכיח כי ניתן לאפיין את הרוב המכריע של אוכלוסיות תאים חיסוניים בדם היקפי עם דיוק השוואה בין השיטה שלנו קלאסי "סמן fluorochrome-אחד אחד הגישה", למרות שהאחרון הוא עדיין מדויקת יותר לזיהוי אוכלוסיות כגון NKT תאים ותאים γδ T. שילוב של שבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes מאפשר הניתוח של אוכלוסיות תא החיסון מורכבות ודוגמאות קליניים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, וכן 2-3 fluorochrome כלי נגינה שדה באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד לסינון מספר אוכלוסיות תאים במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

הגדרה וניתוח של ניסוי cytometry זרימה תאי דם היקפיים האנושי צבעונית עם שבעה סמנים השושלת (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-נוגדנים γδ CD19, - CD56 ו- TCR) משתמשת רק בשני fluorochromes מוצגים.
התוצאות נציג מתוארים אנטי-CD8 ו- CD56 נוגדן טיטור. עבור כל נוגדן (בדוגמה זו, אנטי-CD8), נתונ...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להתרחב מעבר לגבול האופטי של רוב ציטומטרים זרימה על ידי מתן אפשרות לחוקר להקליט חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבות. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשיג immunophenotyping עמוק בעת עבודה עם מכשיר עם מספר נמוך של גלאים או מדגם עם מספר מוגבל של תאים. התחל הליך זה על ידי העברה בזהירות דם נמשך לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.לדלל את הדם עם כמות שווה של PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתחתית צינור חרוט חדש של 50 מיליליטר. בזהירות כיסוי הדם מדולל על גבי המדיום שיפוע צפיפות, הימנעות כל ערבוב בין בינוני שיפוע צפיפות דם מדולל.צנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם, כדי למנוע שיבוש של הממשק. לאחר צנטריפוגה, להשתמש פיפטה כדי לשאוף בזהירות להשליך את השכבה העליונה, לשים לב לא להסיר תאים בממשק בין פלזמה בינוני שיפוע צפיפות. לאסוף כמו תאים mononuclear דם היקפיים רבים, או PBMCs, ככל האפשר מן הממשק מבלי לגעת גלולת התא האדום בתחתית הצינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר צינור חדש.הוסף PBS כדי להביא את הנפח הסופי ל 25 מיליליטר, ולהפוך מספר פעמים לערבב. לאחר מכן, שטפו את המחשבים האישיים כפליים מהמצוין בטקסט. לאחר הסרת טסיות הדם וספירת PBMCs כמתואר בטקסט, לעשות שימוש חוזר בתאים ב- PBS, 0.1% נתרן אזיד לריכוז של אחד פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.כדי להכין את המחשבים האישיים לכתמים, העבר 100 מיקרוליטרים של כל דגימה לצלחת V-bottom של 96 בארות. צנטריפוגה הצלחת ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.לכל באר, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS המכילים צבע חי/מת לתיקון שמגיב עם אמין חופשי על חלבונים, והשקיעו מחדש את תערובת PBMC בזהירות. לאחר מכן, לאפשר את הצלחת לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עבור תיוג של תאים מתים. לכל דגימה, הכינו 30 מיקרוליטרים של תערובת המכילה את כל שבעת הנוגדנים.בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים ציטרקטיביים נגד מולקולות מטרה שונות וגם ב פלואורוכרומים שונים. צנטריפוגה צלחת 96 גם ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לכל באר, ומוסיפים מחדש בזהירות מבלי לייצר בועות.דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר 30 דקות, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לכל באר, וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 פעמים גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא, ו resuspend התאים ב 200 microliters של PBS.התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה. נוגדנים נגד CD3, CD8, CD14, CD19 ודלתא גמא TCR הם titrated עם עקומת אינדקס כתמים מקסימלית. טיטרציה נוגדנים היא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה כדי לזהות כראוי שבעה תת-קבוצה של תאים חיסוניים באמצעות שני פלואורוכרומים.כדי להכין דילול נוגדנים כפול, מלאו 10 בארות של צלחת של 96 בארות עם 40 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לגם. לצורך וידאו זה, רק את התיסוס של אנטי CD8 יוצגו. באר הראשונה, להגדיל את הנפח הסופי ל 80 microliters של חיץ כתמים, ולהוסיף אנטי CD8 בריכוז ארבע פעמים את הריכוז המוצע על ידי היצרן.מערבבים היטב ומעבירים 40 מיקרוליטרים לגם השני. מערבבים היטב וחוזרים על שלב זה עבור כל הבארות האחרות. כתמים 10 דגימות של PBMCs או דם שלם עם 30 microliters של 10 דילולים שונים כפולים של אנטי CD8 בעקבות הפרוטוקול הפגינו קודם לכן.להשיג נתונים עם ציטומטר זרימה, ולתהות את האות מכל דילול. לאחר חישוב מדד הכתמים עבור כל ריכוז נוגדנים כמפורט בטקסט, התווה את מדד הכתמים לעומת ריכוז הנוגדנים שבא לידי ביטוי כשבר בדילול הנוגדנים, וזהה את ריכוז הנוגדן עם ערך מדד הכתמים המרבי. כדי לתייג את הנוגדנים נגד CD4 ואנטי-CD56, התחילו באסטרטגיית הדילול הדו-פי שניים שהוכחה קודם לכן, והוסיפו ריכוזים נוספים ביניהם כדי לזהות היטב את טווח הריכוז שיאפשר הפרדה של תאי T ותאי NK חיוביים CD4 מאוכלוסיות התאים האחרות.תטטר את הנוגדן נגד CD4 על-ידי הצבת האות נגד CD4 בין האות החיובי ל-CD8 הכפול, החיובי ל-CD3, לבין האוכלוסיה החיובית הבודדת CD3. Titrate נוגדן נגד CD56 בעקבות אסטרטגיה דומה טיטרציה נוגדנים נגד CD4, על ידי הצבת תאי NK בין CD3 שלילי לבין אוכלוסיות CD3 חיובי. כדי להתחיל את אסטרטגיית הגט של שני פלואורוכרום, שבעה סמן, בחר את שער הלימפוציטים, וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.שער בתאי T חיוביים ל- CD8 המזוהים כתאי CD3 ו- CD8 חיוביים כפולים בפינה השמאלית העליונה של התוויית הנקודה. אל תכלול את אוכלוסיית CD8 העמומה שעשויה להכיל תאי NKT. שער בתאי T חיוביים ל- CD4 המזוהים כאוכלוסיה בין תאי T חיוביים ל- CD8 לבין האוכלוסיות החיוביות היחידות של CD3.שער בתאי דלתא T של גמא שזוהו כתאי CD3 גבוהים. Subdivide גאמא דלתא T תאים כדי CD8 חיובי ו CD8 שלילי. שער בתאי NK המזוהים כאוכלוסיה בין תאים חיוביים ל- CD3 ו- CD3 שליליים.חלק את תאי ה- NK ל- CD8 חיובי ו- CD8 שלילי. שער בתאי B המזוהים כאוכלוסייה CD3 שלילית, CD19 חיובי בפינה הימנית התחתונה של התוויית הנקודה. בחר את שער המונוציטים וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.שער על CD3 שלילי, CD14 חיובי אוכלוסייה. באמצעות אסטרטגיה זו, לימפוציטים של חולה עם מיאלומה נפוצה היו מגודרים על בסיס פיזור קדימה שלהם פיזור הצד ואת הפרופיל הציטומטרי זרימה שלהם. תקליטורים חיוביים לזיכרון ותאי T נאיביים זוהו על ידי ביטוי של CD45RA ו- CCR7.ביטוי של HLA-DR ו- CD57 שימש לחקר הפעלת תאי T בתאים נאיביים, זיכרון, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטר ותאים חיוביים לזיכרון אפקטים CD45RA. באופן דומה, תאי T נאיביים וזיכרון חיוביים CD4 זוהו. בתוך אוכלוסיית הזיכרון, CCR4 ו- CCR6 שימשו לזיהוי תת-אוכלוסייה מסייעת T בתאי T חיוביים ל- CD4.תתי-תתי-פיפוזיציה של תאי NK התאפיינו בביטוי CD16 ו- CD57. אסטרטגיה זו שימשה כדי לחקור את הדינמיקה באוכלוסיות החיסון של דגימות אורך מתורם עם מיאלומה נפוצה קבלת השתלת תאי גזע. אפיון של תתי-תפוקות CD8 ו- CD4 לאורך זמן הראה הפעלת תא T חיובית ו- CD8 חיובית מתמשכת והטייה של מסייע T לפנוטיפ T-helper-one.אבל ביום 60, אחוז תאי B גדל באופן דרמטי, מנבא את ההתדרדרות של המטופל. הכנת תאים נכונה טיטרציה נוגדנים הם צעדים קריטיים כדי להשיג תוצאות אמינות באמצעות טכניקה זו. נוגדן מיקוד סמנים אחרים ניתן להוסיף כדי להשיג ניתוח cytometry זרימה עמוקה יותר וליצור לוחות ציטומטרי זרימה מודולרית מיקוד מספר שושלת באותו זמן.גישות דומות שמטרתן להרחיב את מספר סמנים לתיעוד ניתן גם לפתח באמצעות סטים שונים של סמן או לשימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אל תשכח כי נתרן אזיד יכול לגרום כוויות לעור ולעיניים. לכן, חלוק מעבדה, משקפי מגן, וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול זה reagent.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...