Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Denne studien ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer, < https://www.niams.nih.gov/>, prisen nummer P30-AR053503; Stabler stiftelsen, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge helse (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Alle studier av menneskelig materialer ble godkjent av Johns Hopkins institusjonelle anmeldelsen bord under Health Insurance Portability and Accountability Act. Pasienten og kontroll var de identifiserte. PBMCs og blod fra sunn kontroller ble oppnådd ved samtykke.
Merk: Denne protokollen er testet på fersk eller frossen isolert perifert blod celler og hele blod.
1. celle forberedelse
<ol><li>
Isolering av perifert blod celler (PBMC) fra ...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Protokollen presenteres her har vist seg å være ganske fleksibel og ufølsom for endringer i flekker buffer, temperatur og eksterne blodlegemer forberedelse på grunn av høy uttrykk for lineage markører på cellens overflate. Det viktigste trinnet for å få høy kvalitet og reproduserbar data er antistoff titrering. Av notatet, siden Serine antistoffer skal alltid utføres under installasjonen av en flyt cytometric panel, legge dette trinnet ikke ekstra benk-tid til våre to-fluorochrome tilnærming. Titrering av an...

Flowcytometri er en teknikk som ble utviklet for å analysere flere parametere på enkelt partikler med en hastighet på flere tusen av hendelser per andre1. Eksempler av analysert av flowcytometri omfatter, men er ikke begrenset til, celler, perler, bakterier, blemmer og kromosomer. Et fluidic system leder partikler i avhør punktet der hver partikkel krysser banen med én eller flere lasere, og flere parametere registreres for videre analyse. Fremover og side Scattere, generert av spredning av ren laserlys, brukes til å identifisere målgruppen og hente informasjon om den relative størrelsen og interne kompleksitet/detaljnivå av partikler, henholdsvis. Alle de andre parametrene, som står for mesteparten av dataene i en flyt cytometric analyse, er avledet av fluorochrome-merket sonder gjenkjenner og binder seg til konkrete mål på partikler av interesse.
Flowcytometri er hovedverktøy for immunologiske studier for å identifisere og karakterisere celle populasjoner. For å analysere kompleksiteten av immunsystemet, utvikling flerfarget paneler stadig for å utvide antall markører samtidig registrert for dyp immunophenotyping celle populasjoner1. Dette fører til utvikling av mer kapabel instrumenter og fluorochromes, med siste high-end flyt cytometers overstiger 20 fluorescerende parametere. Dette resulterer i komplekse studien design på grunn av fluorochrome spectral overlapping og høyere kostnader forbundet med egendefinerte antistoff merking og dyktige operatører. I flere tilfeller reduseres kompleksiteten og kostnadene med forskjellige paneler av markører for ulike celle populasjoner. Denne tilnærmingen, men er feil, reduserer informasjonen i hvert panel, og kan være vanskelig å bruke prøver med begrenset antall celler. Videre utelukker øke antall markører dyp immunophenotyping på instrumenter med færre fluorescerende parametere. Vi utviklet en fargeprotokoll for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes i stedet for syv må bruke den tradisjonelle "en fluorochrome-en indikator" tilnærming (www.hcdm.org)2,3. Vår første rapport undersøkt og godkjent begrepet kombinere syv markører i to fluorochromes for dyp immunophenotyping. I denne rapporten presenterer vi en steg-for trinn protokoll for å isolere og flekken perifert blod celler, med fokus på det praktiske aspektet og feilsøkingstrinn for å oppnå en vellykket flekker.
Denne protokollen er basert på observasjon at lineage markører har et konstant uttrykk på celleoverflaten og at hver celle befolkningen har en eksklusiv kombinasjon av lineage markører. I PBMCs, CD3 uttrykk deler immunceller inn i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negativ celler. I CD3 positiv undergruppen, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan deles ved hjelp av antistoffer som er utelukkende rettet mot CD4 og CD8 γδ reseptoren. På en tilsvarende måte, innenfor CD3 negative undergruppen, kan B celler, NK celler og monocytter identifiseres med antistoffer mot CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorochrome-en markør tilnærming, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer er oppdaget med syv forskjellige fluorochromes. Vår tilnærming kombinerer anti-CD3, - CD56 og -TCR γδ antistoffer i en fluorochrome (merket for bekvemmelighet fluorochrome A) og anti-CD4,-CD8, -CD14 og - CD19 antistoffer i en annen fluorochrome (fluorochrome B). Dette er mulig ved en kombinasjon av antistoff titrering og differensial antigen uttrykk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive anti-CD3 antistoffer i fluorochrome A, men de kan skilles i fluorochrome B maksimere uttrykk for CD8 signalet mens plassere, med en ad hoc titrering, CD4 signalet mellom CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbel negative cellene. Γδ T-celler uttrykker høyere nivå av CD3 enn CD4 og CD8, og derfor de kan identifiseres som CD3 høy4. Signalet er ytterligere styrket av merking γδ T celler i fluorochrome A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre skille mellom CD3 lav T celler og CD3 høy γδ T celler. B celler kan identifiseres som CD3- i fluorochrome A og CD19+ i fluorochrome B. Separate CD3 negative NK celler fra B-celler, ble et anti-CD56 antistoff brukt i fluorochrome A som anti-CD3. Dette er mulig fordi CD56 uttrykt på NK celle på et mye lavere nivå enn CD3 på T celler5. Til slutt, monocytter kan identifiseres via en kombinasjon av frem-side scatter egenskaper og uttrykk for CD14 i fluorochrome B.
Ideen om å kombinere opp til fire markører bruker to fluorochromes har allerede har tidligere vært forsøkt6,7,8, og har vært brukt i en klinisk protokoll for å identifisere ondartet lymfatisk bestander9 . En tidligere rapport også kombinert syv markører (med ulike spesifisitet fra markører enn vi brukt i våre protokollen) bruker to fluorochromes, men denne tilnærmingen avhengig av en sammensatt merking av hver antistoff med varierende mengde fluorochrome10. Dette er vår metode som bruker kommersielt tilgjengelige antistoffer og kan tilpasses Instrumentkonfigurasjonen og kan dra nytte av den nye generasjonen av polymer fluorochromes.
Det overordnede målet med denne metoden er å utvide optisk grensene for de fleste flyt cytometers slik at innspillingen av fem ekstra markører kan forhøre komplekse celle populasjoner. Som en konsekvens, avansert immunologiske analyse kan utføres på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og 2-3 fluorochrome feltet instrumenter kan oppnå bemerkelsesverdige resultater i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes å oppnå dypere flyt cytometri analyse og opprette modulære flyt cytometric paneler målretting flere linjene på samme tid11. Dette kan potensielt redusere antall paneler som brukes i modulære immunophenotyping flowcytometri og redusere kostnader, feil og håndtering tid. Denne tilnærmingen er også godt egnet ved klinisk prøver med begrenset antall celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Immun celle karakteristikk er sterkt avhengig av flerfarget flowcytometri å identifisere subpopulasjoner basert på annerledes uttrykk for overflate markører. Installasjonen av en klassisk multicolor panel krever high-end instrumenter, egendefinert merket antistoffer og nøye studie design å minimere spectral overlapping. Vi utviklet en multiparametric analyse for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes. Vår strategi er basert på observasjon at lineage markører er stadig uttrykt i en unik kombinasjon av hver celle befolkningen. Kombinere denne informasjonen med en forsiktig titrering av antistoffer kan etterforskerne å spille fem ekstra markører, utvide optisk grensen på de fleste flyt cytometers. Head-to-Head sammenligning viste at det store flertallet av immun celle populasjoner i perifert blod kan være preget med tilsvarende nøyaktighet mellom vår metode og den klassiske "et fluorochrome-ett merke tilnærmingen", selv om sistnevnte er fortsatt mer nøyaktig identifisere bestander som NKT celler og γδ T celler. Kombinere syv markører bruker to fluorochromes tillater analyse av komplekse immun celle populasjoner og klinisk eksempler på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og selv om 2-3 fluorochrome feltet instrumenter i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes for å oppnå dypere flyt cytometri analyse. Denne tilnærmingen er også godt egnet for screening flere celle populasjoner i klinisk prøver med begrenset antall celler.

Oppsett og analyse av en flyt cytometri eksperimentet menneskeceller perifert blod farget med syv lineage markører (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer) bruke bare to fluorochromes presenteres.
Representant resultater er beskrevet for anti-CD8 og -CD56 antistoff titrering. For hver antistoff (i dette eksemplet anti-CD8), data fra ti påfølgende 2-fold fortynninger ble registrert for å beregne en f...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Her presenterer vi en flyt cytometric protokoll for å identifisere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter i perifert menneskeblod med bare to fluorochromes i stedet for syv. Med denne tilnærmingen, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flyt cytometers.

Diskriminering av syv immun celle undergrupper av to-fluorochrome Flow cytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Det overordnede målet med denne metodikken er å utvide utover den optiske grensen for de fleste strømningssytometre ved å la en forsker registrere fem ekstra markører for å avhøre komplekse cellepopulasjoner. Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å oppnå en dyp immunofenotyping når du arbeider med instrument med et lavt antall detektorer eller prøve med begrenset antall celler. Begynn denne prosedyren ved å forsiktig overføre trukket blod til et 50-milliliter konisk rør.Fortynn blodet med like mye PBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 15 milliliter tetthetsgradientmedium til bunnen av et nytt konisk rør på 50 milliliter. Legg forsiktig det fortynnede blodet på toppen av tetthetsgradientmediet, unngår blanding mellom tetthetsgradientmediet og fortynnet blod.Sentrifuge ved 400 ganger g i 30 minutter ved romtemperatur uten brems for å unngå forstyrrelser i grensesnittet. Etter sentrifugering, bruk en pipette til å forsiktig aspirere og kaste det øvre laget, og vær oppmerksom på å ikke fjerne celler i grensesnittet mellom plasma- og tetthetsgradientmediet. Samle så mange perifere blod mononukleære celler, eller PBMCer, som mulig fra grensesnittet uten å berøre røde celle pellet på bunnen av 50-milliliter konisk rør, og overføre til et nytt rør.Legg pbs for å bringe det endelige volumet til 25 milliliter, og invertere flere ganger for å blande. Vask deretter PBMCene dobbelt så mye som angitt i teksten. Etter å ha fjernet blodplatene og telle PBMCs som beskrevet i teksten, gjenbruke cellene i PBS, 0,1% natriumazid til en konsentrasjon på en ganger 10 til de syvende cellene per milliliter.For å forberede PBMCene for farging, overfør 100 mikroliter av hver prøve til en 96-brønns V-bunnplate. Sentrifuger platen ved 350 ganger g i tre minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig det overnaturante uten å forstyrre cellepelleten.Til hver brønn, tilsett 100 mikroliter PBS som inneholder et levende / dødt fixable fargestoff som reagerer med gratis amin på proteiner, og gjenbruker PBMC-blandingen nøye. Deretter la platen sitte i 10 minutter ved romtemperatur for merking av døde celler. For hver prøve, forberede 30 mikroliter av en blanding som inneholder alle syv antistoffer.På dette stadiet kan titrerte antistoffer mot forskjellige målmolekyler og i forskjellige fluorokromer også legges til. Sentrifuger 96-brønnsplaten ved 350 ganger g i tre minutter ved romtemperatur, og aspirer forsiktig det overnaturante uten å forstyrre cellepelleten. Tilsett antistoffcocktailen til hver brønn, og gjenoppbruk forsiktig uten å generere bobler.Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Etter 30 minutter, tilsett 150 mikroliter med fargingsbuffer til hver brønn, og sentrifuger platen ved 350 ganger g i tre minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig det overnaturante uten å forstyrre cellepellet, og gjenbruke cellene i 200 mikroliter pbs.Cellene er nå klare for flytcytometrianalyse. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 og TCR gamma delta antistoffer er titrert med en maksimal fargeindeks kurve. Antistofftitrering er det mest kritiske trinnet i denne protokollen for å identifisere syv immuncelleundersett på riktig måte ved hjelp av to fluorokromer.For å forberede en todobling av antistofffortynning, fyll 10 brønner av en 96-brønns plate med 40 mikroliter fargingsbuffer per brønn. I forbindelse med denne videoen vises bare titreringen av anti-CD8. I den første brønnen øker du det endelige volumet til 80 mikroliter med fargingsbuffer, og legger til anti-CD8 i en konsentrasjon fire ganger konsentrasjonen foreslått av produsenten.Bland godt og overfør 40 mikroliter til den andre brønnen. Bland godt og gjenta dette trinnet for alle de andre brønnene. Flekk 10 prøver av PBMCer eller fullblod med 30 mikroliter av de 10 forskjellige to-fold fortynninger av anti-CD8 etter protokollen demonstrert tidligere.Hent data med et strømningssytometer, og plott signalet fra hver fortynning. Etter beregning av flekkindeksen for hver antistoffkonsentrasjon som beskrevet i teksten, plotter flekkindeksen versus antistoffkonsentrasjonen uttrykt som en brøkdel av antistofffortynningen, og identifiserer konsentrasjonen av antistoff med maksimal flekkindeksverdi. For å titrere anti-CD4 og anti-CD56 antistoffer, start med to ganger fortynningsstrategi demonstrert tidligere, og legger til ytterligere konsentrasjoner i mellom for å fin identifisere konsentrasjonsområdet som vil tillate separasjon av CD4-positive T-celler og NK-celler fra de andre cellepopulasjonene.Titrer anti-CD4-antistoffet ved å plassere anti-CD4-signalet mellom det doble CD8-positive, CD3-positive signalet og CD3 enkelt positiv befolkning. Titrer anti-CD56-antistoffet etter en strategi som ligner på anti-CD4-antistofftitreringen, ved å plassere NK-celler mellom CD3-negative og CD3-positive populasjoner. For å begynne denne to-fluorokrom, syv-markør gating strategi, velg lymfocytt gate, og lage en prikk plot med en av de to fluorokromene som brukes i denne protokollen på hver akse.Gate på CD8-positive T-celler identifisert som CD3 og CD8 doble positive celler øverst til høyre i prikkplottet. Utelat dim CD8-populasjonen som kan inneholde NKT-celler. Gate på CD4-positive T-celler identifisert som befolkningen mellom CD8-positive T-celler og CD3 enkelt positive populasjoner.Gate på gamma delta T-celler identifisert som høye CD3-celler. Del gamma delta T-celler til CD8-positive og CD8-negative. Gate på NK celler identifisert som befolkningen mellom CD3-positive og CD3-negative celler.Del NK-cellene til CD8-positive og CD8-negative. Gate på B-celler identifisert som CD3-negativ, CD19-positiv befolkning nederst til høyre i prikkplottet. Velg monocyttporten, og opprett en prikkplott med en av de to fluorokromene som brukes i denne protokollen på hver akse.Gate på CD3-negativ, CD14-positiv befolkning. Ved hjelp av denne strategien ble lymfocytter fra en pasient med myelomatose inngjerdet på grunnlag av deres fremoverspøs og sidespøs og deres strømningscytokometriske profil. CD8-positive minneunderpopulasjoner og naive T-celler ble identifisert ved uttrykk for CD45RA og CCR7.Uttrykk for HLA-DR og CD57 ble brukt til å studere T-celleaktivering i CD8-positive naive, minne, sentralt minne, effektorminne og effektellerminne CD45RA-positive celler. På samme måte ble CD4-positive naive og minne T-celler identifisert. Innenfor minnepopulasjonen ble CCR4 og CCR6 brukt til å identifisere T-hjelpeunderpopulasjoner i CD4-positive T-celler.Underpopulasjoner av NK-celler var preget av CD16 og CD57-uttrykk. Denne strategien ble brukt til å undersøke dynamikken i immunpopulasjoner av langsgående prøver fra en donor med myelomatose som fikk stamcelletransplantasjon. Karakterisering av CD8- og CD4-underpopulasjoner over tid viste en vedvarende CD4-positiv og CD8-positiv T-celleaktivering og en skjevhet av T-hjelper til en T-helper-one fenotype.Men på dag 60 økte prosentandelen av B-celler dramatisk, og spådde pasientens tilbakefall. Riktig celleforberedelse og antistofftitrering er kritiske skritt for å oppnå pålitelige resultater ved hjelp av denne teknikken. Antistoff rettet mot andre markører kan legges til for å oppnå dypere flytcytometrianalyse og for å skape modulære strømningscytometriske paneler rettet mot flere avstamninger samtidig.Lignende tilnærminger som tar sikte på å utvide antall registrerte markører kan også utvikles ved hjelp av ulike sett med markør eller for bruk i ulike dyremodeller. Ikke glem at natriumazid kan forårsake brannskader i hud og øyne. Derfor bør en laboratoriefrakk, vernebriller og hansker alltid brukes når du håndterer dette reagenset.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...