Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dall'Istituto nazionale dell'artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie della pelle, < https://www.niams.nih.gov/>, premio numero P30-AR053503; La Fondazione Stabler, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy and Infectious Disease, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irlanda programma per la salute del polmone (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Tutti gli studi dei materiali umani sono stati approvati da Johns Hopkins Institutional Review Board sotto l'Health Insurance Portability and Accountability Act. Campioni di pazienti e dei controlli sono stati de-identificati. PBMCs e sangue dai comandi sani sono stati ottenuti da consenso informato.
Nota: Questo protocollo è stato testato su fresco o congelato isolato cellule del sangue periferico e nel sangue intero.
1. cella preparazione
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	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Il protocollo presentato qui ha dimostrato di essere abbastanza flessibile e insensibile ai cambiamenti di macchiatura buffer, la temperatura e la preparazione delle cellule del sangue periferico a causa l'alta espressione di marcatori di lignaggio sulla superficie delle cellule. La fase più critica per l'ottenimento di dati di alta qualità, riproducibili è la titolazione di anticorpi. Di nota, dato che la titolazione degli anticorpi deve sempre essere eseguita durante l'installazione di un pannello di cytometric di f...

Citometria a flusso è una tecnica che è stata sviluppata per analizzare più parametri su singole particelle ad una velocità di diverse migliaia di eventi al secondo1. Esempi di esemplari analizzati tramite flusso cytometry includono, ma non sono limitati a, cellule, perline, batteri, vescicole e cromosomi. Un sistema fluidico dirige le particelle nel punto di interrogatorio dove ogni particella si interseca il percorso con uno o più laser, e più parametri vengono registrati per ulteriori analisi. Disperde in avanti e laterali, generati dallo scattering della luce pura laser, vengono utilizzati per identificare la popolazione target e recuperare informazioni sulla dimensione relativa e la complessità interna/granularità delle particelle, rispettivamente. Tutti gli altri parametri, che rappresentano la maggior parte dei dati in un analisi cytometric di flusso, sono derivati dalle sonde fluorocromo-etichetta che riconoscono e si legano a specifici obiettivi sulle particelle di interesse.
Citometria a flusso è uno strumento primario per gli studi immunologici identificare e caratterizzare le popolazioni delle cellule. Per sezionare la complessità del sistema immunitario, pannelli multicolor sono in continua evoluzione per espandere il numero di marcatori contemporaneamente registrate per profonda immunophenotyping delle popolazioni delle cellule1. Questo sta portando allo sviluppo di strumenti più capaci e fluorocromi, con recente citometri a flusso High-end superiore a 20 parametri fluorescenti. Ciò si traduce nella progettazione di studio complesso a causa della sovrapposizione spettrale fluorocromo e costi più elevati connessi con operatori qualificati ed etichettatura su ordinazione dell'anticorpo. In diversi casi, complessità e i costi sono ridotti utilizzando pannelli separati di marcatori per diverse popolazioni cellulari. Questo approccio, tuttavia, è soggetto a errori, riduce le informazioni in ogni pannello e può essere difficile da applicare ai campioni con un numero limitato di cellule. Inoltre, aumentando il numero di marcatori preclude immunophenotyping profondo sugli strumenti con meno parametri fluorescenti. Precedentemente abbiamo sviluppato un protocollo di colorazione per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4+ e CD8+ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) in cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) combinando sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi anziché sette necessaria utilizzando il tradizionale "un fluorocromo-uno marcatore" approccio (www.hcdm.org)2,3. Il nostro rapporto iniziale esplorato e convalidato la nozione di combinare sette marcatori in due fluorocromi per immunophenotyping profonda. In questo rapporto, presentiamo un protocollo passo a passo per isolare e macchiare le cellule del sangue periferico, concentrandosi sull'aspetto pratico e risoluzione dei problemi per ottenere una colorazione di successo.
Questo protocollo è basato sull'osservazione che i marcatori lineage hanno un'espressione costante sulla superficie delle cellule e che ogni popolazione delle cellule ha un'esclusiva combinazione di marcatori di lignaggio. In PBMCs, espressione CD3 suddivide le cellule immuni in due categorie principali: i linfociti T CD3 positivi e cellule CD3-negative. All'interno del sottogruppo positivo CD3, CD4+, CD8+ e cellule T γδ possono essere separate usando gli anticorpi destinati esclusivamente a CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo paragonabile, all'interno del sottogruppo negativo CD3, cellule B, cellule NK e dei monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente. In un approccio di marcatore fluorocromo-uno uno standard, anti-CD3-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e TCR - γδ gli anticorpi vengono rilevati con sette diversi fluorocromi. Il nostro approccio combina anti-CD3 - CD56 e TCR - γδ anticorpi in un fluorocromo (etichettato per fluorocromo convenienza A) e anti-CD4,-CD8, - CD14 e - CD19 anticorpi in un fluorocromo diverso (fluorocromo B). Questo è possibile tramite una combinazione di titolazione degli anticorpi e l'espressione dell'antigene differenziale. Entrambi CD4+ e CD8+ T cellule sono positive per l'anticorpo anti-CD3 in fluorocromo A, ma possono essere separati in fluorocromo B massimizzando l'espressione del CD8 segnale durante l'inserimento, con una titolazione ad hoc, il segnale di CD4 tra il CD8 e le cellule di CD3 positivi-CD4/CD8 doppia negazione. Cellule T γδ esprime il livello di CD3 superiore CD4 e CD8, e pertanto possono essere identificati come CD3 alta4. Questo segnale è ulteriormente potenziato dall'etichettatura γδ cellule T in fluorocromo A con un anticorpi di anti-TCR γδ, migliorando così la separazione tra CD3 basso T cellule e cellule di alta γδ T CD3. Le cellule B possono essere identificate come CD3– di fluorocromo A e CD19+ in fluorocromo B. Per separare le cellule di NK CD3 negative dalle cellule di B, un anticorpo anti-CD56 fu adibito a fluorocromo A anti-CD3. Questo è possibile perché CD56 espressi sulla cellula NK ad un livello molto inferiore rispetto CD3 su cellule T5. Infine, i monociti possono essere individuati tramite una combinazione di proprietà di forward-side scatter ed espressione di CD14 in fluorocromo B.
L'idea di combinare fino a quattro marcatori utilizzando due fluorocromi è stato tentato già con successo prima delle6,7,8ed è stato utilizzato in un protocollo clinico per identificare popolazioni linfocitarie maligni9 . Un rapporto precedente anche combinato sette indicatori (con differente specificità dal marcatori che abbiamo usato nel nostro protocollo) utilizzando due fluorocromi, ma questo approccio invocata una complessa l'etichettatura di ciascun anticorpo con quantità variabile di fluorocromo10. Questo è in contrasto con il nostro metodo che utilizza anticorpi disponibili in commercio e può essere adattato per la configurazione dello strumento e possa avvantaggiarsi della nuova generazione dei fluorocromi polimero.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandere i limiti ottici della maggior parte dei citometri a flusso permettendo la registrazione di cinque ulteriori indicatori per interrogare le popolazioni delle cellule complesse. Di conseguenza, avanzata analisi immunologica può essere eseguita su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e 2-3 fluorocromo campo strumenti possono raggiungere notevoli risultati nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso e creare modularità del flusso cytometric pannelli diversi lignaggi al tempo stesso11di targeting. Questo può potenzialmente ridurre il numero di pannelli utilizzati in citometria a flusso modulare immunophenotyping e ridurre i costi, errori e tempo di trattamento. Questo approccio è anche molto adatto nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Caratterizzazione delle cellule immuni si basa fortemente su multicolor flusso cytometry per identificare sottopopolazioni basate su espressione differenziale dei marcatori di superficie. Installazione di un pannello multicolor classico richiede strumenti high-end, gli anticorpi con etichettati personalizzati e attento studio design per minimizzare la sovrapposizione spettrale. Abbiamo sviluppato un'analisi multiparametrica per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4+ e CD8+ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) nel sangue periferico mediante la combinazione di sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi. La nostra strategia si basa sull'osservazione che marcatori lignaggio costantemente sono espressi in una combinazione unica di ogni popolazione cellulare. Combinando queste informazioni con un'attenta titolazione degli anticorpi permette ai ricercatori di registrare cinque indicatori aggiuntivi, espandendo il limite ottico della maggior parte dei citometri a flusso. Confronto testa a testa ha dimostrato che la stragrande maggioranza delle popolazioni di cellule immuni nel sangue periferico può essere caratterizzata con precisione paragonabile tra il nostro metodo ed il classico "approccio di indicatore di un fluorocromo-uno", anche se quest'ultimo è ancora più precisi per l'identificazione di popolazioni come T γδ cellule e cellule NKT. Combinazione di sette indicatori utilizzando due fluorocromi permette l'analisi delle popolazioni delle cellule immuni complesse e campioni clinici su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e anche su 2-3 strumenti di campo fluorocromo nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso. Questo approccio è anche molto adatto per lo screening di diverse popolazioni di cellule nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.

L'installazione e l'analisi di un esperimento di citometria a flusso delle cellule del sangue periferico umane macchiato con sette indicatori di lignaggio (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-anticorpi γδ CD19, - CD56 e - TCR) utilizzando solo due fluorocromi sono presentati.
Risultati rappresentativi sono descritte per anti-CD8 e - CD56 titolazione di anticorpi. Per ogni anticorpo (in questo esempio, anti-CD8), sono stati registrati ...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandersi oltre il limite ottico della maggior parte dei citometri di flusso consentendo a un ricercatore di registrare cinque marcatori aggiuntivi per interrogare popolazioni cellulari complesse. Utilizzando questa tecnica, è possibile ottenere un immunofenotipizzazione profonda quando si lavora con uno strumento con un basso numero di rivelatori o campione con un numero limitato di cellule. Iniziare questa procedura trasferendo accuratamente il sangue prelevato in un tubo conico da 50 millilitri.Diluire il sangue con una quantità uguale di PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 15 millilitri di gradiente di densità medio al fondo di un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sovrapporre con cura il sangue diluito sopra il mezzo gradiente di densità, evitando qualsiasi miscelazione tra il mezzo gradiente di densità e il sangue diluito.Centrifuga a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza freno per evitare interruzioni dell'interfaccia. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per aspirare e scartare attentamente lo strato superiore, prestando attenzione a non rimuovere le cellule all'interfaccia tra il plasma e il mezzo gradiente di densità. Raccogliere il maggior numero possibile di cellule mononucleari del sangue periferico, o PBBC, dall'interfaccia senza toccare il pellet di globuli rossi nella parte inferiore del tubo conico da 50 millilitri e trasferirlo in un nuovo tubo.Aggiungere PBS per portare il volume finale a 25 millilitri e invertire più volte per mescolare. Quindi, lavare i PBBC due volte come indicato nel testo. Dopo aver rimosso le piastrine e aver contato i PBPC come descritto nel testo, rimescolare le cellule in PBS, 0,1% di azide di sodio a una concentrazione di una volta 10 alla settima cellule per millilitro.Per preparare i PBBC per la colorazione, trasferire 100 microlitri di ciascun campione su una piastra inferiore a V da 96 porri. Centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.Ad ogni pozzo, aggiungere 100 microlitri di PBS contenenti un colorante fissabile vivo / morto che reagisce con ammina libera sulle proteine e risospendare attentamente la miscela PBMC. Successivamente, lasciare riposare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente per l'etichettatura delle cellule morte. Per ogni campione, preparare 30 microlitri di una miscela contenente tutti e sette gli anticorpi.In questa fase, possono essere aggiunti anche anticorpi titorati contro diverse molecole bersaglio e in diversi fluorocromi. Centrifugare la piastra di 96 pozzi a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente e aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il cocktail di anticorpi ad ogni pozzo e ripreziosare con attenzione senza generare bolle.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo 30 minuti, aggiungere 150 microlitri di tampone di colorazione ad ogni pozzo e centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e rimescolare le cellule in 200 microlitri di PBS.Le cellule sono ora pronte per l'analisi della citometria del flusso. Gli anticorpi anti-CD3, CD8, CD14, CD19 e TCR gamma delta sono titolazione con una curva dell'indice di colorazione massima. La titolazione degli anticorpi è il passaggio più critico di questo protocollo per identificare correttamente sette sottoinsiemi di cellule immunitarie usando due fluorocromi.Per preparare una diluizione anticorpale duplice, riempire 10 pozzi di una piastra da 96 porri con 40 microlitri di tampone di colorazione per pozzo. Ai fini di questo video, verrà mostrata solo la titolazione di anti-CD8. Nel primo pozzo, aumentare il volume finale a 80 microlitri di tampone di colorazione e aggiungere anti-CD8 ad una concentrazione quattro volte superiore alla concentrazione suggerita dal produttore.Mescolare bene e trasferire 40 microlitri al secondo pozzo. Mescolare bene e ripetere questo passaggio per tutti gli altri pozzi. Macchiare 10 campioni di PBBC o sangue intero con 30 microlitri delle 10 diverse diluizioni due volte dell'anti-CD8 seguendo il protocollo dimostrato in precedenza.Acquisire dati con un citometro di flusso e tracciare il segnale da ogni diluizione. Dopo aver calcolato l'indice di macchia per ciascuna concentrazione di anticorpi come specificato nel testo, tracciare l'indice di macchia rispetto alla concentrazione di anticorpi espressa come frazione della diluizione dell'anticorpo e identificare la concentrazione di anticorpi con il valore massimo dell'indice di macchia. Per titolare gli anticorpi anti-CD4 e anti-CD56, iniziare con la duplice strategia di diluizione dimostrata in precedenza, aggiungendo ulteriori concentrazioni nel mezzo per identificare finemente l'intervallo di concentrazione che consentirà la separazione delle cellule T cd4-positive e delle cellule NK dalle altre popolazioni cellulari.Titolare l'anticorpo anti-CD4 posizionando il segnale anti-CD4 tra il doppio segnale CD8-positivo, CD3-positivo e la singola popolazione positiva CD3. Titolare l'anticorpo anti-CD56 seguendo una strategia simile alla titolazione anticorpale anti-CD4, posizionando le cellule NK tra le popolazioni CD3-negative e CD3-positive. Per iniziare questa strategia di gating a due fluorocromi, a sette marcatori, selezionare il cancello dei linfociti e creare un grafico a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.Gate su cellule T cd8-positive identificate come cellule doppie positive CD3 e CD8 nell'angolo in alto a destra del grafico a punti. Escludere la popolazione di CD8 fioca che potrebbe contenere celle NKT. Gate su cellule T positive cd4 identificate come la popolazione tra le cellule T cd8-positive e le singole popolazioni positive cd3.Gate su cellule gamma delta T identificate come cellule CD3 alte. Suddividere le cellule gamma delta T in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate sulle cellule NK identificate come la popolazione tra le cellule CD3-positive e CD3-negative.Suddividere le celle NK in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate su cellule B identificato come la popolazione CD3-negativa, CD19-positiva nell'angolo in basso a destra del grafico a punti. Selezionate il cancello del monocita e create un plottaggio a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.Gate sulla popolazione CD3-negativa, CD14-positiva. Utilizzando questa strategia, i linfociti di un paziente con mieloma multiplo sono stati gated sulla base della loro dispersione in avanti e della dispersione laterale e del loro profilo citometrico del flusso. Sottopopolazioni di memoria cd8-positive e cellule T ingenua sono state identificate dall'espressione di CD45RA e CCR7.L'espressione di HLA-DR e CD57 è stata usata per studiare l'attivazione delle cellule T in ingenuità CD8, memoria, memoria centrale, memoria effettore e memoria effettore CD45RA-positive. Allo stesso modo, sono state identificate le cellule T ingenue e di memoria positive del CD4. All'interno della popolazione di memoria, CCR4 e CCR6 sono stati utilizzati per identificare le sottopopolazioni di aiutanti T nelle cellule T positive del CD4.Le sottopopolazioni delle cellule NK erano caratterizzate dall'espressione CD16 e CD57. Questa strategia è stata utilizzata per indagare la dinamica delle popolazioni immunitarie di campioni longitudinali di un donatore con mieloma multiplo che riceve un trapianto di cellule staminali. La caratterizzazione delle sottopopolazioni CD8 e CD4 nel tempo ha mostrato un'attivazione sostenuta di cellule T CD4-positive e CD8-positive e un'inclinazione dell'aiutante T a un fenotipo T-helper-one.Ma al giorno 60, la percentuale di cellule B aumentò drasticamente, predicendo la ricaduta del paziente. Una corretta preparazione cellulare e la titolazione degli anticorpi sono passaggi critici per ottenere risultati affidabili utilizzando questa tecnica. Gli anticorpi mirati ad altri marcatori possono essere aggiunti per eseguire analisi citometriche a flusso più profondo e per creare pannelli citometrici a flusso modulare mirati a più lignaggi contemporaneamente.Approcci simili volti ad ampliare il numero di marcatori registrabili potrebbero anche essere sviluppati utilizzando diversi gruppi di marcatori o per l'uso in diversi modelli animali. Non dimenticare che l'azide di sodio può causare ustioni alla pelle e agli occhi. Pertanto, un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti dovrebbero sempre essere indossati quando si maneggia questo reagente.

Research

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