Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

محمد معتمد من قبل فوندز voor ويتينشابيليجك أونديرزوك Vlaanderen (فو) زمالات ما بعد الدكتوراه (133722/1204517N)، وتعترف بالدعم المستمر من مؤسسة القلب والأوعية الدموية في كولومبيا وقسم العلوم الإدارية، التكنولوجيا والابتكار (منحة CT-FP44842-307-2016، رمز المشروع 656671250485). م. م. معتمد من قبل زمالة دكتوراه فو (1S48018N). وأيده M.G.H. منحة الحاصلة المؤسسية والدعم الخارجي من تييري لاتران مؤسسة (الهيئة العامة للسدود-VIP)، ومؤسسة لأبحاث مرض الزهايمر (ساو-FRA) (P #14006)، فو (منحة 1513616N)، ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) (ابتداء من المنح 281961-أستروفونك؛ والدليل على مفهوم المنح 713755--الإعلان--كبار الشخصيات). المؤلفون تعترف Haughton جاسون لمساعدته مع تربية الماوس، كاستالدو ستيفاني لمساعدة لها القيام بحقن الوريد الذيل، وكارولين ايكينس لتوفير صور transfected HEK293T الخلايا. وتسلم M.G.H. مايكل دنلوب، وبيتر هيكمان، وعميد هاريسون.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

إنتاج المؤتلف إف المتجهات الموصوفة هنا استخدامات المواد والمعدات المشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ومرافق الثقافة الخلية. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على ناقلات إف الصف الخالص الإكلينيكية، والتي يمكن استخدامها لاستهداف أنواع متعددة من الخلايا والأنسجة عبر مجموعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو . واحد من أعظم مزايا هذا البروتوكول، مقارنة بالآخرين (أي تنقية المستندة إلى CsCl)، هو أقصر وقت العمل اللازم. جاهزة للاستخدام إف الناقلة التي يمكن الحصول عليها في مدة أقصاها 6 أيام عمل بعد تعداء الأولية للخلايا HEK293T.
وهناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر سلبا على العائد النهائي أو نوعية ناقل إف. تعداء ضعف الكفاءة واحد من الأسباب الرئيسية لمنخفضة غلة فيروسية33. توصية رئيسية هي استخدام خلايا HEK293T التي قد لا باساجيد أكثر من 20 مرة ولا تملك التقاء خلية أكبر من 90% في وقت تعداء21. وبالإضافة إلى ذلك، قد تعداء الأسلوب المحدد لها تأثير كبير على النتائج. ويستند هذا البروتوكول استخدام بي. بي هو بوليمر الموجبة مع القدرة على توصيل خارجية الحمض النووي لنواة الخلية من خلال توليد مركبات البوليمر والحمض النووي، المعروفة باسم بوليبليكسيس، التي يتم تناولها بالخلية والمتجر بهم عن طريق اندوسوميس34. تعداء المستندة إلى جزيرة الأمير إدوارد سهل وسريع لتنفيذ، وعلى النقيض من الأساليب الأخرى المستخدمة على نطاق واسع، مثل الترسيب المشارك من الحمض النووي مع فوسفات الكالسيوم35. أيضا، على أساس بي تعداء أرخص بكثير بالمقارنة مع أساليب أخرى أدخلت حديثا، مثل استخدام الدهون الموجبة والمغناطيس بوساطة تعداء36.
استراتيجية تنقية تلعب دوراً رئيسيا في البروتوكول. ومقارنة بالأساليب الأخرى، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول تميل إلى تحتوي على نسبة أعلى من الجسيمات الفيروسية فارغة (20 في المائة)20. وهذا يقابل، إلى حد ما، حقيقة أن تنقية إيوديكسانول-على أساس نتائج بشكل روتيني في الاستعدادات ناقل إف مع نسبة الجسيمات للعدوى أقل من 100. وهذا يمثل تحسنا كبيرا بالمقارنة مع الإجراءات التقليدية المستندة إلى CsCl، الذي هو خسارة كبيرة للعدوى الجسيمات عنها37. أسلوب بديل مشترك آخر لتنقية ناقلات إف تنقية المستندة إلى الفصل اللوني. ومع ذلك، هذا الأسلوب قد العيب الرئيسي عمود معين مطلوب لكل ناقل قفيصه المستخدمة: فعلى سبيل المثال، حين معزولة تقليديا باستخدام أعمدة الهيبارين AAV2، هذه المنهجية لا يعمل مع AAV4 و AAV5، التي لا تملك الهيبارين الملزمة مواقع في هذه كابسيدس38. وبالنظر إلى أن تنقية اللوني أيضا باهظة الثمن، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول عموما أكثر ملاءمة للمختبرات التي ترغب في إنتاج دفعات عالية الجودة من ناقلات إف على نطاق صغير33،39، 40-ومع ذلك، لتعظيم العائد النهائي ونقاء ناقل، الحذر الشديد مطلوب عند صنع التدرجات إيوديكسانول. إيوديكسانول الكسور المختلفة ينبغي أن تنقل إلى أنبوب تنبيذ فائق باستخدام ماصة باستور عقيمة نصيحة الذي لمس جدار الأنبوبة: يجب طرد إيوديكسانول من الماصة ببطء وباستمرار. كما تتراكم الجزيئات متجه في طبقة إيوديكسانول 40 ٪، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها لضمان أن الواجهات التدرج لا تخلط20. وأخيراً، ينبغي أن يمكن استردادها الكسر التي تحتوي على الناقل بإدخال إبرة حادة الفولاذ المقاوم للصدأ مع مقياس ليس أكبر من 20 غ. لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش متجه، ينبغي استرداد الكسر واضحة في مجملها. أثناء هذه الخطوة، التوقيت أمر بالغ الأهمية. لتجنب المساس بنقاء الإعداد، من الضروري أن تتوقف عن جمع قبل أن يتم جمع المراحل الأخرى (تلويث) التدرج.
الاختلافات في عيار المتجهات التي تم الحصول عليها يمكن أن يعزى أيضا إلى القدرة الجوهرية ناقل لإنتاج جزيئات تعبئتها. مقارنة بين مختلف إف اللقاح وأظهرت أن بعض ناقلات إف أكثر صعوبة لإنتاج في عيار أعلى من غيرها (مثلاً، AAV2)41. يمكن أن يكون سبب المحتمل عيار أقل هطول الأمطار خلال الخطوة desalting، ناقل، ومنعت بسهولة عن طريق تجنب اكتظاظ33. وعلاوة على ذلك، من الممكن أيضا أن كفاءة تنقية إيوديكسانول على أساس التدرج يختلف قليلاً بين اللقاح، وعليه، يمكن ملاحظة اختلافات في عيار الحصول عليها مع الأنماط المختلفة41.
وأخيراً، فإنه يحتاج إلى تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن قبكر أسلوب دقيق جداً للتحديد الكمي الحمض النووي يمكن ملاحظة بعض التغير المتأصلة في هذه التقنية. الدقة في المعايرة يعتمد أساسا على بيبيتينج دقيقة وفورتيكسينج السليم لكافة الحلول. يمكن ضمان عيار الأكثر دقة القراءة، تتكرر في قبكر بشكل مستقل، وحساب متوسط القيم التي تم الحصول عليها. اختيار الإشعال المعروضة في هذا البروتوكول يستند إلى تسلسل المروج CBA يقع في بلازميد بترانسجيني المستخدمة في المختبر. هو مروج CBA مروج اصطناعية قوية يستخدم على نطاق واسع في مجال مكافحة ناقلات للتعبير بالسيارة عبر العديد من أنواع الخلايا. وهو يتضمن العديد من العناصر، بما في ذلك عنصر محسن المبكر الفيروس المضخم للخلايا (CMV)؛ المروج وأول إكسون إنترون الأولى من الجينات CBA؛ ويقبلون لصق الجينات بيتا جلوبين الأرانب. ومع ذلك، يمكن تصميم كبسولة تفجير لتقريبا أي عنصر يقع ضمن كاسيت التعبير (بما في ذلك في المروج والتحوير والعناصر التنظيمية). مقارنة عيار عبر دفعات من الممكن أيضا، توفير الإشعال المستخدمة ضد المناطق المشتركة للناقلات في السؤال.
وفي الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج ناقلات إف مع مجموعة متنوعة من كابسيدس وتكوينات الجينوم وأنواع المروج والشحنات التحوير. هذا سوف تسمح للمستخدمين بسهولة التكيف مع خصائص النهائي لإيصالها إلى أفضل ما يناسب احتياجات التجريبية. في المقدمة في نتائج تمثيلية، مثال استخدام بي إتش بي. قفيصه ب، التي تعبر BBB كفاءة، أعطى التعبير الجيني ذات كفاءة عالية في الجهاز العصبي المركزي، حقن الوريد ذيل التالية32. الإدارة المنهجية لناقلات الاختراق الجهاز العصبي المركزي له مزايا كبيرة من حيث الآثار الجانبية المحتملة2،،من1732. بديل ممكن لحقن الطرفية، مع تجنب المحاذير التقنيات الغازية، هو التسليم إينتراثيكال، الذي يتكون من تسليم ناقل إف في السائل الدماغي النخاعي. وقد ثبت هذا الطريق التسليم لتكون فعالة، يظهر التعبير على نطاق واسع للتحوير عبر الجهاز العصبي المركزي، أقل آثار خارج الهدف في الأجهزة الطرفية، وانخفاض مستويات الاستجابة المناعية42. ومع ذلك، يتم حقن intrathecal تحديا أكبر بكثير، كما أنها تتطلب مهارات تقنية أعلى من حقن الوريد الذيل.
مزيد من التطوير قفيصه لصقل هذه التكنولوجيا سوف يكون مدفوعا بالفرص المتاحة لاستخدام ناقل إف في تطبيقات العلاج بالجينات. مثل هذا النهج يتيح إمكانيات جذابة لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي حاليا المستعصية، مثل التصلب العضلي الجانبي-شاركو ماري الأسنان المرض والرعاش ومرض الزهايمر18.

على مدى الأعوام الثلاثين الماضية، آفس البرية من نوع قد تم تصميمها لإنشاء ناقلات إف المؤتلف، التي أثبتت أن تكون أدوات مفيدة استثنائية لنقل الجينات في الجهاز العصبي المركزي1،2،،من34، نهج 5،6 والعلاج الجيني للأمراض (بما في ذلك العلاجات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وأيما)4،7. ملاءمتها للاستخدام في الجهاز العصبي المركزي إلى حد كبير مستمد من قدرتها لتصيب خلايا غير تقسيم، بعد انتهاء الانقسامية، وتوجد عادة في الجهاز العصبي المركزي8. ومع ذلك، ناقلات المستندة إلى إف أيضا لديها ميزة السماح بتعبير طويل الأجل لأي4،التحوير علاجية معينة9 مع التماس استجابة المناعية أكثر اعتدالا مقارنة بسائر النواقل الفيروسية7، 8،10،،من1112.
هي العناصر الرئيسية لأي ناقل إف الجينوم وفي قفيصه. يتم آفس البرية من نوع واحد-الذين تقطعت بهم السبل (ss) فيروسات الحمض النووي مع جينوم حوالي 5 كيلوبس (kb)13. لإنتاج ناقلات إف المؤتلف، حذف من جينوم إف البرية من نوع الجينات مندوب و كاب (اللازمة للنسخ المتماثل للجينوم وجمعية قفيصه الفيروسية) وقدمت في ترانس، مما يترك مجالاً يحتوي على14،التحوير15كاسيت التعبير. تسلسل تكرار مقلوب المحطة الطرفية (الإسناد) الجينوم الفيروسي الأصلي هي فقط العناصر المحتجزة في متجه إف، كهذه ضرورية للنسخ المتماثل والتغليف3،،من1014. ويمكن إجراء هندسة عكسية ناقلات إف لتعزيز التعبير التحوير؛ طفرة في واحد من الإسناد يؤدي إلى تشكيل حلقة دبوس الذي يتيح فعالية توليد مكملة الحمض النووي حبلا3،،من715. والميزة الرئيسية لهذا التكوين، تسمى جينوم ذاتي تكميلية (sc)، أنها تتجاوز الحاجة إلى توليف حبلا الثانية النموذجية في دورة الحياة التقليدية من آفس، إلى حد كبير زيادة السرعة ومستويات التعبير التحوير 1. ومع ذلك، استخدام جينوم سكاف يقلل من قدرة البضائع المتجهة إلى 2.4 كيلو بايت تقريبا. وهذا يشمل تسلسل التحوير، فضلا عن أي تسلسل تنظيمي مثل المروجين أو مواقع microRNA الملزمة، للحد من التعبير إلى خلية معينة أنواع16.
يحدد التفاعل خلية ناقل المضيف قفيصه إف ويمنح درجة من انتحاء الخلية نوع أو الأنسجة للنمط المصلي المسيطر إف، التي يمكن أيضا استغلالها للحد من التعبير التحوير إلى مواقع محددة. تم العثور على عدة إف اللقاح في الطبيعة، بينما تم إنتاج أخرى في المختبرات من خلال النهج المؤتلف (أي، بي. ب). وباﻹضافة إلى ذلك، تضفي بعض كابسيدس أيضا الخصائص المفيدة الأخرى، مثل القدرة على عبور BBB، أسفر عن تسليم المتسلسلات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بعد الإدارة النظامية. وقد تبين هذا AAV9، وكذلك لوصف مؤخرا بي إتش بي. قفيصه ب17. نتيجة لذلك، يتم إثبات هذه اللقاح مهمة بصفة خاصة على نهج العلاج بالجينات الجديدة للأعصاب اضطرابات1،،من1718.
والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج الصغيرة نواقل إف مع عيار عالية ونقائه. على الرغم من أن النتائج المعروضة هنا استخدام بي إتش بي. قفيصه ب وكاسيت تعبير سكاف، ومناسبة لإنتاج عدة إف ناقلات اللقاح وتكوينات الجينوم، مما يتيح أقصى قدر من المرونة التجريبية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الغلة المتجهات والنقاء النهائي اعتماداً النمط المصلي المسيطر الذي تم اختياره.
البروتوكول نفسه هو البديل للأسلوب الكلاسيكي ثلاثي-تعداء لإنتاج النواقل الفيروسية ويتضمن استخدام التدرج إيوديكسانول لناقلات تنظيف، التي كانت بالمقارنة مع استخدام التدرجات (CsCl) كلوريد السيزيوم، الكلاسيكية وذكرت لإنتاج ناقلات إف درجة نقاء أعلى في20،،من1921طريقة أكثر كفاءة من حيث وقت.
وتهدف الخطوات تعداء وتنقيتها وتركيز تتم وفقا للممارسات المختبرية الجيدة (GLP) في مختبر زراعة الأنسجة لتصنيفها لعمل النواقل الفيروسية. كل مهمة تحتاج إلى أن يؤديها وفقا للتشريعات المحلية والوطنية ذات الصلة فيما يتعلق بإنتاج النواقل الفيروسية واستخدامها. يجب أن يتم العمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي وفي ظروف معقمة. داخل مرفق ناقلات الأمراض، ينصح بارتداء مئزر مختبر، بالإضافة إلى معطف مختبر زراعة الأنسجة العادية. وعلاوة على ذلك، يجب أن تلبس زوج مزدوجة من القفازات، فضلا عن أوفيرشوس البلاستيكية، في جميع الأوقات.
قبل بدء إنتاج ناقلات الأمراض وضمان جميع المعدات اللازمة وتتوفر والبلازميدات. 1) بكابسيد بلازميد يحتوي على مندوب الجين الذي يشفر أربعة من البروتينات غير الهيكلية اللازمة للنسخ المتماثل، إلا وهي Rep78، Rep68، Rep52، و Rep40، و كاب الجين الذي يشفر ثلاثة بروتينات قفيصه الهيكلية، هما VP1 و VP2 و VP3. 2) فيلبير بلازميد يحتوي على جينات الفئة هاء-2 وهاء-4و خامسا من إتش، مما يسهل إنتاج إف في الخلايا HEK293T. 3) بترانسجيني بلازميد يحتوي على كاسيت التعبير التحوير، يحف به الإسناد اثنين. يمكن أن تكون هذه البلازميدات تجميعي حيثياته في المختبر باستخدام تسلسل متاح على الإنترنت22. والبلازميدات أدلى حيثياته، وبخاصة تلك التي تحتوي على رواية المتسلسلات، تسلسل بالنسبة المطلوبة، للتأكد من أن التحوير والإسناد الصحيحة. وبدلاً من ذلك، يمكن اكتساب والبلازميدات premade مباشرة عن طريق مستودعات بلازميد على الإنترنت. عند الضرورة، يمكن تفصيل والبلازميدات وتنقيته باستخدام مجموعات قياسية، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة23.
عيار المتجهات والنقاء يمكن أن تؤثر سلبا على قدرة توصيل ناقل. يتم توفير بروتوكولات إضافية لتقييم جودة ناقل المنتجة. ناقلات النهائية ستكون مفيدة لإجراء دراسات للدالة cell CNS في تطبيقات في المختبر و في فيفو .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

أدوات توصيل الجينات استناداً إلى فيروسات الغدد المرتبطة (AAVs) خيار شعبي لإيصال المتسلسلات للجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك تطبيقات العلاج الجيني. إف الناقلة عدم تكرار، قادرة على إصابة الفاصل وعدم تقسيم الخلايا وتوفير طويل الأجل التحوير التعبير. الأهم من ذلك، بعض اللقاح، مثل بي إتش بي وصف حديثا. ب، يمكن عبر الدم-الدماغ-الجدار (بي بي بي) في نماذج حيوانية، عقب تسليم الجهازية. يمكن أن تنتج نواقل إف كفاءة في المختبر. ومع ذلك، قوية واستنساخه البروتوكولات مطالبون بالحصول على ناقلات إف مع مستويات النقاء كافية وعيار قيم عالية بما يكفي للتطبيقات في فيفو . ويصف هذا البروتوكول استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج ناقلات إف، استناداً إلى استراتيجية تدرج تنقية إيوديكسانول. طريقة تنقية إيوديكسانول مناسبة للحصول على دفعات ناقلات إف عيار ارتفاع درجة نقاء عالية، عند مقارنتها بأساليب تنقية أخرى. وعلاوة على ذلك، أن البروتوكول عادة أسرع من الطرق الأخرى المذكورة حاليا. وباﻹضافة إلى ذلك، سلسلة بوليميراز كمية رد فعل (qPCR)-يتم وصف الاستراتيجية القائمة على أساس لتحديد عيار ناقلات الأمراض، فضلا عن فضية تلطيخ طريقة سريعة ودقيقة لتحديد نقاء دفعة ناقلات. وأخيراً، نتائج تمثيلية لإيصال الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي، بعد الإدارة النظامية من إف-بي. ب، وترد. يجب أن تكون هذه النتائج الممكنة في جميع مختبرات استخدام بروتوكولات الموضحة في هذه المقالة.

واعتبر AAV9، حتى وقت قريب، لتكون النمط الأكثر فعالية المصلي إف ناقلات المسيطر في عبور بي بي بي وترانسدوسينج خلايا الجهاز العصبي المركزي، بعد الإدارة الطرفية. قد حققت تقدما كبيرا في تصميم قفيصه عند ديفيرمان وآخرون عن استخدام أسلوب اختيار قفيصه تسمى لجنة المساواة العرقية المستندة إلى جزئ تطور استهدفت إف (إنشاء)17. باستخدام هذا الأسلوب، وحددوا من قفيصه جديد، المسمى بي. ب، وأفادوا بأنها قادرة على ترانسدوسي غالبية astrocytes والخلايا العصبية في مناطق متعددة في الجهاز العصبي المركزي، بعد حقن الجهازية17. عند هذه النقطة، فإنه ينبغي أن تكون لاحظت أنه حتى ولو بي إتش بي. ب يوفر نتائج إيجابية في فئران C57/Bl6 (الذي كان الضغط المستخدمة في التجارب الأولية العزلة)، وتفيد التقارير الأولية قد تختلف كفاءتها بطريقة تعتمد على إجهاد. لا شك في أن تجارب أخرى ستلقى المزيد من الضوء على هذه القضية31.
ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه القضايا، بي. ب يوفر إمكانيات مثيرة للتلاعب بالجينات موسع في الجهاز العصبي المركزي الفئران، بما في ذلك تجارب العلاج بالجينات لمفهوم الإثبات في نماذج المرض. على هذا النحو، اخترنا لتقييم كفاءة التعبير التحوير باستخدام بي إتش بي. ب مقابل AAV9، التي كانت متجه "المعيار الذهبي" لتوصيل الجهاز العصبي المركزي عقب الطرفية الإدارة منذ 20092. لإجراء مقارنة مباشرة للقاح على حد سواء، تحت الظروف المثلى للتعبير التحوير، استخدمنا اتفاقية استكهولم جينوم تكوين32. كلا ناقلات إجراء التحوير للبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) تحت سيطرة المروج β-أكتين (CBA) الدجاج في كل مكان. فئران C57/Bl6 الإناث عند الولادة يوم 42 (حوالي 20 غرام في الوزن) تلقي جرعة مقدارها 1 × 1012 vg كل الماوس أما scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل أو scAAV2/9-المصرف المركزي-التجارة والنقل. وكانت إدارة ناقلات المؤداة عن طريق حقن الوريد الذيل. التجارب التي أقرتها "اللجنة الأخلاقية" "وفين كو".
بوستينجيكشن ثلاثة أسابيع، خضع الفئران نضح ترانسكارديال مع برنامج تلفزيوني المثلج، تليها 4% (w/v) بارافورمالدهيد المثلج (منهاج عمل بيجين). كانت تحصد ادمغتهم وخضع المزيد من بوستفيكسيشن قبل حضانة بين عشية وضحاها في مثبت نفسه، قبل نقل إلى 0.01% (w/v) غ-أزيد/برنامج تلفزيوني لتخزين حتى إجراء مزيد من التحليل. بعد ذلك، كانت مقطوع العقول باستخدام مبضع تهتز، وأجرى immunohistochemistry على 50 ميكرومتر سميكة المقاطع.
لتقييم مستويات التعبير التحوير، الأبواب كانت ملطخة بالأجسام المضادة الأولية ضد التجارة والنقل (الأرنب المضادة-التجارة والنقل)، مع الكشف عن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق بصبغة فلورسنت (المضادة أرنب أليكسا فلور 488) (الشكل 4A، ب ). أكدت قياسات كثافة الفلورية (بوحدات التعسفي [الاتحاد الأفريقي]) زيادة كبيرة في التجارة والنقل التعبير عند اتفاقية استكهولم الجينوم وبي إتش بي. وقد استخدمت قفيصه ب بالنسبة AAV9. وقد لوحظت زيادات في التجارة والنقل في المخ (2105 ± 161 مقابل 1441 ± 99 الاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0032)، المخيخ (2601 ± 196 مقابل 1737 ± 135 للاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0032)، وجذع الدماغ (3082 ± 319 مقابل 2485 ± 88 الاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0038) (الشكل 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> الشكل 4: تسليم الجهازية scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل يؤدي إلى تعبير بروتينات فلورية خضراء عالية في الجهاز العصبي المركزي. scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل أو scAAV2/9-المصرف المركزي-التجارة والنقل (1 × 1012 vg/الماوس) تدار على فئران C57/Bl6 عمره 6 أسابيع عن طريق حقن الوريد الذيل. بروتينات فلورية خضراء تم الكشف عن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري في المخ الاكليلية المقاطع 3 أسابيع بوستينجيكشن. (أ) المخ و (ب) ترد في المخيخ وجذع الدماغ. تغيير حجم أشرطة = 1 مم-(ج) أجرى التقدير الكمي كثافات fluorescence النسبي لتحديد مستويات بروتينات فلورية خضراء إشارة تحقق مع كل ناقل (10 أقسام كل الماوس؛ الفئران الثلاثة كل مجموعة المتجهات). وأجرى اختبار ANOVA أحادي اتجاه، يليه-التائي t-اختبار؛ يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري؛ ف < 0.01؛ الاتحاد الأفريقي. وحدات التعسفي. بكابسيد، تستخدم لإنتاج ناقلات إف، يحتوي على الجينات مندوب من النمط المصلي المسيطر 2 و الجينات كاب من النمط المصلي المسيطر بي. ب أو AAV9، وبناء على ذلك. وقد تم تعديل هذا الرقم من رينكون et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

هنا، نحن تصف استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج وعيار ومراقبة الجودة دفعات من نواقل فيروسات الغدد المرتبطة. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على إعداد ناقلات مع ارتفاع عيار (إيه وان × 1013 ناقلات جينومات مليلتر) ودرجة نقاء عالية، جاهزة للاستخدام في المختبر أو في الجسم الحي .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

باتباع هذا البروتوكول، فإن المستخدم تكون قادرة على إنتاج ناقلات AAV من النقاء العالية وغلة مناسبة للتطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج وتنقية مجموعة من الأنماط المصلية AAV مع الاختلافات في التكوينات. يمكن الجمع بين هذين العنصرين يكون مفيداً للحصول على نوع الخلية والتعبير الخاص بالأنسجة.إنتاج بعض الأنماط المصلية يمكن أن تعطي لانخفاض العائد. هذا هو الإنتاج حيث توجد أنماط المصل قريبة وينبغي تقييمها على أساس فردي. إثبات هذه الإجراءات ستكون شيلي فريبونت، فني من مختبرنا.بعد زراعة خلايا HEK ، اخلط 360 ميكروغرامًا من plasmid المساعد ، و 180 ميكروغرامًا من البلازميد ترميز الفلفل المتجه ، و 180 ميكروغرامًا من البلازميد تحتوي على ترانسجين في 18 ملليلتر من كلوريد الصوديوم 150 ملليمولار لإعداد مزيج الحمض النووي. توزيع هذا المزيج على ثلاثة 50 ملليلتر أنابيب المخروطية. في أنبوب مخروطي جديد، اخلط 840 ميكروغرام من جزيرة الأمير إدوارد وستة ملليلترات من كلوريد الصوديوم 150 ملليمولر لإعداد مزيج PEI لستة أطباق ثقافة الخلايا.ثم، إضافة ستة ملليلتر من مزيج PEI، قطرة قطرة، إلى واحدة من الأنابيب المخروطية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة ستة أطباق ثقافة الخلايا من الحاضنة.في غطاء محرك التدفق صفح، pirate تماما المتوسطة من كل طبق. شطف الأطباق مع خمسة ملليلتر من DPBS ساخنة قبل لإزالة آثار المتوسطة. إمالة بلطف كل طبق لضمان DPBS موزعة بالتساوي على السطح بأكمله.ثم، تعرق بلطف DPBS. أضف 12 ملليلتر من DMEM واحد إلى كل طبق ببطء ، مع ماصة توضع على حافة الطبق. اخلطي خليط PEI والحمض النووي عن طريق الخفقان لأعلى ولون ثلاث إلى خمس مرات.إضافة ملليلترين من هذا الخليط إلى كل من الأطباق ثقافة الخلية الستة في قطرة عن طريق الأزياء قطرة، مع التأكد من توزيع بعناية على السطح بأكمله. كرر هذه العملية باستخدام ستة أطباق ثقافة الخلية في وقت حتى تصل إلى 18 طبق ثقافة الخلية. هز بلطف أطباق زراعة الخلايا لتوزيع خليط الحمض النووي PEI.احتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية مع رطوبة 95 في المئة و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. بعد هذا، إضافة 12 ملليلتر إضافية من DMEM 10 إلى كل من الأطباق 18 دون إزالة المتوسطة الموجودة مسبقا. مواصلة احتضان الخلايا المُصابة بالعدوى في نفس الظروف.في 72 ساعة بعد نقل، واستخدام مكشطة الخلية لفصل بعناية الخلايا من كل طبق الثقافة. جمع المتوسطة وخلايا اثنين من أطباق الثقافة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وأبقى على الجليد. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 420 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق مع تسارع وتباطؤ جهاز الطرد المركزي تعيين إلى أقصى حد.تجاهل بعناية المابير من كل أنبوب عن طريق صب بلطف في حاوية التخلص من النفايات. ثم، ضع الأنابيب التي تحتوي على كريات الخلية على الجليد. نحن نعلق كل بيليه في ملليلتر اثنين من العازلة تحلل ومزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا من خمس إلى 10 مرات.سحب AAV من ثلاثة أنابيب، معا. للبدء ، تجميد الخلايا التي أعيد تعليقها عن طريق وضعها في دلو يحتوي على الجليد الجاف الممزوج بالإيثانول. ثم ذاب الخلايا عن طريق وضعها على الفور في حمام مائي تعيين في 37 درجة مئوية.كرر هذا التجميد وذوبان دورة ثلاث مرات لlyse الخلايا والإفراج عن جزيئات AAV. وبعد خطوة الذوبان الثالثة، بلغ عدد أجهزة الطرد المركزي 1167 مرة في G، وبأربعون درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل بعناية سراويل لتنظيف أنابيب مخروطية 50 ملليلتر.إضافة النوى إلى كل أنبوب إلى تركيز النهائي من 50 وحدة لكل ملليلتر من افر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، في حين يحوم الأنابيب كل 10 دقائق لضمان أن يتم خلط النوى تماما مع المابير. أجهزة الطرد المركزي في 13490 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتوضيح فائقة.بعد هذا، إزالة المكبس من حقنة 10 ملليلتر، إرفاق مرشح ميكرومتر 0.45 إلى الحقنة ووضعها على رأس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة. ملء بعناية حقنة مع اضحة فائقة. استخدام المكبس لفرض lysate من خلال عامل التصفية.بعد ذلك، قم بإعداد كل جزء من كسور الوديكسول في أربعة أنابيب مخروطية منفصلة 50 ملليلتر، كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص. Pipette ثمانية ملليلتر من 15 في المئة iodixanol في كل من الأنابيب الثلاثة فائقة التركيز. Pipette 5.5 ملليلتر من 25 في المئة iodixanol في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة.باستخدام ماصة باستور غير المتخرجة، طبقة بعناية 5.5 ملليلتر من 25 في المئة حل iodixanol تحت محلول iodixanol 15 في المئة. إضافة حلول 40 بالمائة و 60 بالمائة كما هو موضح في بروتوكول النص. وينبغي أن كسور Iodixanol لا تتشابك على طبقات.باستخدام ماصة باستور، طبقة lysate الخام على رأس 15 في المئة iodixanol الانحدار، قطرة قطرة، لتجنب إزعاج الواجهة بين lysate الخام وحل iodixanol. ملء كل أنبوب الطارد فائقة مع عازلة التحلل حتى الغضروف المفصلي يصل إلى قاعدة الرقبة أنبوب، لضمان أنبوب لا تنهار تحت القوى العالية جدا ولدت أثناء الطاردة المفرطة. أغلق الأنابيب باستخدام الأغطية المناسبة.باستخدام مقياس رقمي، تأكد من أن جميع أنابيب الطرد الفائق التركيز الثلاثة لها نفس الوزن. ضبط الوزن حسب الضرورة، عن طريق إضافة المزيد من العازلة تحلل على رأس lysate الخام. استخدام زاوية ثابتة التيتانيوم الدوار إلى الطرد المركزي الأنابيب في 301580 مرات G و 12 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة و 40 دقيقة باستخدام أقصى تسارع والتباطؤ.بعد ذلك، قم بتوصيل إبرة بحقنة خمسة ملليلتر. إزالة المسافة من الأنابيب في الدوار، واستعادة الأنابيب بعد الطرد المركزي. التعرق فقط 40 في المئة iodixanol كسر الذي يحتوي على جزيئات ناقلات.إما معالجة العينة أو تخزينها عند أربع درجات مئوية. هنا، يتم إثبات بروتوكول يمكن استخدامه لإنتاج ناقلات AAV مع مجموعة متنوعة من الفلفلات، وتكوينات الجينوم، وأنواع المروج، والبضائع transgene. في هذا المثال، أنتجنا وطهرنا ناقلين مختلفين من AAV عبّر عن البروتين الفلوري الأخضر من جينوم ذاتي مجاني.وتتميز ناقلات اثنين من قبل capsids مختلفة: PHPB وAV9. تم تسليمها، عن طريق حقن الوريد الذيل، إلى الفئران الستة السوداء البالغة C57. لتقييم مستويات التعبير عبر جيني ثلاثة أسابيع بعد الحقن، وتلطخت المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية ضد GFP مع الكشف عن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى صبغة الفلورسنت.قياسات كثافة الفلوريسنس تظهر زيادة كبيرة في تعبير GFP عند استخدام متجه PHPB نسبة إلى AAV9. ولوحظت زيادات في GFP في المخ، المخيخ، وفي جذع الدماغ. جمع دقيق من ناقلات تحتوي على كسر أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول.في حالة عدم القيام بذلك بشكل صحيح، تتأثر بشكل سلبي العائد المتجه وكذلك نقاء المتجه. كونها قادرة على إنتاج ناقلات AAV، مختبرات صغيرة ستكون في وضع يمكنها من الاستفادة من العديد من الاحتمالات التجريبية لتقديم الجينات في الجهاز العصبي المركزي. يتطلب هذا البروتوكول استخدام الطرد الفائق التركيز ومن المهم الحصول على التدريب المناسب قبل التعامل مع هذا من أجل تجنب الحوادث.وعلاوة على ذلك، غالبا ما تصنف ناقلات AAV على أنها تشكل مهاجزات بيولوجية، ولذلك، يجب عليك الرجوع إلى اللوائح المحلية قبل التعامل معها وإدارتها.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

في Ovo نموذجية لاختبار مركبات الأنسولين ميميتيك

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

الحمل الحراري تعزيز التسليم من ناقلات الفيروسية المرتبطة الغدينو البصريات إلى قشرة ريسوس Macaque تحت توجيه الصور بالرنين المغناطيسي على الانترنت

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: منصة ألعاب قائمة على التحكم في العجلات لدراسة التحكم في التحكم في الحواس

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...