Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala systemet och hudsjukdomar, < https://www.niams.nih.gov/>, award nummer P30-AR053503; Stabilare stiftelsen, www.stablerfoundation.org; Nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program för Lung hälsa (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Alla studier av mänskligt material godkändes av Johns Hopkins institutionella i styrelsen under Health Insurance Portability och Accountability Act. Patient- och prover var avidentifierade. PBMC och blod från friska kontroller erhölls av informerat samtycke.
Obs: Detta protokoll har testats på färska eller frysta isolerade perifera blodkroppar och helblod.
1. cell förberedelse
<ol><li>
Isolering av perifera blodkroppar (PBMC) från ...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Det protokoll som presenteras här har visat sig vara ganska flexibel och okänsliga för förändringar i färgning buffert, temperatur och perifera blodkroppar förberedelser på grund av det höga uttrycket av lineage markörer på cellytan. Det mest kritiska steget för att få hög kvalitet, reproducerbara data är titrering av antikroppar. Att notera, eftersom titrering av antikroppar ska alltid utföras under installationen av en flöde flödescytometrisk panel, detta steg inte till extra bänk-tid till vår två-...

Flödescytometri är en teknik som utvecklades för att analysera flera parametrar på enstaka partiklar med en hastighet av flera tusen händelser per andra1. Exempel på prover som analyseras med flödescytometri inkluderar, men är inte begränsade till, celler, pärlor, bakterier, blåsor och kromosomer. En fluidic system styr partiklar vid förhör punkten där varje partikel korsar sin väg med en eller flera lasrar, och flera parametrar registreras för vidare analys. Framåt och side scatter-symboler, genereras av spridning av rena laserljuset, används för att identifiera målgruppen och hämta information om den relativa storlek och interna komplexitet/granularitet av partiklar, respektive. Alla andra parametrar, som står för merparten av data i ett flöde flödescytometrisk analys, härleds av fluorokrom-märkt sonder som känna igen och binda till specifika mål på partiklarna av intresse.
Flödescytometri är en primära verktyg för immunologiska studier för att identifiera och karaktärisera cellpopulationer. För att dissekera komplexiteten i immunsystemet, utvecklas multicolor paneler hela tiden för att utöka antalet markörer samtidigt registreras för djupa immunophenotyping cell populationer1. Detta leder till utvecklingen av mer kapabla instrument och fluorokromer, med senaste high-end flöde cytometers överstiger 20 fluorescerande parametrar. Detta resulterar i komplexa studiedesign på grund av fluorokrom spektrala överlappning och högre kostnader i samband med anpassade antikropp märkning och skickliga operatörer. I flera instanser minskas komplexiteten och kostnaderna genom att använda separata paneler av markörer för olika cellpopulationer. Detta tillvägagångssätt, dock är felbenägen, reducerar informationen i varje panel och kan vara svåra att tillämpa för prover med begränsat antal celler. Dessutom utesluter ökar antalet markörer djupa immunophenotyping på instrument med färre lysrör parametrar. Vi har tidigare utvecklat en färgning protokoll för att identifiera stora befolkningsgrupper immun (CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter) i perifera mononukleära blodceller (PBMC) genom att kombinera sju lineage markörer med hjälp endast två fluorokromer istället för sju krävs med den traditionella ”en fluorokrom-en markör” tillvägagångssätt (www.hcdm.org)2,3. Vår första rapport utforskade och validerade begreppet kombinerar sju markörer i två fluorokromer för djupa immunophenotyping. I denna rapport presenterar vi ett steg-för-steg protokoll för att isolera och fläcken perifera blodkroppar, med fokus på den praktiska aspekten och felsökningssteg för att uppnå en lyckad färgning.
Detta protokoll baseras på iakttagelsen att lineage markörer har ett konstantuttryck på cellytan och att varje cell befolkningen har en exklusiv kombination av lineage markörer. I PBMC, CD3 uttryck subdivides immunceller i två huvudkategorier: CD3-positiva T-lymfocyter och CD3-negativa celler. Inom den positiva undergruppen för CD3, CD4+, CD8+ och γδ T-celler kan separeras med hjälp av antikroppar som enbart rikta den γδ-receptorn, CD4 och CD8. På ett jämförbart sätt, inom CD3 negativa undergruppen, kan B-celler, NK-celler och monocyter identifieras unikt med antikroppar mot CD19, CD56 och CD14, respektive. I en standard fluorokrom-en markör strategi, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 och -TCR γδ antikroppar upptäcks med sju olika fluorokromer. Vår strategi kombinerar anti-CD3 - CD56 och -TCR γδ antikroppar i en fluorokrom (märkt för bekvämlighet fluorokrom A) och anti-CD4,-CD8, -CD14 och - CD19 antikroppar i en annan fluorokrom (fluorokrom B). Detta är möjligt genom en kombination av titrering av antikroppar och differentiell antigen uttryck. Både CD4+ och CD8+ T celler är positiva för anti-CD3 antikroppen i fluorokrom A, men de kan separeras i fluorokrom B maximera uttrycket av CD8 signalen medan placera, med en ad hoc-titrering, CD4 signalen mellan CD8 och CD3 positiva-CD4/CD8 dubbel negativ cellerna. Γδ T-celler uttrycker CD3 högre än CD4 och CD8, och därför de kan identifieras som CD3 hög4. Denna signal förstärks ytterligare genom märkning γδ T-celler i fluorokrom A med en anti-TCR γδ antikroppar, därmed förbättra separationen mellan CD3 låg T celler och CD3 hög γδ T-celler. B-celler kan identifieras som CD3– i fluorokrom A och CD19+ i fluorokrom B. För att separera CD3 negativa NK-celler från B-celler, användes en anti-CD56 antikropp i fluorokrom A som anti-CD3. Detta är möjligt eftersom CD56 uttryckt på NK cell på en mycket lägre nivå än CD3 på T celler5. Slutligen, monocyter kan identifieras via en kombination av framåt-side scatter egenskaper och uttryck av CD14 i fluorokrom B.
Tanken att kombinera upp till fyra markörer med två fluorokromer har varit redan framgångsrikt försökt innan6,7,8, och har använts i ett kliniska protokoll för att identifiera maligna lymfatisk populationer9 . En tidigare rapport också kombinerat sju markörer (med olika specificitet från markörer än vi använde i vårt protokoll) med två fluorokromer, men detta tillvägagångssätt förlitade sig på en komplex märkning av varje antikropp med varierande mängd fluorokrom10. Detta är i motsats till vår metod som använder kommersiellt tillgängliga antikroppar och kan anpassas till konfigurationen av instrument och kan dra nytta av den nya generationen av polymer fluorokromer.
Det övergripande målet med denna metod är att expandera optiska gränserna för de flesta flöde cytometers möjliggör inspelning av fem ytterligare markörer att förhöra komplexa cellpopulationer. Följaktligen, avancerade immunologiska analyser kan utföras på prisvärd 6-10 fluorokrom flöde cytometers och 2-3 fluorokrom fältinstrument kan uppnå enastående resultat i områden med begränsade resurser. Avancerade instrument kan också nytta detta synsätt genom att använda extra fluorokromer att utföra djupare flödesanalys flödescytometri och att skapa modulära flöde flödescytometrisk paneler inriktning flera härstamningar på samma tid11. Detta kan potentiellt minska antalet paneler på modulära immunophenotyping flödescytometri och minska kostnaderna, fel och hanteringstid. Detta tillvägagångssätt är också mycket väl lämpad när det gäller kliniska prover med begränsat antal celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Immunceller karakterisering är starkt beroende av multicolor flödescytometri att identifiera subpopulations baserat på differentiell uttryck för yta markörer. Installationen av en klassisk multicolor panel kräver avancerade instrument, anpassade märkt antikroppar och noggrann studiedesign för att minimera spektrala överlappning. Vi utvecklade en multiparametric analys för att identifiera stora befolkningsgrupper immun (CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter) i perifert blod genom att kombinera sju lineage markörer med endast två fluorokromer. Vår strategi bygger på observationen att lineage markörer ständigt uttrycks i en unik kombination av varje cell befolkningen. Kombinera denna information med en noggrann titrering av antikroppar kan utredarna att registrera fem ytterligare markörer, expanderar den optiska gränsen för de flesta flöde cytometers. Head-to-Head jämförelse visade att majoriteten av immunceller populationer i perifert blod kan karakteriseras med jämförbar noggrannhet mellan vår metod och den klassiska ”en fluorokrom-en markör metoden”, även om det senare är fortfarande mer exakt för att identifiera populationer såsom NKT-celler och γδ T-celler. Att kombinera sju markörer med två fluorokromer möjliggör analys av komplexa immunceller populationer och kliniska prover på prisvärd 6-10 fluorokrom flöde cytometers, och även på 2-3 fluorokrom fältinstrument i områden med begränsade resurser. Avancerade instrument kan också nytta detta synsätt genom att använda extra fluorokromer för att utföra djupare flödesanalys flödescytometri. Detta tillvägagångssätt är också mycket väl lämpad för screening flera cellpopulationer kliniska prov med begränsat antal celler.

Setup och analys av ett flöde flödescytometri experiment av mänskliga perifera blodceller färgas med sju lineage markörer (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 och -TCR γδ antikroppar) med hjälp av endast två fluorokromer presenteras.
Representativa resultat beskrivs för anti-CD8 och -CD56 antikroppstitrering. För varje antikropp (i det här exemplet anti-CD8), data från tio successiv 2-faldig utspädning registre...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Här presenterar vi ett flöde flödescytometrisk protokoll för att identifiera CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter i perifert blod med hjälp av endast två fluorokromer i stället för sju. Med detta synsätt, kan fem ytterligare markörer spelas på de flesta flöde cytometers.

Diskriminering av sju immunceller delmängder av två-fluorokrom flödescytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Det övergripande målet med denna metod är att expandera bortom den optiska gränsen för de flesta flödescytmetrar genom att låta en forskare spela in fem ytterligare markörer för att förhöra komplexa cellpopulationer. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att uppnå en djup immunophenotyping när man arbetar med instrument med ett lågt antal detektorer eller prov med begränsat antal celler. Börja detta förfarande genom att noggrant överföra dragen blod i en 50-milliliter koniska röret.Späd blodet med en lika stor mängd PBS utan kalcium och magnesium. Lägg till 15 milliliter densitetsgradientmedium till botten av ett nytt koniskt rör på 50 milliliter. Överlagra försiktigt det utspädda blodet ovanpå densitetsgradientmediet, vilket undviker all blandning mellan densitetsgradientmediet och utspädd blod.Centrifug vid 400 gånger g i 30 minuter vid rumstemperatur utan broms för att undvika störningar i gränssnittet. Efter centrifugeringen, använd en pipett för att noggrant aspirera och kassera det övre lagret, var uppmärksam på att inte ta bort celler vid gränssnittet mellan plasma och densitetsgradientmedium. Samla så många perifert blod mononukleära celler, eller PBMCs, som möjligt från gränssnittet utan att vidröra den röda cellen pelleten längst ner på 50-milliliter koniska röret, och överför till ett nytt rör.Lägg till PBS för att få den slutliga volymen till 25 milliliter, och invertera flera gånger för att blanda. Sedan, tvätta PBMCs dubbelt så som anges i texten. Efter att ha tagit bort trombocyterna och räknat PBMC:erna enligt beskrivningen i texten, återanvänd cellerna i PBS, 0,1%natriumazid till en koncentration av en gång 10 till de sjunde cellerna per milliliter.För att förbereda PBMC:erna för färgning, överför 100 mikroliter av varje prov till en 96-väl V-bottenplatta. Centrifugera plattan vid 350 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelletsen.Till varje brunn, tillsätt 100 mikroliter pbs som innehåller en levande / död fixerbara färgämne som reagerar med fri amin på proteiner, och återanvända PBMC blandningen noggrant. Därefter, låt plattan att sitta i 10 minuter vid rumstemperatur för märkning av döda celler. För varje prov, preparera 30 mikroliter av en blandning som innehåller alla sju antikroppar.I detta skede kan titrerade antikroppar mot olika målmolekyler och i olika fluorokromer också tillsättas. Centrifugera 96-brunnsplattan vid 350 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur, och aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelletsen. Tillsätt antikroppscocktailen i varje brunn, och resuspend försiktigt utan att generera bubblor.Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur i mörker. Efter 30 minuter, tillsätt 150 mikroliter färgningsbuffert till varje brunn, och centrifugera plattan vid 350 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten, och resuspend cellerna i 200 mikroliter pbs.Cellerna är nu redo för flödescytometrianalys. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 och TCR gamma delta antikroppar titreras med en maximal färgning indexkurva. Antikroppstitrering är det mest kritiska steget i detta protokoll för att korrekt identifiera sju immuncellsdeluppsättning med hjälp av två fluorokromer.För att förbereda en tvåfaldig antikroppsutspädning, fyll 10 brunnar av en 96-brunnsplatta med 40 mikroliter av färgningsbuffert per brunn. För den här videon visas endast titrering av anti-CD8. I den första brunnen, öka den slutliga volymen till 80 mikroliter av färgning buffert, och tillsätt anti-CD8 vid en koncentration fyra gånger koncentrationen föreslås av tillverkaren.Blanda väl och överför 40 mikroliter till den andra brunnen. Blanda väl och upprepa detta steg för alla andra brunnar. Stain 10 prover av PBMCs eller helblod med 30 mikroliter av de 10 olika tvåfaldiga utspädningar av anti-CD8 efter protokollet visat tidigare.Skaffa data med en flödescytometer, och rita in signalen från varje utspädning. Efter beräkning av fläckindex för varje antikroppskoncentration som detaljerat i texten, plotta fläckindex kontra antikroppskoncentrationen uttryckt som en fraktion av antikroppsspätningen, och identifiera koncentrationen av antikropp med det maximala fläckindexvärdet. För att titrera anti-CD4 och anti-CD56 antikroppar, börja med den tvåfaldiga utspädning strategi visat tidigare, lägga till ytterligare koncentrationer däremellan för att fint identifiera det intervall av koncentration som kommer att möjliggöra separation av CD4-positiva T-celler och NK celler från de andra cellpopulationerna.Titrera anti-CD4-antikroppen genom att placera anti-CD4-signalen mellan den dubbla CD8-positiva, CD3-positiva signalen och cd3-singeln positiv population. Titrera anti-CD56 antikroppen efter en strategi som liknar anti-CD4 antikroppstitreningen, genom att placera NK-celler mellan CD3-negativa och de CD3-positiva populationerna. För att börja denna två-fluorokrom, sju-markör gating strategi, välj lymfocyt porten, och skapa en punkt tomt med en av de två fluorokromer som används i detta protokoll på varje axel.Gate på CD8-positiva T-celler identifieras som CD3 och CD8 dubbla positiva celler längst upp till höger i punkt tomten. Uteslut den dim CD8 populationen som kan innehålla NKT-celler. Gate på CD4-positiva T-celler identifieras som befolkningen i mellan CD8-positiva T-celler och CD3 enda positiva populationer.Gate på gamma delta T-celler identifieras som höga CD3-celler. Dela upp gamma delta T-celler till CD8 positiva och CD8 negativ. Gate på NK celler identifieras som befolkningen i mellan CD3-positiva och CD3-negativa celler.Dela upp NK-cellerna till CD8-positiva och CD8-negativa. Gate på B-celler identifieras som CD3-negativa, CD19-positiva befolkningen på nedre högra hörnet av punkt tomten. Välj monococytanns port, och skapa en punkt plot med en av de två fluorokromer som används i detta protokoll på varje axel.Utfärda utegångsförbud för på CD3-negationen, CD14-realitetbefolkningen. Med hjälp av denna strategi, var lymfocyter från en patient med flera myelom gated på grundval av deras framåt scatter och sida scatter och deras flöde cytometric profil. CD8-positiva minne subpopulationer och naiva T-celler identifierades genom uttrycket av CD45RA och CCR7.Expression av HLA-DR och CD57 användes för att studera T cell aktivering i CD8-positiva naiva, minne, centrala minne, effector minne och effector minne CD45RA-positiva celler. På ett liknande sätt identifierades CD4-positiva naiva och minnes-T-celler. Inom minnespopulationen användes CCR4 och CCR6 för att identifiera T-hjälpdatorpopulationer i CD4-positiva T-celler.Subpopulationer av NK celler kännetecknades av CD16 och CD57 uttryck. Denna strategi användes för att undersöka dynamiken i immun populationer av längsgående prover från en givare med multipelt myelom emot en stamcellstransplantation. Karakterisering av CD8 och CD4 subpopulations över tiden visade en ihållande CD4-positiva och CD8-positiva T cell aktivering och en skevhet av T helper till en T-helper-en fenotyp.Men vid dag 60, andelen B-celler dramatiskt ökat, förutsäga patienten återfall. Korrekt cell beredning och antikropp titrering är kritiska steg för att uppnå tillförlitliga resultat med hjälp av denna teknik. Antikropp som riktar sig mot andra markörer kan läggas till för att åstadkomma djupare flödescytometrianalys och för att skapa modulära flödescytometriska paneler som riktar sig mot flera härstamningar samtidigt.Liknande metoder som syftar till att utöka antalet registerbara markörer skulle också kunna utvecklas med hjälp av olika uppsättningar markör eller för användning i olika djurmodeller. Glöm inte att natriumazid kan orsaka brännskador på hud och ögon. Därför bör en labbrock, skyddsglasögon, och handskar alltid bäras vid hantering av denna reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk karakterisering av makrofager från råttnjure med flödescytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescensaktiverad cellsortering för Rening av Plasmacytoid dendritiska celler från benmärg från mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...