Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 < https://www.niams.nih.gov/>, 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

인간의 물질의 모든 연구는 건강 보험 이동성 및 책임에 관한 법률에서 존스 홉킨스 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 환자 및 제어 샘플 드 확인 했다입니다. PBMCs와 건강 한 컨트롤에서 혈액은 동의 의해 얻은 했다.
참고: 이 프로토콜에 갓 테스트 되거나 고립 된 냉동 주변 혈액 세포와 전체 혈액.
1. 세포 준비
<ol><li>
전체 혈액에...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정...

Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.
Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 많은 능력의 개발을 선도 합니다. 이 결과 형광 색소 스펙트럼 중복으로 인해 복잡 한 연구 디자인 및 사용자 지정 항 체 라벨 및 숙련 된 연산자와 관련 된 높은 비용. 여러 인스턴스, 복잡성 및 비용 다른 세포 인구에 대 한 마커의 별도 패널을 사용 하 여 감소 된다. 그러나이 방법은, 오류가 발생 하기 쉬우며, 각 패널에 정보를 감소 이며 세포의 제한 된 수의 샘플에 적용 하기 어려울 수 있습니다. 또한, 적은 형광 매개 변수를 가진 계기에 깊은 immunophenotyping을 걸로 하겠습니다 마커 수 증가. 우리는 이전 주요 면역 인구를 식별 하는 얼룩 프로토콜을 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 7 혈통 마커를 사용 하 여 결합 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 7 대신만 두 형광 전통적인 "한 형광 색소 1 마커" 접근 (www.hcdm.org)2,3를 사용 하 여 필요 합니다. 우리의 초기 보고서 탐색 하 고 깊은 immunophenotyping에 대 한 두 가지 형광에 7 개의 마커를 결합의 개념을 확인. 이 보고서에서 우리는 단계에 의해 단계 프로토콜을 분리 하 고 주변 혈액 세포, 얼룩를 제시 하는 실용적인 측면에 초점을 맞추고 및 성공적인 얼룩을 달성 하는 단계를 문제 해결.
이 프로토콜은 그 혈통 마커 상수 식 세포 표면에 있고 각 셀 인구는 혈통 마커의 독점 조합 관찰을 기반으로 합니다. PBMCs에서 CD3 식 다시 나눈다 면역 세포 두 가지 주요 범주로: CD3 양성 T 림프 톨 및 CD3-부정적인 세포. CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여. 표준 한 형광 색소 1 마커 접근, 안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-7 다른 형광 CD19-CD56, TCR-γ 항 체는 검출. 우리의 접근 방식, 결합 한 안티-CD3-CD56, 그리고 한 형광 색소 (형광 색소 편의 A에 대 한 분류) 및 안티-CD4-TCR γ 항 체-CD8,-CD14와-CD19 항 체에 다른 형광 색소 (형광 색소 B). 이 항 체 적정 및 차동 항 식의 조합에 의해 가능 하다. 두 CD4+ 와 CD8+ T 세포에 형광 색소, 안티-CD3 항 체에 대 한 긍정적인 하지만 형광 B는 CD8 사이 CD4 신호를 ad hoc 적정으로 배치 하면서 CD8 신호 표현의 극대화 색소에서 분리 될 수 있다 고 CD3 이중 부정 긍정적인-CD4/CD8 세포. Γ T 세포 표현 보다는 c d 4와 CD8, CD3의 높은 수준 그리고 그러므로 그들은 CD3 높은4로 식별할 수 있습니다. 이 신호는 라벨 γ 형광 색소 A CD3 낮은 T 세포와 CD3 높은 γ T 세포 구분 개선 한 안티 TCR γ 항 체와 T 세포에 의해 더 밀어 주었다. B 세포는 c d 3로 확인 될 수 있다- 형광 색소 A와 CD19+ 형광 색소 나에 CD3 부정적인 NK 세포 B 세포에서 분리, 안티 CD56 항 체는 형광 색소 A에에서 안티-CD3으로 사용 되었다. CD56 CD3 T 세포5보다 훨씬 낮은 수준에서 NK 세포에 표현 했기 때문에 이것이 가능 합니다. 마지막으로, monocytes는 앞으로 사이드 분산형 속성 및 형광 색소 B. CD14의 식의 조합을 통해 확인할 수 있습니다.
2 형광을 사용 하 여 최대 4 개의 마커를 결합의 아이디어6,7,8, 전에 이미 성공적으로 시도 하 고 악성 림프 인구9 식별 하는 임상 프로토콜에 사용 되었습니다. . 이전 보고서는 또한 7 개의 마커를 결합 (다른 특이성 표식에서와 우리가 우리의 프로토콜에서 사용 하는 보다) 다양 한 양의 형광 색소10각 항 체의 복잡 한 라벨에 의존 2 개의 형광, 하지만이 방법을 사용 하 여. 이 대조적으로 우리의 메서드는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하 여 악기 구성에 적용할 수 있습니다 하 고 고분자 형광의 새로운 세대를 활용할 수 있습니다.
이 방법론의 전반적인 목표 대부분 교류 cytometers 복잡 한 세포 인구가 5 추가 마커의 녹음에 대 한 수의 광학 한계를 확장 하는 것입니다. 결과적으로, 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers에 고급 면역학 분석을 수행할 수 있습니다 그리고 2-3 형광 색소 필드 악기 한정 된 자원 가진 지역에서 놀라운 결과 얻을 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 수행 하 고 동일한 시간11에서 여러 계보를 대상으로 하는 cytometric 패널 모듈형 흐름을 만들려면 추가 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 잠재적으로 모듈형 immunophenotyping cytometry에 사용 되는 패널의 수를 감소 하 고 비용, 오류 및 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 적합 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
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discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 "한 형광 색소 1 마커 접근", 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.

설정 및 인간 주변 혈액 세포의 흐름 cytometry 실험의 분석 물 7 혈통 마커 (안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-CD19-CD56, TCR-γ 항 체)만 두를 사용 하 여 형광 표시 됩니다.
한 안티 CD8-CD56 항 체 적정 대표적인 결과 설명 합니다. 각 항 체에 대 한 (이 예제에서는 안티-CD8), 10 연속 2-fold 희석에서 데이터 얼룩 인덱스 곡선 (그림 1A-C)을 계...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

이 방법론의 전반적인 목표는 연구원이 복잡한 세포 집단을 심문하기 위하여 5개의 추가 마커를 기록할 수 있게 함으로써 대부분의 유량 세포계의 광학 한계를 넘어 확장하는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 제한된 수의 세포로 검출기 또는 샘플의 낮은 수와 기기로 작업 할 때 깊은 면역 페노티핑을 달성 할 수있다. 그려진 혈액을 50밀리리터 원내 튜브로 조심스럽게 이송하여 이 절차를 시작합니다.칼슘과 마그네슘없이 PBS의 동일한 금액으로 혈액을 희석. 새로운 50밀리리터 원판 튜브의 바닥에 밀도 그라데이션 배지 15밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션 배지 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 오버레이하여 밀도 그라데이션 배지와 희석된 혈액 간의 혼합을 피합니다.원심분리기는 실온에서 30분 동안 400배 g의 원심분리기로, 브레이크없이 인터페이스의 중단을 방지합니다. 원심분리 후 파이펫을 사용하여 상층을 조심스럽게 흡인하고 폐기하여 플라즈마와 밀도 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 세포를 제거하지 않도록 주의를 기울입니다. 50밀리리터 원핵튜브의 바닥에 있는 적혈구 펠릿을 만지지 않고 인터페이스로부터 가능한 한 많은 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC를 수집하고 새로운 튜브로 이송한다.PBS를 추가하여 최종 볼륨을 25 밀리리터에 가져오고 여러 번 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 텍스트에 표시된 대로 PBMC를 두 번 세척합니다. 혈소판을 제거하고 텍스트에 설명된 바와 같이 PBMC를 계수한 후, PBS에서 세포를 재연한 후, 0.1%의 나트륨 아지드를 밀리리터당 7번째 세포에 1회 10분의 1의 농도로 재보페팅한다.염색을 위해 PBMC를 준비하려면 각 샘플의 100 마이크로리터를 96웰 V-바닥 플레이트로 전송합니다. 상온에서 3분 동안 350배g의 접시를 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다.각 우물에, 단백질에 무료 아민과 반응하는 라이브 / 죽은 고정 염료를 포함하는 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 신중하게 PBMC 혼합물을 다시 중단. 그 후, 플레이트가 죽은 세포의 라벨링을 위해 실온에서 10 분 동안 앉을 수 있도록하십시오. 각 샘플에 대해, 모든 7개의 항체를 포함하는 혼합의 30 마이크로리터를 준비합니다.이 단계에서, 다른 표적 분자및 다른 형광에 대하여 적정항체는 또한 추가할 수 있습니다. 실온에서 3분 동안 96웰 플레이트를 350배g에서 원심분리하고 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 항체 칵테일을 각 웰에 넣고 거품을 일으키지 않고 조심스럽게 다시 일시 중지합니다.어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 30분 후 각 웰에 150마이크로리터의 염색 버퍼를 추가하고 실온에서 3분 동안 350배의 플레이트를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시키고 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 재보힙합니다.세포는 이제 유동 세포 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 안티 CD3, CD8, CD14, CD19 및 TCR 감마 델타 항체는 최대 염색 지수 곡선으로 적정화된다. 항체 적정은 2개의 불소크롬을 사용하여 7개의 면역 세포 서브세트를 제대로 확인하기 위하여 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.2배 의 항체 희석을 준비하려면 96웰 플레이트 의 10웰을 우물당 40 마이크로리터의 염색 버퍼로 채웁니다. 이 비디오의 목적을 위해 안티 CD8의 적정만 표시됩니다. 첫 번째 우물에서는 최종 부피를 염색 버퍼의 80 마이크로리터로 늘리고 제조업체가 제안한 농도의 4배 의 농도로 안티 CD8을 첨가한다.잘 섞어서 40마이크로리터를 두 번째로 잘 옮기. 잘 섞어서 다른 모든 우물에 대해이 단계를 반복하십시오. 이전에 입증된 프로토콜에 따라 10개의 다른 2배 희석제 중 30개의 마이크로리터를 가진 PBMC 또는 전혈의 스테인 10 샘플.유동 사이토미터로 데이터를 획득하고 각 희석으로부터 신호를 플롯합니다. 각 항체 농도에 대한 얼룩 지수를 산출한 후, 항체 희석의 일부로 발현된 항체 농도 대 얼룩 지수를 플롯하고, 최대 얼룩 지수 값을 가진 항체의 농도를 식별한다. 반대로 CD4 및 반대로 CD56 항체를 적재하기 위하여는, 이전에 입증된 2배 희석 전략으로 시작하여, 다른 세포 집단으로부터 CD4 양성 T 세포 및 NK 세포의 분리를 허용할 농도의 범위를 미세하게 식별하기 위해 그 사이에 추가 농도를 추가한다.이중 CD8 양성, CD3 양성 신호 및 CD3 단일 양성 집단 사이에 안티 CD4 신호를 배치하여 안티 CD4 항체를 적시한다. CD3-음수 및 CD3 양성 집단 사이에 NK 세포를 배치함으로써, 안티 CD4 항체 적정과 유사한 전략을 따르는 항 CD56 항체를 적티레이. 이 두 불소, 7 마커 게이팅 전략을 시작하려면 림프구 게이트를 선택하고 각 축에서이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오로크롬 중 하나와 함께 점 플롯을 만듭니다.CD8 양성 T 세포의 게이트는 점 플롯의 오른쪽 상단에 있는 CD3 및 CD8 이중 양성 셀로 확인되었습니다. NKT 셀을 포함할 수 있는 희미한 CD8 인구를 제외합니다. CD8 양성 T 세포와 CD3 단일 양성 집단 사이의 인구로 확인된 CD4 양성 T 세포의 게이트.높은 CD3 세포로 확인된 감마 델타 T 세포의 게이트. 감마 델타 T 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. CD3 양성 및 CD3 음성 세포 사이의 인구로 확인된 NK 세포의 게이트.NK 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. 점 플롯의 오른쪽 하단모서리에 있는 CD3-음수, CD19 양성 집단으로 확인된 B 세포의 게이트. 단두구 게이트를 선택하고 각 축에서 이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오크롬 중 하나를 사용하여 도트 플롯을 만듭니다.CD3-음수, CD14 양성 모집단의 게이트입니다. 이 전략을 사용하여 다발성 골수종을 가진 환자의 림프구는 전방 산란 및 측면 분산 및 유동 세포 측정 프로파일에 기초하여 문이 되었습니다. CD8 양성 메모리 하위 집단 및 순진한 T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현에 의해 확인되었다.HLA-DR 및 CD57의 발현은 CD8 양성 순진한, 메모리, 중앙 메모리, 이펙터 메모리 및 이펙터 메모리 CD45RA 양성 세포에서 T 세포 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다. 유사한 방식으로, CD4 양성 순진한 기억 및 메모리 T 세포가 확인되었다. 메모리 집단 내에서 CCR4 및 CCR6는 CD4 양성 T 세포에서 T 도우미 하위 집단을 식별하는 데 사용되었습니다.NK 세포의 하위 집단은 CD16 및 CD57 발현을 특징으로 하였다. 이 전략은 줄기 세포 이식을 수신하는 다발성 골수종을 가진 기증자에게서 세로 견본의 면역 집단에 있는 역학을 조사하기 위하여 이용되었습니다. 시간이 지남에 따라 CD8 및 CD4 하위 집단의 특성화는 지속적인 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 활성화 및 T 도우미-1 표현형에 T 도우미의 왜곡을 보였다.그러나 60일째에, B 세포의 백분율은 극적으로 증강되어 환자 재발을 예측했습니다. 적절한 세포 제제 및 항체 적정은 이 기술을 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 달성하기 위한 중요한 단계이다. 다른 마커를 표적으로 하는 항체는 더 깊은 유동 세포측정 분석을 달성하고 동시에 여러 혈통을 표적으로 하는 모듈형 흐름 세포 측정 패널을 생성하기 위하여 추가될 수 있습니다.기록 가능한 마커의 수를 확대하기위한 유사한 접근 법은 다양한 마커 세트를 사용하거나 다른 동물 모델에서 사용하기 위해 개발 될 수 있습니다. 아지드 나트륨이 피부와 눈에 화상을 입을 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 이 시약을 취급할 때는 실험실 코트, 보호 안경 및 장갑을 착용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

연구

면역학 및 감염병학

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...