Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Это исследование было поддержано национального института артрита и Musculoskeletal и кожных заболеваний, < https://www.niams.nih.gov/>, премия номер P30-AR053503; Стейблер фонд, www.stablerfoundation.org; Национальный институт аллергии и инфекционных болезней, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Нина Ирландии программа для здоровья легких (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Все исследования человека материалов были утверждены Джонса Хопкинса институциональных Наблюдательный Совет под медицинское страхование портативности и акт об ответственности. Пациента и управления образцы были обезличенных. Получения и кровь от здоровых элементов были получены п?...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Протокола, представленные здесь было показано, быть достаточно гибкими и нечувствительным к изменениям в окрашивание буфер, температуры и подготовка клеток периферической крови из-за высокой выражение lineage маркеров на поверхности клеток. Наиболее важным этапом для получения высокого...

Проточной цитометрии — это метод, который был разработан для анализа нескольких параметров на одной частицы со скоростью несколько тысяч событий на втором1. Примеры образцов анализируемой проточной цитометрии включают, но не ограничиваются, клетки, бусы, бактерии, везикул и хромосом. Аэрогидродинамических системы направляет частиц на допрос точки, где каждая частица пересекает пути с одним или несколькими лазерами, и несколько параметров записаны для дальнейшего анализа. Вперед и боковых рассеивается, порожденных рассеяния чисто лазерного света, используются для выявления целевых групп населения и извлечения сведений о относительный размер и внутренней сложности/гранулярности частиц, соответственно. Все остальные параметры, которые составляют большую часть данных в анализе гранулярных потока, являются производными от флюрохром меченых зондами, которые узнают и связывают для конкретных целей на частицы интерес.
Проточной цитометрии является основным инструментом для иммунологических исследований для выявления и характеристики популяции клеток. Для того чтобы рассечь сложности иммунной системы, многоцветные панели постоянно совершенствуются расширить количество маркеров одновременно записан для глубоких Иммунофенотипирование клеток населения1. Это приводит к развитию более способными инструментов и флуорохромов, с недавних high-end потока цитофлуориметрами, превышающий 20 люминесцентных параметров. Это приводит в сложные исследования дизайн благодаря флюрохром спектрального наложения и более высокие расходы, связанные с пользовательских антитела маркировки и квалифицированных операторов. В ряде случаев сложность и затраты снижаются с помощью отдельных панелей маркеров для различных клеточных популяций. Этот подход, однако, является ошибка склонными, уменьшает информация в каждой панели и может быть трудно применять образцы с ограниченное количество клеток. Кроме того увеличивая количество маркеров не исключает глубокую Иммунофенотипирование на инструментах с меньшим числом люминесцентных параметров. Ранее мы разработали окрашивание протокол для выявления основных человеческих популяций иммунной (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в мононуклеаров периферической крови (получения), объединив семь lineage маркеров с помощью только два флуорохромов вместо семи требуется, с помощью традиционных «один флюрохром один маркер» подход (www.hcdm.org)2,3. Наш первоначальный доклад изучены и проверены понятие объединения семи маркеров в двух флуорохромов для глубокой Иммунофенотипирование. В настоящем докладе мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции и выведение клеток периферической крови, сосредоточив внимание на практическом аспекте и устранение неисправностей шаги для достижения успешного пятнать.
Этот протокол основывается на том наблюдении, что lineage маркеров константное выражение на поверхности клетки и что каждой популяции клеток имеет исключительное сочетание lineage маркеров. В репликацию, CD3 выражение подразделяет иммунные клетки на две основные категории: CD3-положительных Т-лимфоцитов и клеток CD3-отрицательные. В рамках подгруппы позитивные CD3, CD4+, CD8+ и γδ T клетки могут быть разделены с помощью антител, ориентированные исключительно на CD4 и CD8 γδ рецептора. Подобным образом, в рамках подгруппы негативные CD3 B клетки, клетки и моноциты могли быть однозначно идентифицированы с помощью антител против CD19, CD56 и CD14, соответственно. В стандартный один маркер флюрохром один подход анти CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 и - TCR γδ антитела обнаруживаются с семи различных флуорохромов. Наш подход сочетает в себе анти CD3, - CD56 и - TCR γδ антител в одном флюрохром (с пометкой для удобства флюрохром A) и анти CD4,-CD8, - CD14 и - CD19 антител в различных флюрохром (флюрохром B). Это возможно сочетанием антитела титрования и дифференциального антигена выражения. Обе CD4+ и CD8+ T клетки являются позитивными на антитела анти CD3, в флюрохром A, но они могут быть разделены в флюрохром B максимальное выражение CD8 сигнала при размещении, с ad hoc титрования, CD4 сигнала между CD8 и CD3 двойное отрицание положительные CD4/CD8 клетки. Т-клетки γδ выражает высокий уровень CD3 чем CD4 и CD8, и поэтому они могут быть определены как CD3 высокой4. Этот сигнал далее повышено маркировки γδ Т-клеток в флюрохром A с анти TCR γδ антител, улучшая таким образом разделение между CD3 низкая Т-клетки и клетки высокой γδ T CD3. B клетки могут быть определены как CD3– в A флюрохром и CD19+ в флюрохром б. Чтобы отделить CD3 негативные НК-клетки из клетки B, антитела анти CD56 использовался в флюрохром А как анти CD3. Это возможно потому, что CD56 выразил на NK клеток на гораздо более низком уровне, чем CD3 T клетки5. Наконец моноциты могут быть определены через комбинацию вперед стороне разброс свойств и выражение CD14 в флюрохром б.
Идея объединения до четырех маркеров с помощью двух флуорохромов уже успешно предпринята до6,7,8и был использован в клинический протокол для выявления злокачественных лимфоцитарный населения9 . Предыдущий доклад также комбинированные семь маркеры (с различными специфика от маркеров чем мы использовали в наших протокол) с помощью двух флуорохромов, но этот подход опирался на комплекс маркировки каждого антитела с различным количеством флюрохром10. Это отличается наш метод, который использует коммерчески доступных антител и может быть адаптирована к инструмент конфигурации и могут воспользоваться преимуществами нового поколения флуорохромов полимера.
Общая цель этой методологии является расширение оптических пределы большинства потока цитофлуориметрами, позволяя для записи пяти дополнительных маркеров допросить комплекс клеточных популяций. Как следствие расширенный Иммунологический анализ может быть выполнена на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10, и 2-3 флюрохром области инструментов можно добиться замечательных результатов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ цитометрия потоков и для создания модульной потока гранулярных панели ориентации несколько линий на же время11. Это потенциально может уменьшить количество панелей, используемых в модульных Иммунофенотипирование проточной цитометрии и снизить затраты, ошибки и время обработки. Этот подход также очень хорошо подходит в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Характеристика иммунных клеток сильно полагается на многоцветный проточной цитометрии для выявления субпопуляции, на основе дифференциальных выражения поверхностных маркеров. Настройки классической многоцветные панели требует мощных инструментов, пользовательские обозначенные антитела и тщательного изучения дизайна для сведения к минимуму спектрального наложения. Мы разработали многопараметрических анализ для выявления основных человеческих популяций иммунных (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в периферической крови, объединив семь lineage маркеров, используя только два флуорохромов. Наша стратегия основывается на том наблюдении, что lineage маркеров постоянно выражаются в уникальное сочетание каждой популяции клеток. Сочетая эту информацию с тщательного титрования антител позволяет следователям для записи пять дополнительных маркеров, расширение оптических предел большинства потока цитофлуориметрами. Голова к голове сравнения показали, что подавляющее большинство населения иммунных клеток в периферической крови можно охарактеризовать с сопоставимой точности между нашего метода и классические «один маркер флюрохром один подход», хотя последняя все еще более точные для выявления групп населения, таких как NKT клетки и клетки γδ T. Сочетая семь маркеры с помощью двух флуорохромов позволяет для анализа сложных иммунных клеток населения и клинических образцов на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10 и даже на 2-3 флюрохром области инструментов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ потока цитометрии. Этот подход также очень хорошо подходит для проверки несколько клеточных популяций в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.

Настройка и анализ потока цитометрии эксперимента человеческих клеток периферической крови окрашивали семь lineage маркеров (анти CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 и - TCR γδ антитела) с использованием только двух флуорохромов представлены.
Представите...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Здесь мы представляем гранулярных протокол потока для определения CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки, клетки и моноцитов в периферической крови человека с помощью только двух флуорохромов вместо семи. С этим подходом пять дополнительных маркеров могут быть записаны на большинстве цитофлуориметрами потока.

Дискриминации в семи подмножеств иммунных клеток, два флюрохром проточная цитометрия

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Общая цель этой методологии состоит в том, чтобы выйти за пределы оптического предела большинства цитометров потока, позволяя исследователю записывать пять дополнительных маркеров для опроса сложных популяций клеток. Используя этот метод, можно достичь глубокого иммунофенотипинга при работе с прибором с низким количеством детекторов или образца с ограниченным количеством клеток. Начните эту процедуру с тщательной передачи втянутой крови в 50-миллилитровую коническую трубку.Разбавить кровь равным количеством PBS без кальция и магния. Добавьте 15 миллилитров градиентной среды плотности на дно новой 50-миллилитровой конической трубки. Тщательно наложить разбавленную кровь на верхней части плотности градиента среды, избегая любого смешивания между плотностью градиента среды и разбавленной крови.Центрифуга при 400 раз г в течение 30 минут при комнатной температуре без тормоза, чтобы избежать нарушения интерфейса. После центрифугации используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать и отбросить верхний слой, обращая внимание на то, чтобы не удалять клетки на стыке плазмы и градиентной среды плотности. Соберите как можно больше периферических моноядерных клеток крови, или PBMCs, как это возможно из интерфейса, не касаясь гранул красных клеток в нижней части 50-миллилитровой конической трубки, и перейти к новой трубке.Добавить PBS довести окончательный объем до 25 миллилитров, и инвертировать несколько раз, чтобы смешать. Затем вымойте ПМГ в два раза, как указано в тексте. После удаления тромбоцитов и подсчета ПБМТ, как описано в тексте, повторное распределение клеток в PBS, 0,1% азида натрия до концентрации от 1 раза от 10 до седьмого клетки на миллилитр.Для подготовки ПХМГ к окрашиваниям перенесите 100 микролитров каждого образца на пластину v-bottom на 96 хорошо. Центрифуга пластины при 350 раз г в течение трех минут при комнатной температуре. Тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки.К каждому хорошо, добавить 100 микролитров PBS, содержащих живые / мертвые фиксации красителя, который реагирует со свободным амином на белки, и повторно использовать смесь PBMC тщательно. Впоследствии, позвольте пластине сидеть в течение 10 минут при комнатной температуре для маркировки мертвых клеток. Для каждого образца приготовьте 30 микролитров смеси, содержащей все семь антител.На этом этапе, титровали антитела против различных молекул-мишеней и в различных фторхромов могут быть добавлены также. Центрифуга 96-хорошо пластины в 350 раз г в течение трех минут при комнатной температуре, и тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки. Добавить антитела коктейль к каждому хорошо, и повторно тщательно, не генерируя пузырьки.Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Через 30 минут добавьте по 150 микролитров буфера окрашивания к каждой колодец и центрифугайте пластину при 350 г в течение трех минут при комнатной температуре. Тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки, и повторного перерасхода клеток в 200 микролитров PBS.Клетки теперь готовы к анализу цитометрии потока. Анти-CD3, CD8, CD14, CD19 и TCR гамма-дельта антитела titrated с максимальной кривой индекса окрашивания. Титрование антител является наиболее важным шагом в этом протоколе, чтобы правильно определить семь подмножество иммунных клеток с помощью двух фторхромов.Чтобы подготовить двухкратное разбавление антител, заполните 10 скважин пластины 96 скважин с 40 микролитров окрашивания буфера на скважину. Для целей этого видео, только название анти-CD8 будет показано. В первой хорошо, увеличить конечный объем до 80 микролитров окрашивания буфера, и добавить анти-CD8 в концентрации в четыре раза концентрации, предложенной производителем.Хорошо перемешайте и перенесите 40 микролитров на вторую колодец. Хорошо перемешать и повторить этот шаг для всех других скважин. Пятно 10 образцов ПБМТ или цельной крови с 30 микролитров из 10 различных двукратных разбавления анти-CD8 после протокола, продемонстрированого ранее.Приобретайте данные с помощью цитометра потока и навеяйте сигнал от каждого разбавления. После расчета индекса пятен для каждой концентрации антител, как описано в тексте, участок пятно индекс по сравнению с концентрацией антитела выражается как доля разбавления антитела, и определить концентрацию антитела с максимальным значением индекса пятна. Чтобы титровать анти-CD4 и анти-CD56 антитела, начните с двухкратной стратегии разбавления продемонстрировали ранее, добавив дополнительные концентрации между ними, чтобы тонко определить диапазон концентрации, что позволит отделение CD4-положительных Т-клеток и НК-клеток от других популяций клеток.Титрат анти-CD4 антитела, поставив анти-CD4 сигнал между двойной CD8-положительный, CD3-положительный сигнал и CD3 одной положительной популяции. Титрат анти-CD56 антитела следующие стратегии, аналогичные анти-CD4 антитела titration, путем размещения НК-клеток между CD3-отрицательных и CD3-положительных популяций. Чтобы начать эту двухфлорохромную стратегию 7-маркерного гатинга, выберите ворота лимфоцитов и создайте точечный участок с одним из двух фторхромов, используемых в этом протоколе на каждой оси.Ворота на CD8-положительных Т-клеток, идентифицированных как CD3 и CD8 двойные положительные клетки в правом верхнем углу участка точки. Исключите тусклаю популяцию CD8, которая может содержать клетки NKT. Ворота на CD4-положительных Т-клеток определены как население между CD8-положительных Т-клеток и CD3 одной положительной популяции.Ворота на гамма-дельта Т-клеток определены как высокие клетки CD3. Субдивид гамма-дельта Т-клеток на CD8 положительные и CD8 отрицательные. Ворота на НК-ячейках, идентифицированных как популяция между CD3-положительными и CD3-отрицательными ячейками.Подраздеть клетки НК на CD8 положительные и CD8 отрицательные. Ворота на B-ячейках, идентифицированных как CD3-отрицательная, CD19-положительная популяция в правом нижнем углу точечного участка. Выберите ворота моноцитов и создайте точечный участок с одним из двух фторхромов, используемых в этом протоколе на каждой оси.Ворота на CD3-негативное, CD14-позитивное население. Используя эту стратегию, лимфоциты у пациента с множественной миеломой были закрыты на основе их вперед рассеяния и бокового рассеяния и их цитометрического профиля потока. CD8-положительные субпопуляции памяти и наивные Т-клетки были определены по выражению CD45RA и CCR7.Выражение HLA-DR и CD57 было использовано для изучения активации Т-клеток в CD8-положительной наивности, памяти, центральной памяти, памяти эффектора и эффекторной памяти CD45RA-положительных клеток. Аналогичным образом были выявлены CD4-положительные наивные и Т-клетки памяти. В популяции памяти, CCR4 и CCR6 были использованы для выявления T помощник субпопуляции в CD4-положительных Т-клеток.Субпопуляции НК-клеток характеризовались выражением CD16 и CD57. Эта стратегия была использована для исследования динамики в иммунных популяциях продольных образцов от донора с множественной миеломой, получающим трансплантацию стволовых клеток. Характеристика субпопуляций CD8 и CD4 с течением времени показала устойчивую CD4-положительную и CD8-положительную активацию Т-клеток и перекос T-помощника в фенотип T-helper-one.Но в день 60, процент В-клеток резко увеличилось, предсказывая рецидив пациента. Правильная подготовка клеток и титрование антител являются критическими шагами для достижения надежных результатов с помощью этого метода. Антитела, нацеленные на другие маркеры, могут быть добавлены для выполнения более глубокого анализа цитометрии потока и создания модульных цитометрических панелей потока, нацеленных на несколько линий одновременно.Аналогичные подходы, направленные на расширение числа рекордных маркеров, могут быть также разработаны с использованием различных наборов маркеров или для использования в различных моделях животных. Не забывайте, что азид натрия может вызвать ожоги кожи и глаз. Поэтому при обращении с этим реагентом всегда следует носить лабораторное пальто, защитные очки и перчатки.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...