Name: discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Bu çalışmada artrit Ulusal Enstitüsü ve Musculoskeletal ve deri hastalıkları, tarafından desteklenmiştir < https://www.niams.nih.gov/>, Ödülü numarası P30-AR053503; Stabler Vakfı, www.stablerfoundation.org; Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina İrlanda Program için akciğer Sağlığı (NIPLH) https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

İnsan malzemelerin tüm çalışmaları Johns Hopkins kurumsal inceleme kurulu sağlık, sigorta taşınabilirlik ve Accountability Act altında tarafından kabul edildi. Hasta ve kontrol de-tespit edildi. PBMCs ve sağlıklı kontrol kan Onam tarafından elde edilmiştir.
Not: Bu protokol üzerinde taze test veya izole dondurulmuş periferik kan hücreleri ve tam kan.
1. hücre hazırlık
<ol><li>
Yalıtım tam kan periferik kan hücre (...

<ol>
	<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler's+guide+to+cytometry.">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li><li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes.">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li><li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).</li><li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+&#947;&#948;+T+cells.">CD3 bright lymphocyte population reveal &#947;&#948; T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li><li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes:+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry.">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li><li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome.">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li><li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source:+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two.">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li><li>Bocsi, J., Melzer, S., D&#228;hnert, I., T&#225;rnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-023:+10-Color,+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes.">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li><li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-intensity+multiplexing:+Simultaneous+seven-marker,+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry.">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).</li><li>Roederer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+analysis+of+lymphocytes.">FACS analysis of lymphocytes.</a> Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).</li><li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis.">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li><li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity.">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li><li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma.">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li><li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMIP-017:+Human+CD4++helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells.">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li><li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+(Th1s)+and+Th2s.">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+(Th)1,+Pre-Th2,+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4++Central+Memory+T+Cells.">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li><li>Ye, Z. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710 (2012).</li><li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD8++T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells.">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li><li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation.">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8++T+cells.">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li><li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57+CD4++T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction.">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li><li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD57++T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency.">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li></ol>

Burada sunulan Protokolü oldukça esnek ve duyarsız arabellek, sıcaklık ve periferik kan hücresi hazırlık lineage işaretleri hücre yüzeyindeki yüksek ifadesi nedeniyle boyama değişiklikler göstermiştir. Yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik antikor titrasyonu adımdır. Antikor titrasyonu her zaman bir akış sitometrik panel kurulumu sırasında gerçekleştirilmesi gereken bu yana belirtmek gerekirse bizim iki fluorochrome yaklaşım için ekstra tezgah-zaman bu adımı ekleme...

Akış Sitometresi birden çok parametre birkaç bin olaylar başına ikinci1oranında tek parçacıklar analiz etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Akış Sitometresi tarafından analiz örnekleri örnekleri içerir, ancak hücreleri, boncuk, bakteri, veziküller ve kromozomlar için sınırlı değildir. Sıvı sistemi sorgulama nerede her parçacık yolunda bir veya daha fazla lazerler ile kesişiyor ve birden çok parametre daha fazla çözümleme için kaydedilir noktada parçacıklar yönlendirir. Ön ve yan scatter, saf lazer ışık saçılma tarafından oluşturulan hedef popülasyon tanımlamak ve sırasıyla göreli boyutu ve iç karmaşıklık/parçalı yapı parçacıkları, hakkında bilgi almak için kullanılır. En-in veri akış sitometrik analizinde için hesap, tüm diğer parametreler, tanıyıp faiz parçacıkların spesifik hedeflere bağlamak fluorochrome etiketli probları tarafından türetilmiştir.
Akış Sitometresi belirlemek ve hücre popülasyonlarının karakterize immünolojik araştırmalar için temel bir araçtır. Çok renkli panelleri bağışıklık sisteminin karmaşıklığı incelemek için sürekli aynı anda hücre nüfus1derin immunophenotyping için kaydedilen işaretleri sayısını artırmak için gelişmektedir. Bu 20 floresan parametreleri aşan son yüksek kaliteli akışı cytometers ile fluorochromes ve daha yetenekli aygıtlar gelişimine lider. Bu fluorochrome spektral çakışma nedeniyle karmaşık çalışma tasarım ve özel antikor etiketleme ve vasıflı operatörler ile ilgili daha yüksek maliyetler ile sonuçlanır. Birkaç durumlarda, karmaşıklığı ve maliyeti için farklı hücre popülasyonlarının işaretleri ayrı paneller kullanılarak azaltılır. Bu yaklaşım, ancak, hata eğilimli olduğunu, her panel bilgileri azaltır ve sınırlı sayıda hücre örnekleri uygulamak zor olabilir. Ayrıca, işaretçileri sayısını artırarak daha az floresan parametreleri ile aletleri üzerinde derin immunophenotyping engellemektedir. Daha önce büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için bir boyama protokol geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) yedi sülale işaretçileri kullanarak birleştirerek periferik kan mononükleer hücrelere (PBMCs) Sadece iki fluorochromes yedi yerine geleneksel "bir fluorochrome bir işareti" yaklaşım (www.hcdm.org)2,3kullanarak gerekli. Bizim ilk rapor araştırdı ve derin immunophenotyping için iki fluorochromes içinde yedi işaretleri birleştirme fikri doğrulanmış. Bu raporda, pratik yönü üzerinde odaklanan ve sorun giderme adımları başarılı bir boyama elde etmek için yalıtmak ve periferik kan hücreleri, leke için bir adım adım iletişim kuralı mevcut.
Bu iletişim kuralı gözlem lineage işaretleri hücre yüzeyinde bir sabit ifade var ve her hücre nüfus lineage işaretleri özel bir kombinasyonu vardır üzerinde temel alır. PBMCs içinde CD3 ifade subdivides bağışıklık hücreleri iki kategoriye ayrılır: CD3 pozitif T lenfositler ve CD3-negatif hücreleri. CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde+, CD8+ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir. Standart bir fluorochrome bir işaretleyici yaklaşım, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar ile yedi farklı fluorochromes tespit edildi. Anti-CD3, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar bir fluorochrome (kolaylık fluorochrome A için etiketli) ve anti-CD4, bizim yaklaşım birleştirir-CD8, - CD14 ve - farklı fluorochrome (fluorochrome B) CD19 antikor. Bu antikor titrasyonu ve diferansiyel antijen ifade birleşimi ile mümkündür. Her iki CD4+ ve CD8+ T hücre fluorochrome A anti-CD3 antikor pozitif olmakla birlikte, fluorochrome CD8 sinyal ifade yerleştirerek, bir geçici titrasyon ile CD4 sinyal CD8 arasında ise en üst düzeye çıkarma B ayrılmış ve CD3 pozitif-CD4/CD8 çift negatif hücreleri. γδ T hücreleri CD4 ve CD8 daha yüksek düzeyde CD3 ifade eder ve bu nedenle CD3 yüksek4tanımlanabilir. Bu sinyal daha da γδ T hücreleri fluorochrome A böylece CD3 düşük T hücreleri ile CD3 yüksek γδ T hücreleri arasındaki mesafeyi artırmak bir anti-TCR γδ antikorlar ile etiketleme tarafından artırdı. B hücreleri CD3 tanımlanan- fluorochrome A ve CD19+ fluorochrome d. içinde CD3 negatif NK hücreleri B hücreleri birbirinden ayırmak için bir anti-CD56 antikor fluorochrome A anti-CD3 kullanıldı. CD56 NK hücre CD3 T hücreleri5daha fazla alt düzeyde ifade edilen bu olanak sağlanır. Son olarak, monosit ileri tarafı dağılım özellikleri ve CD14 ifade fluorochrome B. içinde bir arada üzerinden tespit edilebilir
En çok dört işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme fikri6,7,8daha önce başarıyla denedi ve klinik protokolünde Malign lenfositik nüfus9 tanımlamak için kullanılan . Önceki bir rapor da yedi işaretleri kombine (veri işaretleyicilerini üzerinden farklı özgüllük ile daha bizim iletişim kuralında kullanılan) iki fluorochromes ama bu yaklaşım kullanarak dayanıyordu bir karmaşık her antikor fluorochrome10değişen miktarda, etiketleme üzerinde. Bu piyasada bulunan antikor kullanan bizim yöntemi aksine ve enstrüman yapılandırma için adapte edilebilir ve polimer fluorochromes yeni nesil yararlanabilirsiniz.
Bu metodoloji genel amacı karmaşık hücre popülasyonlarının sorguya çekmek için beş ek işaretleyiciler kayıt için izin çoğu akışı cytometers optik sınırlarını genişletmektir. Sonuç olarak, uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers üzerinde gelişmiş immünolojik analizi gerçekleştirilebilir ve 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynaklara sahip çarpıcı sonuçlar elde edebilirsiniz. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ve modüler akış sitometrik paneller aynı saat11birkaç soy hedefleme için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu potansiyel olarak modüler immunophenotyping Akış Sitometresi içinde kullanılan panellerin sayısını azaltmak ve maliyeti, hataları ve işlem süresi azaltır. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler söz konusu olduğunda uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562426</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11152082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562751</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2732054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2562316</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555347</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555367</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555335</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555518</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_398601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRgd</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>331211</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1089215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353217</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10913812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560674</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_1727497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561034</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10563066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353419</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_11124539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561730</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_10894207</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD57</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562488</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563083</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2737994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563784</td>
			<td>Antibody for staining 
			RRID: AB_2744293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cells</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-23105</td>
			<td>Live/dead discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352001</td>
			<td>to stain whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>12648010</td>
			<td>Freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>249570</td>
			<td>plate for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express 6</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination of seven immune cell subsets by two-fluorochrome flow cytometry

Bağışıklık hücre karakterizasyonu ağır çok renkli Akış Sitometresi yüzey işaretlerinin fark ifadeye dayalı altgrupları tanımlamak için kullanır. Klasik bir çok renkli panel kurulumu high-end aletleri, özel etiketli antikorlar ve spektral örtüşme en aza indirmek için dikkatli bir çalışma tasarım gerektirir. Büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için multiparametric bir analiz geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) sadece iki fluorochromes kullanarak yedi sülale işaretleri birleştirerek periferik kan içinde. Bizim strateji lineage işaretleri sürekli her hücre nüfus tarafından benzersiz bir bileşimini ifade edilir gözlem temel alır. Bu antikorlar dikkatli bir titrasyon ile birleştirme müfettişler çoğu akışı cytometers optik sınırını genişletme beş ek işaretleri kaydetmek izin verir. Hala ikinci olmasına rağmen kafa kafaya karşılaştırma bağışıklık hücre popülasyonlarının periferik kan içinde büyük çoğunluğu bizim yöntem ve klasik "bir fluorochrome bir işareti yaklaşım", arasında karşılaştırılabilir doğruluk ile karakterize edilebilir gösterdi nüfus NKT hücreleri ve γδ T hücreleri gibi tanımlamak için daha kesin. Karmaşık bağışıklık hücre popülasyonlarının ve klinik örnekler uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers ve hatta 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynakları ile çözümlenmesi için yedi işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme sağlar. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi birkaç hücre popülasyonlarının hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler durumunda eleme için uygundur.

Kurulum ve bir Akış Sitometresi deney insan periferik kan hücrelerinin analizini lekeli yedi sülale işaretleri ile (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorları) sadece iki fluorochromes sunulmaktadır.
Anti-CD8 ve CD56 antikor titrasyonu için - temsilcisi sonuçları açıklanmıştır. Her antikor için (Bu örnekte, anti-CD8), on ardışık logosuna 2 kat dilutions verilerden bir leke dizin eğris...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry at JoVE.com

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Bu metodolojinin genel amacı, bir araştırmacının karmaşık hücre popülasyonlarını sorgulamak için beş ek belirteç kaydetmesine izin vererek çoğu akış sitometresinin optik limitinin ötesine genişletmektir. Bu tekniği kullanarak, düşük sayıda dedektör veya sınırlı sayıda hücre ile örnek ile alet ile çalışırken derin bir immünofenotitipleme elde etmek mümkündür. 50 mililitrelik konik bir tüp içine dikkatle çekilen kan aktararak bu prosedürü başlayın.Kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS eşit miktarda kan seyreltin. Yeni bir 50 mililitrekonik tüp altına yoğunluk gradyan orta 15 mililitre ekleyin. Dikkatle yoğunluk gradyan orta ve seyreltilmiş kan arasında herhangi bir karıştırma kaçınarak, yoğunluk gradyan orta üstüne seyreltilmiş kan bindirme.Arabirimin bozulmasını önlemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez g'de frensiz santrifüj. Santrifüjden sonra, plazma ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimdeki hücreleri kaldırmamaya dikkat edin, üst katmanı dikkatlice aspire etmek ve atmak için bir pipet kullanın. 50 mililitrelik konik tüpün altındaki kırmızı hücre peletine dokunmadan mümkün olduğunca çok periferik kan mononükleer hücre, ya da PBMCs, mümkün olduğunca toplamak ve yeni bir tüp transfer.Son hacmi 25 mililitreye getirmek için PBS ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Ardından, PBMC'leri metinde belirtilenin iki katı kadar yıkayın. Trombositleri çıkardıktan ve metinde açıklandığı gibi PBMCs sayarak sonra, PBS hücreleri resuspend, 0.1% sodyum azit mililitre başına yedinci hücrelere bir kez 10 konsantrasyonu.PBMC'leri boyama için hazırlamak için, her numuneden 100 mikrolitreyi 96 kuyulu v-alt plakasına aktarın. Oda sıcaklığında 3dakika boyunca 350 kez g plaka santrifüj. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin.Her kuyuya, proteinler üzerinde serbest amin le reaksiyona girer canlı / ölü fikse boya içeren PBS 100 mikrolitre ekleyin ve dikkatle PBMC karışımı resuspend. Daha sonra, ölü hücrelerin etiketleme için plaka oda sıcaklığında 10 dakika oturmasına izin verin. Her numune için, yedi antikor içeren bir karışımın 30 mikrolitresini hazırlayın.Bu aşamada farklı hedef moleküllere ve farklı florokromlara karşı titre antikorlar da eklenebilir. 96 kuyulu plakayı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 350 kez g'de santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin. Her iyi antikor kokteyl ekleyin ve kabarcıklar üretmeden dikkatlice resuspend.Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. 30 dakika sonra, her kuyuya 150 mikrolitre boyama tamponu ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 350 kez g'de santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 200 mikrolitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın.Hücreler şimdi akış sitometri analizi için hazır. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 ve TCR gama delta antikorları maksimum boyama indeks eğrisi ile titre edilir. Antikor titrasyonu, iki florokrom kullanarak yedi bağışıklık hücresi alt kümesini doğru bir şekilde tanımlamak için bu protokoldeki en kritik adımdır.İki kat antikor seyreltme hazırlamak için, kuyu başına 40 mikrolitre boyama tamponu ile 96 kuyulu bir plakanın 10 kuyusu doldurun. Bu videonun amaçları için, sadece anti-CD8 titrasyonu gösterilir. İlk kuyuda, son hacmi 80 mikrolitre boyama tamponuna yükseltin ve üretici nin önerdiği konsantrasyonun dört katı konsantrasyonda anti-CD8 ekleyin.İyi bir şekilde karıştırın ve 40 mikrolitreyi ikinci kuyuya aktarın. İyi bir şekilde karıştırın ve diğer tüm kuyular için bu adımı tekrarlayın. Daha önce gösterilen protokolü izleyerek anti-CD8 10 farklı iki kat seyreltme 30 mikrolitre ile PBMCs veya tam kan 10 örnekleri leke.Akış sitometresi ile veri edinin ve her seyreltmeden gelen sinyali çizin. Metinde ayrıntılı olarak her antikor konsantrasyonu için leke indeksi hesaplandıktan sonra, antikor seyreltme bir kısmını olarak ifade antikor konsantrasyonu karşı leke indeksi arsa ve maksimum leke indeksi değeri ile antikor konsantrasyonu belirlemek. Anti-CD4 ve anti-CD56 antikorları titrat için, daha önce gösterilen iki kat seyreltme stratejisi ile başlamak, ince cd4-pozitif T hücreleri ve NK hücrelerinin diğer hücre popülasyonlarından ayrılmasını sağlayacak konsantrasyon aralığını belirlemek için arasında ek konsantrasyonlar ekleyerek.Anti-CD4 antikorlarını çift CD8-pozitif, CD3-pozitif sinyal ve CD3 tek pozitif popülasyon arasına anti-CD4 sinyalini yerleştirerek titrat. Anti-CD56 antikor anti-CD4 antikor titrasyonu benzer bir strateji aşağıdaki titrat, CD3-negatif ve CD3-pozitif popülasyonlar arasında NK hücreleri yerleştirerek. Bu iki florokrom, yedi marker gating stratejisi başlatmak için, lenfosit kapısını seçin ve her eksenüzerinde bu protokolde kullanılan iki florokrom biri ile nokta arsa oluşturmak.Nokta çiziminin sağ üst köşesinde CD3 ve CD8 çift pozitif hücreler olarak tanımlanan CD8-pozitif T hücrelerinin kapısı. NKT hücreleri içerebilecek loş CD8 popülasyonunu hariç tonuyla. CD8-pozitif T hücreleri ile CD3 tek pozitif popülasyonları arasındaki popülasyon olarak tanımlanan CD4-pozitif T hücrelerinin kapısı.Yüksek CD3 hücreleri olarak tanımlanan gama delta T hücrelerinin kapısı. Gama delta T hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak böl. CD3-pozitif ve CD3-negatif hücreler arasındaki popülasyon olarak tanımlanan NK hücrelerinin kapısı.NK hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak böl. Nokta çiziminin sağ alt köşesinde CD3-negatif, CD19-pozitif popülasyon olarak tanımlanan B hücrelerinin kapısı. Monosit kapısını seçin ve her eksende bu protokolde kullanılan iki florochrome'dan biriyle nokta çizimi oluşturun.CD3-negatif, CD14-pozitif popülasyonda kapı. Bu strateji kullanılarak multipl miyelomu olan bir hastanın lenfositleri ileri dağılımları ve yan dağılımları ve akış sitometrik profilleri temelinde geçitlendi. CD8-pozitif bellek alt popülasyonları ve naif T hücreleri CD45RA ve CCR7 ekspresyonu ile tanımlanmıştır.CD8-pozitif naif, bellek, merkezi bellek, efektör bellek ve efektör bellek CD45RA-pozitif hücrelerde T hücre aktivasyonu çalışmak için HLA-DR ve CD57 ekspresyonu kullanıldı. Benzer şekilde CD4-pozitif naif ve bellek T hücreleri tespit edildi. Bellek popülasyonu içinde, CD4-pozitif T hücrelerinde T yardımcı alt popülasyonlarını tanımlamak için CCR4 ve CCR6 kullanılmıştır.NK hücrelerinin alt popülasyonları CD16 ve CD57 ekspresyonu ile karakterize edildi. Bu strateji, kök hücre nakli alan multipl miyelomlu bir donörden alınan uzunlamasına örneklerin bağışıklık popülasyonlarında dinamikleri araştırmak için kullanılmıştır. Zaman içinde CD8 ve CD4 alt popülasyonlarının karakterizasyonu sürekli cd4-pozitif ve CD8-pozitif T hücre aktivasyonu ve T-helper-one fenotip T yardımcı bir eğrilme gösterdi.Ama 60. Uygun hücre hazırlama ve antikor titrasyonu bu tekniği kullanarak güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik adımlardır. Diğer belirteçleri hedefleyen antikor, daha derin akış sitometri analizini gerçekleştirmek ve aynı anda birden fazla soyu hedefleyen modüler akış sitometrik panelleri oluşturmak için eklenebilir.Kaydedilebilir işaretleyicilerin sayısını artırmayı amaçlayan benzer yaklaşımlar, farklı işaretleyici kümeleri kullanılarak veya farklı hayvan modellerinde kullanılmak üzere geliştirilebilir. Sodyum azitin cilt ve gözlerde yanıklara neden olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bir laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven her zaman bu reaktif ele giyilmelidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...