Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel, < https://www.niams.nih.gov/>, Premio número P30-AR053503; La Fundación más estable, www.stablerfoundation.org; Nacional Instituto de alergias y enfermedades infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Programa de Irlanda de Nina para la salud pulmonar (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Todos los estudios de materiales humanos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Johns Hopkins bajo la Health Insurance Portability y Accountability Act. Muestras de paciente y control fueron anónima. PBMCs y sangre de controles sanos se obtuvieron mediante consentimiento informado.
Nota: Este protocolo ha sido probado en recién o congeladas aisladas células de sangre periféricas y sangre entera.
1. preparación de la célula</...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

El protocolo presentado aquí se ha demostrado para ser bastante flexible e insensible a los cambios en la coloración de tampón, la temperatura y la preparación de células de sangre periférica debido a la alta expresión de marcadores de linaje en la superficie celular. El paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad, es la titulación de anticuerpos. De la nota, ya que la titulación de anticuerpos debe realizarse siempre durante la instalación de un panel de citometría de flujo, este pas...

Citometría de flujo es una técnica que fue desarrollada para analizar varios parámetros en solas partículas a una velocidad de varios miles de sucesos por segundo1. Ejemplos de muestras analizadas por citometría de flujo incluyen, pero no se limitan a, las células, los granos, bacterias, vesículas y cromosomas. Un sistema fluídico dirige las partículas en el punto de interrogación donde cada partícula cruza su camino con uno o más láseres, y varios parámetros son grabados para su posterior análisis. Scatter delantero y lateral, generado por la dispersión de la luz láser puro, se utiliza para identificar la población objetivo y recuperar información sobre el tamaño relativo y la complejidad interna/granularidad de las partículas, respectivamente. Todos los otros parámetros, que representan la mayor parte de los datos en un análisis de citometría de flujo, se derivan por sondas marcadas con el fluorocromo que reconocen y se unen a objetivos específicos en las partículas de interés.
Citometría de flujo es una herramienta primaria para estudios inmunológicos identificar y caracterizar poblaciones celulares. Para diseccionar la complejidad del sistema inmune, paneles multicoloras evolucionan constantemente para ampliar el número de marcadores simultáneamente grabada para profunda Inmunofenotipificación de poblaciones de células1. Esto conduce al desarrollo de los instrumentos más capaces y fluorocromos, con citómetros de flujo gama alta reciente superior a 20 parámetros fluorescentes. El resultado en el diseño de estudio complejo debido a la superposición espectral fluorocromo y en costes más altos asociados con encargo anticuerpo etiquetado y calificados operadores. En varios casos, complejidad y los costes se reducen mediante el uso de distintos paneles de marcadores de diferentes poblaciones celulares. Este enfoque, sin embargo, es propenso a errores, reduce la información en cada panel y puede ser difícil de aplicar a las muestras con número limitado de células. Por otra parte, aumentar el número de marcadores excluye immunophenotyping profunda en los instrumentos con menos parámetros fluorescentes. Previamente hemos desarrollado un protocolo de tinción para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la combinación de siete marcadores de linaje mediante sólo dos fluorocromos en lugar de los siete necesarios usando el tradicional "un marcador fluorocromo y un" enfoque (www.hcdm.org)2,3. Nuestro informe inicial había explorado y había validado la noción de combinar siete marcadores de dos fluorocromos de immunophenotyping profundo. En este informe, presentamos un protocolo paso a paso para aislar y la tinción de células sanguíneas periféricas, centrándose en el aspecto práctico y solución de problemas de pasos para lograr una acertada coloración.
Este protocolo se basa en la observación que marcadores de linaje tienen una expresión constante en la superficie celular y que cada población celular tiene una exclusiva combinación de marcadores de linaje. En PBMCs, expresión de CD3 subdivide las células inmunes en dos categorías principales: los linfocitos T CD3-positive y células CD3 negativas. Dentro del subgrupo positivo de CD3, CD4+, CD8+ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente. En un enfoque de un fluorocromo marcador uno estándar, anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-CD19, CD56 y - TCR γδ los anticuerpos se detectan con siete diferentes fluorocromos. Nuestro enfoque combina anti-CD3, CD56 y - TCR γδ anticuerpos en un fluorocromo (designada para el fluorocromo de conveniencia A) y anti-CD4,-CD8, CD14 y - CD19 anticuerpos en un fluorocromo diferente (fluorocromo B). Esto es posible por una combinación de valoración de anticuerpos y antígeno diferencial expresión. Ambos CD4+ y CD8+ T las células son positivas para el anticuerpo anti-CD3 en fluorocromo A, pero se pueden separar en fluorocromo B maximizar la expresión de la señal de CD8 colocando con una titulación especial, la señal de CD4 entre el CD8 y las células de CD3 positivo-CD4/CD8 dobles negativas. Las células de T del γδ expresa mayor nivel de CD3, CD4 y CD8, y por lo tanto pueden ser identificados como CD3 alto4. Esta señal es impulsada más por etiquetado γδ células de T en fluorocromo A con un anti-TCR γδ los anticuerpos, mejorando la separación entre células T baja de CD3 y células Tγδ alta T de CD3. Las células de B pueden identificarse como CD3– en el fluorocromo A y CD19+ en fluorocromo B. Para separar las células NK negativo CD3 de células B, fue utilizado un anticuerpo anti-CD56 en fluorocromo A como anti-CD3. Esto es posible porque expresa CD56 de células NK en un nivel mucho más bajo que el CD3 en células T5. Finalmente, los monocitos pueden ser identificados mediante una combinación de propiedades de dispersión hacia delante-lateral y expresión de CD14 en fluorocromo B.
La idea de combinar hasta cuatro marcadores con dos fluorocromos se ha intentado con éxito antes de6,7,8y se ha utilizado en un protocolo clínico para identificar poblaciones linfocíticas malignas9 . Un informe anterior también combinado siete marcadores (con diferente especificidad de los marcadores que utilizamos en nuestro protocolo) usando dos fluorocromos, pero ello dependía de un complejo etiquetado de cada anticuerpo con diferente cantidad de fluorocromo10. Esto está en contraste con el método que utiliza anticuerpos comercialmente disponibles y puede ser adaptado a la configuración del equipo y puede tomar ventaja de la nueva generación de fluorocromos de polímero.
El objetivo general de esta metodología es ampliar los límites ópticos de mayoría citómetros de flujo, permitiendo la grabación de cinco marcadores adicionales para interrogar a las poblaciones de la célula compleja. Como consecuencia, análisis inmunológicos avanzado pueden realizarse en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 y 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo pueden lograr resultados notables en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo y crear flujo modular cytometric paneles dirigidos a varios linajes en el mismo tiempo11. Esto puede potencialmente reducir el número de paneles utilizados en citometría de flujo immunophenotyping modular y reducir los costos, errores y tiempo de manipulación. Este enfoque es también muy adecuado en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Caracterización de células inmunitarias se basa pesadamente multicolor por citometría de flujo para identificar subpoblaciones basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie. Instalación de un panel multicolor clásico requiere instrumentos High-End, anticuerpos etiquetados personalizados y cuidadoso estudio diseño para minimizar la superposición espectral. Hemos desarrollado un análisis multiparamétrico para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en sangre periférica mediante la combinación de siete marcadores de linaje utilizando sólo dos fluorocromos. Nuestra estrategia se basa en la observación que los marcadores de linaje se expresan constantemente en una combinación única por cada población celular. Combinando esta información con una cuidadosa titulación de los anticuerpos permite a los investigadores grabar cinco marcadores adicionales, ampliando el límite óptico de la mayoría los citómetros de flujo. Comparación directa demostró que la gran mayoría de las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica puede ser caracterizada con precisión comparable entre nuestro método y el "un marcador fluorocromo y un enfoque clásico", aunque este último sigue siendo más precisos para la identificación de las poblaciones, como las células NKT y células de T del γδ. La combinación de siete marcadores con dos fluorocromos permite el análisis de poblaciones celulares inmunes complejos y muestras clínicas en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 e incluso en 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo. Este enfoque es también muy adecuado para la detección de varias poblaciones de la célula en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

Configuración y análisis de un experimento de citometría de flujo de células humanas de sangre periféricas teñidas con siete marcadores de linaje (anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-anticuerpos de CD19, CD56 y - TCR γδ) usando sólo dos fluorocromos se presentan.
Se describen resultados representativos para anti-CD8 y - CD56 titulación de anticuerpos. Para cada anticuerpo (en este ejemplo, anti-CD8), se registraron datos de diez ...

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Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

El objetivo general de esta metodología es expandirse más allá del límite óptico de la mayoría de los citometros de flujo al permitir que un investigador registre cinco marcadores adicionales para interrogar poblaciones celulares complejas. Utilizando esta técnica, es posible lograr un inmunofenotipado profundo cuando se trabaja con instrumento con un bajo número de detectores o muestra con un número limitado de células. Comience este procedimiento transfiriendo cuidadosamente la sangre extraída a un tubo cónico de 50 mililitros.Diluir la sangre con la misma cantidad de PBS sin calcio y magnesio. Agregue 15 mililitros de medio de gradiente de densidad al fondo de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Superponga cuidadosamente la sangre diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad, evitando cualquier mezcla entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida.Centrifugar a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno para evitar la interrupción de la interfaz. Después de la centrifugación, utilice una pipeta para aspirar y desechar cuidadosamente la capa superior, prestando atención a no eliminar las células en la interfaz entre el plasma y el medio de gradiente de densidad. Recoger tantas células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, como sea posible desde la interfaz sin tocar el pellet de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo cónico de 50 mililitros, y transferir a un nuevo tubo.Agregue PBS para llevar el volumen final a 25 mililitros e invierta varias veces para mezclar. A continuación, lave los PBMC dos veces como se indica en el texto. Después de eliminar las plaquetas y contar los PBMC como se describe en el texto, resuspendir las células en PBS, 0.1%azida sódica a una concentración de uno por 10 a las séptimas células por mililitro.Para preparar los PBMC para la tinción, transfiera 100 microlitros de cada muestra a una placa inferior en V de 96 pozos. Centrifugar la placa a 350 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular.A cada pozo, agregue 100 microlitros de PBS que contengan un tinte fijable vivo/muerto que reaccione con amina libre en proteínas, y resusppend cuidadosamente la mezcla de PBMC. Posteriormente, deje que la placa se siente durante 10 minutos a temperatura ambiente para el etiquetado de las células muertas. Para cada muestra, prepare 30 microlitros de una mezcla que contenga los siete anticuerpos.En esta etapa, también se pueden añadir anticuerpos valorados contra diferentes moléculas diana y en diferentes fluorocromos. Centrifugar la placa de 96 pozos a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente, y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Añadir el cóctel de anticuerpos a cada pozo, y resuspender cuidadosamente sin generar burbujas.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 30 minutos, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a cada pozo, y centrifugar la placa a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular, y resuspender las células en 200 microlitros de PBS.Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo. Los anticuerpos anti-CD3, CD8, CD14, CD19 y TCR gamma delta se valora con una curva de índice de tinción máxima. La valoración de anticuerpos es el paso más crítico de este protocolo para identificar correctamente siete subconjuntos de células inmunitarias utilizando dos fluorocromos.Para preparar una dilución de anticuerpos doble, llene 10 pocillos de una placa de 96 pocillos con 40 microlitros de tampón de tinción por pozo. A los efectos de este vídeo, solo se mostrará la valoración de anti-CD8. En el primer pozo, aumentar el volumen final a 80 microlitros de tampón de tinción, y añadir anti-CD8 a una concentración cuatro veces la concentración sugerida por el fabricante.Mezcle bien y transfiera 40 microlitros al segundo pozo. Mezcla bien y repite este paso para todos los demás pozos. Mancha 10 muestras de PBMC o sangre entera con 30 microlitros de las 10 diferentes diluciones dobles de anti-CD8 siguiendo el protocolo demostrado anteriormente.Adquiera datos con un citometro de flujo y trace la señal de cada dilución. Después de calcular el índice de manchas para cada concentración de anticuerpos como se detalla en el texto, trazar el índice de manchas frente a la concentración de anticuerpos expresada como una fracción de la dilución de anticuerpos e identificar la concentración de anticuerpos con el valor máximo del índice de manchas. Para valorar los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD56, comience con la estrategia de dilución doble demostrada anteriormente, añadiendo concentraciones adicionales en el medio para identificar finamente el rango de concentración que permitirá la separación de células T CD4 positivas y células NK de las otras poblaciones celulares.Valore el anticuerpo anti-CD4 colocando la señal anti-CD4 entre la doble señal CD8 positiva, CD3 positiva y la población positiva única CD3. Valorar el anticuerpo anti-CD56 siguiendo una estrategia similar a la valoración de anticuerpos anti-CD4, colocando células NK entre las poblaciones CD3 negativas y CD3 positivas. Para comenzar esta estrategia de gating de dos fluorocromos y siete marcadores, seleccione la puerta de linfocitos y cree una gráfica de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje.Puerta en células T CD8 positivas identificadas como células positivas dobles CD3 y CD8 en la esquina superior derecha de la gráfica de puntos. Excluya la población DIM CD8 que podría contener células NKT. Puerta en células T CD4 positivas identificadas como la población entre los t células T CD8 positivas y las poblaciones positivas únicas de CD3.Puerta en células T gamma delta identificadas como células CD3 altas. Subdivide las células T gamma delta a CD8 positivas y CD8 negativas. Puerta en las células NK identificadas como la población entre células CD3 positivas y CD3 negativas.Subdividir las células NK a CD8 positivo y CD8 negativo. Puerta en las células B identificadas como la población CD3 negativa, CD19-positiva en la esquina inferior derecha de la gráfica de puntos. Seleccione la puerta de monocitos y cree una gráfica de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje.Puerta en la población CD3 negativa, CD14-positiva. Usando esta estrategia, los linfocitos de un paciente con mieloma múltiple fueron cerrados sobre la base de su dispersión hacia adelante y dispersión lateral y su perfil citométrico de flujo. Las subpoblaciones de memoria CD8 positivas y las células T ingenuas se identificaron mediante la expresión de CD45RA y CCR7.La expresión de HLA-DR y CD57 se utilizó para estudiar la activación de células T en células CD8 positivas ingenuas, memoria, memoria central, memoria del efector y células de memoria de efector CD45RA positivas. De manera similar, se identificaron células T ingenuas y de memoria CD4 positivas. Dentro de la población de memoria, CCR4 y CCR6 se utilizaron para identificar subpoblaciones de ayuda T en células T CD4 positivas.Las subpoblaciones de células NK se caracterizaron por la expresión CD16 y CD57. Esta estrategia se utilizó para investigar la dinámica en poblaciones inmunitarias de muestras longitudinales de un donante con mieloma múltiple que recibe un trasplante de células madre. La caracterización de las subpoblaciones CD8 y CD4 a lo largo del tiempo mostró una activación sostenida de células T CD4 positivas y CD8 positivas y un sesgo de T helper a un fenotipo T-helper-one.Pero en el día 60, el porcentaje de células B aumentó drásticamente, prediciendo la recaída del paciente. La preparación celular adecuada y la valoración de anticuerpos son pasos críticos para lograr resultados fiables utilizando esta técnica. Se pueden añadir anticuerpos dirigidos a otros marcadores para lograr un análisis de citometría de flujo más profundo y para crear paneles citométricos de flujo modular dirigidos a varios linajes al mismo tiempo.Enfoques similares destinados a ampliar el número de marcadores grabables también podrían desarrollarse utilizando diferentes conjuntos de marcadores o para su uso en diferentes modelos animales. No olvide que el azida sódica puede causar quemaduras en la piel y los ojos. Por lo tanto, siempre se debe usar una capa de laboratorio, gafas protectoras y guantes cuando se manipule este reactivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

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Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

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The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...