Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de artrite e doenças de pele e osteomuscular < https://www.niams.nih.gov/>, prêmio número P30-AR053503; A Fundação Stabler, www.stablerfoundation.org; Nacionais Instituto de alergia e doenças infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irlanda programa para saúde de pulmão (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Todos os estudos de materiais humanos foram aprovados pela Johns Hopkins institucional Review Board sob o Health Insurance Portability and Accountability Act. Amostras do paciente e controle foram de identificados. PBMC e sangue de controles saudáveis foram obtidos pelo consentimento informado.
Nota: Este protocolo foi testado em fresco ou congelado isoladas células de sangue periféricas e sangue total.
1. preparação da pilha
<ol><li>
<strong...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. 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H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

O protocolo apresentado aqui tem demonstrado ser bastante flexível e insensível às mudanças de coloração, o amortecedor, a temperatura e a preparação de células do sangue periférico, devido a alta expressão de marcadores de linhagem na superfície das células. O passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos é a titulação de anticorpos. Digno de nota, desde que a titulação de anticorpos deve sempre ser executada durante a instalação de um painel de fluxo cytomet...

Citometria de fluxo é uma técnica que foi desenvolvida para analisar vários parâmetros em partículas simples a uma taxa de vários milhares de eventos por segundo1. Exemplos de espécimes analisados por citometria de fluxo incluem, mas não estão limitados a, células, miçangas, bactérias, vesículas e cromossomos. Um sistema fluídico direciona as partículas no ponto de interrogação, onde cada partícula cruza seu caminho com lasers de um ou mais, e vários parâmetros são gravados para posterior análise. Espalha para a frente e lateral, gerada pela dispersão da luz do laser puro, é usadas para identificar a população-alvo e recuperar informações sobre o tamanho relativo e a complexidade interna/granularidade de partículas, respectivamente. Todos os outros parâmetros, que representam a maioria dos dados em uma análise do fluxo cytometric, são derivados pelo fluorocromo-rotulado de sondas que reconhecem e ligam para alvos específicos das partículas de interesse.
Citometria de fluxo é uma principal ferramenta para estudos imunológicos identificar e caracterizar as populações de células. Para dissecar a complexidade do sistema imunológico, multicoloridos painéis estão constantemente evoluindo para ampliar o número de marcadores simultaneamente gravada para immunophenotyping profunda da célula populações1. Isso está levando ao desenvolvimento de instrumentos mais capazes e fluorochromes, com recentes citômetros high-end, excedendo 20 parâmetros fluorescentes. Isso resulta em projeto de estudo complexo devido à sobreposição espectral fluorocromo e em custos mais elevados associados com operadores qualificados e rotulagem de anticorpo personalizado. Em vários casos, complexidade e os custos são reduzidos usando painéis separados de marcadores para populações de células diferentes. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a erros, reduz as informações em cada painel e pode ser difícil de aplicar a amostras com um número limitado de células. Além disso, aumentar o número de marcadores impede profunda immunophenotyping em instrumentos com menos parâmetros fluorescentes. Anteriormente desenvolvemos um protocolo de coloração para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas duas fluorochromes em vez dos sete necessário usando o tradicional "um fluorocromo-um marcador" abordagem (www.hcdm.org)2,3. Nosso relatório inicial explorado e validado a noção da combinação de sete marcadores em dois fluorochromes para immunophenotyping profundo. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo passo a passo para isolar e manchar as células do sangue periféricas, enfocando o aspecto prático e solução de problemas etapas para alcançar uma coloração bem sucedida.
Este protocolo é baseado na observação de que os marcadores de linhagem tem uma expressão constante na superfície das células e que cada população de células tem uma exclusiva combinação de marcadores de linhagem. Em PBMC, CD3 expressão subdivide as células imunes em duas categorias principais: linfócitos T CD3 positivo e células CD3-negativo. Dentro do subgrupo positivo CD3, CD4+, CD8+ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente. Em uma abordagem padrão um fluorocromo-um marcador, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e - TCR γδ anticorpos são detectados com sete diferentes fluorochromes. Nossa abordagem combina anti-CD3 - CD56 e anticorpos de - TCR γδ em um fluorocromo (rotulada para fluorocromo conveniência A) e anti-CD4,-CD8, - CD14 e - CD19 anticorpos em um fluorocromo diferente (fluorocromo B). Isto é possível por uma combinação de titulação de anticorpos e expressão diferencial do antígeno. Ambos os CD4+ e CD8+ T células são positivas para o anticorpo anti-CD3 em fluocromo A, mas eles podem ser separados em fluorocromo B maximizar a expressão do sinal CD8 ao colocar, com uma titulação ad hoc, o sinal de CD4 entre o CD8 e as células de CD3 positivo-CD4/CD8 dupla negativa. As pilhas de T do γδ expressa o nível superior de CD3 CD4 e CD8, e, portanto, eles podem ser identificados como CD3 alta4. Este sinal é ainda mais impulsionado pela rotulagem γδ células T em fluocromo A com um anticorpos anti-TCR γδ, melhorando assim, a separação entre as pilhas de T CD3 baixas e as células de alta γδ T CD3. As células B podem ser identificadas como CD3– no fluocromo A e CD19+ em fluorocromo B. Para separar pilhas NK CD3 negativas de células B, um anticorpo anti-CD56 foi usado em fluocromo A como o anti-CD3. Isso é possível porque o CD56 expressa na célula NK em um nível muito inferior CD3 na T células5. Finalmente, os monócitos podem ser identificados através de uma combinação de propriedades de dispersão de lado para a frente e expressão de CD14 em fluorocromo B.
A ideia de combinar até quatro marcadores usando dois fluorochromes tem sido tentada já com êxito antes de7,6,8e tem sido usada em um protocolo clínico para identificar populações linfocítica malignas9 . Um relatório anterior combinada também sete marcadores (com diferente especificidade dos marcadores do que usamos em nosso protocolo) usar dois fluorochromes, mas esta abordagem baseou-se em um complexo de rotulagem de cada anticorpo com quantidade variável de fluorocromo10. Isto está em contraste com o nosso método que utiliza anticorpos comercialmente disponíveis e pode ser adaptado para a configuração do instrumento e pode tirar proveito da nova geração de fluorochromes de polímero.
O objetivo geral desta metodologia é expandir os limites ópticos da maioria dos citômetros, permitindo a gravação de cinco marcadores adicionais para interrogar populações de células complexas. Como consequência, avançado análise imunológica pode ser realizada em 6-10 acessível fluorocromo citômetros, e instrumentos de campo 2-3 fluorocromo podem alcançar resultados notáveis em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda e criar modular fluxo cytometric painéis como alvo várias linhagens no mesmo tempo11. Potencialmente, isso pode reduzir o número de painéis utilizados em citometria de fluxo immunophenotyping modular e reduzir custos, erros e tempo de manuseio. Essa abordagem também é muito bem adequada no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Caracterização de células imunes depende fortemente de citometria de fluxo multicolor para identificar subpopulações baseadas na expressão diferencial de marcadores de superfície. A instalação de um painel multicolor clássico exige instrumentos high-end, anticorpos etiquetados personalizados e cuidadoso estudo design para minimizar a sobreposição espectral. Desenvolvemos uma análise Multiparamétrico para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) no sangue periférico pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas dois fluorochromes. Nossa estratégia é baseada na observação de que marcadores de linhagem constantemente são expressos em uma combinação única de cada população de células. Combinar essas informações com uma titulação cuidadosa dos anticorpos permite que os investigadores gravar cinco marcadores adicionais, ampliando o limite óptico da maioria dos citômetros. Head-to-comparação demonstrou que a grande maioria das populações de células imunes no sangue periférico pode ser caracterizada com precisão comparável entre nosso método e a clássico "abordagem um fluorocromo-um marcador", embora este último ainda é mais precisos para a identificação de populações, tais como células NKT e γδ T células. Combinar sete marcadores usando dois fluorochromes permite a análise de populações de células imunes complexos e amostras clínicas em 6-10 acessível fluorocromo citômetros e até mesmo em instrumentos de campo 2-3 fluorocromo em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda. Essa abordagem também é muito bem adequada para a seleção de várias populações de células, no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.

Configuração e análise de um experimento de citometria de fluxo das células do sangue periféricos humanos manchado com sete marcadores de linhagem (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e TCR - anticorpos γδ) usando apenas dois fluorochromes são apresentados.
Resultados representativos são descritos para anti-CD8 e - titulação de anticorpos CD56. Para cada anticorpo (neste exemplo, anti-CD8), dados de dez diluições ...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

O objetivo geral dessa metodologia é expandir-se além do limite óptico da maioria dos citómetros de fluxo, permitindo que um pesquisador grave cinco marcadores adicionais para interrogar populações celulares complexas. Usando essa técnica, é possível alcançar um imunofenofoteping profundo ao trabalhar com instrumento com um baixo número de detectores ou amostra com número limitado de células. Inicie este procedimento transferindo cuidadosamente o sangue extraído para um tubo cônico de 50 mililitros.Diluir o sangue com uma quantidade igual de PBS sem cálcio e magnésio. Adicione 15 mililitros de gradiente de densidade ao fundo de um novo tubo cônico de 50 mililitros. Sobreponha cuidadosamente o sangue diluído em cima do meio gradiente de densidade, evitando qualquer mistura entre o gradiente de densidade médio e sangue diluído.Centrifugar a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem freio para evitar a interrupção da interface. Após a centrifugação, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente e descartar a camada superior, prestando atenção para não remover células na interface entre o meio de plasma e gradiente de densidade. Colete o maior número de células mononucleares de sangue periféricos, ou PBMCs, o mais possível da interface sem tocar na pelota de célula vermelha na parte inferior do tubo cônico de 50 mililitros, e transfira para um novo tubo.Adicione PBS para trazer o volume final para 25 mililitros, e inverta várias vezes para misturar. Em seguida, lave os PBMCs duas vezes como indicado no texto. Depois de remover as plaquetas e contar os PBMCs como descrito no texto, resuspensar as células em PBS, 0,1% de azida de sódio a uma concentração de uma vez 10 a 7 células por mililitro.Para preparar os PBMCs para coloração, transfira 100 microliters de cada amostra para uma placa de fundo V de 96 poços. Centrifugar a placa a 350 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular.Para cada poço, adicione 100 microliters de PBS contendo um corante vivo/morto fixável que reage com amina livre em proteínas, e resuspense a mistura PBMC cuidadosamente. Posteriormente, deixe a placa descansar por 10 minutos à temperatura ambiente para rotular células mortas. Para cada amostra, prepare 30 microliters de uma mistura contendo todos os sete anticorpos.Nesta fase, anticorpos titulados contra diferentes moléculas-alvo e em diferentes fluorocromões também podem ser adicionados. Centrifugar a placa de 96 poços a 350 vezes g por três minutos à temperatura ambiente, e aspirar cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular. Adicione o coquetel de anticorpos a cada poço, e resuspense cuidadosamente sem gerar bolhas.Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após 30 minutos, adicione 150 microliters de tampão de coloração a cada poço, e centrifufique a placa a 350 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular, e resuspenja as células em 200 microliters de PBS.As células estão prontas para análise de citometria de fluxo. Anticorpos delta gama de CD3, CD8, CD14, CD19 e TCR são titulados com uma curva máxima de índice de coloração. A titulação de anticorpos é o passo mais crítico neste protocolo para identificar adequadamente sete subconjuntos de células imunes usando dois fluorochromes.Para preparar uma diluição de anticorpos duas vezes, encha 10 poços de uma placa de 96 poços com 40 microliters de tampão de coloração por poço. Para os propósitos deste vídeo, apenas a titulação de anti-CD8 será mostrada. No primeiro poço, aumente o volume final para 80 microliters de tampão de coloração, e adicione anti-CD8 em uma concentração quatro vezes maior do que a concentração sugerida pelo fabricante.Misture bem e transfira 40 microliters para o segundo poço. Misture bem e repita este passo para todos os outros poços. Colora 10 amostras de PBMCs ou sangue inteiro com 30 microlitres das 10 diluições duplas diferentes de anti-CD8 seguindo o protocolo demonstrado anteriormente.Adquira dados com um citômetro de fluxo e plote o sinal de cada diluição. Após calcular o índice de manchas para cada concentração de anticorpos conforme detalhado no texto, plote o índice de manchas versus a concentração de anticorpos expresso como uma fração da diluição do anticorpo e identifique a concentração de anticorpos com o valor máximo do índice de mancha. Para titular os anticorpos anti-CD4 e anti-CD56, comece com a estratégia de diluição duas vezes demonstrada anteriormente, adicionando concentrações adicionais entre para identificar finamente a faixa de concentração que permitirá a separação de células T CD4 positivas e células NK das outras populações celulares.Titule o anticorpo anti-CD4 colocando o sinal anti-CD4 entre o sinal cd8 positivo duplo, CD3 positivo e a população single positive CD3. Titule o anticorpo anti-CD56 seguindo uma estratégia semelhante à titulação de anticorpos anti-CD4, colocando células NK entre as populações CD3-negativas e as CD3-positivas. Para iniciar esta estratégia de gliça de dois fluorocromáticos, de sete marcadores, selecione o portão de linfócitos e crie um gráfico de pontos com um dos dois fluorocromes usados neste protocolo em cada eixo.Portão em células T CD8 positivos identificados como células CD3 e CD8 dupla positiva no canto superior direito do gráfico de pontos. Exclua a população dim CD8 que pode conter células NKT. Portão em células T CD4 positivos identificados como a população entre células T CD8 positivos e as populações single positivas CD3.Portão em células Gamma delta T identificados como células CD3 altas. Subdividir células Gamma delta T para CD8 positivo e CD8 negativo. Portão em células NK identificadas como a população entre células CD3 positivo e CD3-negativo.Subdividir as células NK para CD8 positivo e CD8 negativo. Portão em células B identificado como a população CD3-negativo, CD19-positivo no canto inferior direito do gráfico de pontos. Selecione o portão de monócito e crie um gráfico de pontos com um dos dois fluorochromes usados neste protocolo em cada eixo.Portão na população CD3-negativa, CD14-positivo. Utilizando essa estratégia, linfócitos de um paciente com mieloma múltiplo foram fechados com base em sua dispersão dianteira e dispersão lateral e seu perfil citométrico de fluxo. Subpopulações de memória CD8 positivas e células T ingênuas foram identificadas pela expressão de CD45RA e CCR7.A expressão de HLA-DR e CD57 foi usada para estudar a ativação de células T em células ingênuas cd8-positivas, memória, memória central, memória effectora e células CD45RA-positive. Da mesma forma, foram identificadas células T ingênuas e de memória nD4 positivas. Dentro da população de memória, CCR4 e CCR6 foram utilizados para identificar subpopulações de auxiliares T em células T CD4 positivas.As subpopulações das células NK foram caracterizadas pela expressão CD16 e CD57. Essa estratégia foi utilizada para investigar a dinâmica em populações imunes de amostras longitudinais de um doador com mieloma múltiplo recebendo um transplante de células-tronco. A caracterização das subpopulações CD8 e CD4 ao longo do tempo mostrou uma ativação sustentada de células T CD4-positivas e CD8 e uma distorção do auxiliar T para um fenótipo T-helper-one.Mas no dia 60, a porcentagem de células B aumentou drasticamente, prevendo a recaída do paciente. A preparação adequada das células e a titulação de anticorpos são passos críticos para alcançar resultados confiáveis usando essa técnica. O anticorpo direcionado a outros marcadores pode ser adicionado para realizar uma análise mais profunda da citometria de fluxo e criar painéis citométricos de fluxo modular visando várias linhagens ao mesmo tempo.Abordagens semelhantes destinadas a expandir o número de marcadores graváveis também poderiam ser desenvolvidas usando diferentes conjuntos de marcadores ou para uso em diferentes modelos animais. Não se esqueça que a azida de sódio pode causar queimaduras na pele e nos olhos. Portanto, um jaleco, óculos de proteção e luvas devem ser sempre usados ao manusear este reagente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...