Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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m. r. 得到 fonds voor wet偶然 jk onderzoek vlaanderen (fwo) 博士后研究金 (133222/204517n) 的支持, 并感谢哥伦比亚心血管基金会和科学管理局的持续支持,技术与创新 (赠款 ct-ff442-307-2016, 项目代码 56671250485)。m. m. 由 fwo 博士奖学金 (1S48018N) 资助。m. g. h. 得到了 thib 机构赠款和外部支助, 该基金会得到了 thierry latran 基金会 (sod-vi)、阿尔茨海默研究基金会 (sao-fra) (P#14006)、fwo (赠款 1513616n) 和欧洲研究理事会 (启动赠款) 的外部支持 (启动赠款)281961-astrofonc;概念证明书 713755-ad-vip)。提交人感谢 jeason hahton 在老鼠饲养方面的帮助, 斯蒂芬妮·卡斯塔尔多帮助她进行尾静脉注射, 并感谢 caroline eykens 提供转染 hek293t 细胞的图像。m. g. h. 承认 michael dunlop、peter hickman 和 dean harrison。

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作者没有什么可透露的。

这里描述的重组 aav 载体的生产使用了大多数分子生物学实验室和细胞培养设施共有的材料和设备。它允许用户获得纯的、临床前级的 aav 载体, 可用于针对一系列体外和体内应用中的多个细胞和组织类型. 与其他协议相比, 该协议的最大优点之一 (即基于 CsCl-based 的纯化) 是所需的工作时间较短。在 hek293t 细胞的初始转染后, 可在最多6个工作日内获得即用 aav 矢量。
有几个因素会对 aav 矢量的最终产量或质量产生负面影响。转染效率低是病毒产率低的主要原因之一.一个主要的建议是使用 hek293t 细胞, 这些细胞在转染21时没有经过20多次以上的传代, 细胞融合也没有超过90%。此外, 所选择的转染方法对结果有重大影响。此协议基于 pei 的使用。pei 是一种阳离子聚合物, 能够通过生成聚合物和核酸 (称为多团) 的复合物将外源 dna 传递到细胞核中, 这些复合物被细胞吸收并通过内皮体34进行贩运.与其他广泛使用的方法相比, 基于 pei 的转染操作简单、快速, 例如 dna 与磷酸钙 35的共沉淀。此外, 与其他新引入的方法 (如阳离子脂和磁介导转染 36) 相比, 基于 pei 的转染要便宜得多。
净化策略在协议中发挥着关键作用。与其他方法相比, 碘合醇基纯化往往含有较高比例的空病毒颗粒 (20%)20。这在一定程度上被基于碘素的纯化通常导致 aav 载体制剂的颗粒与传染性比小于100而抵消。与传统的基于 csl 的程序相比, 这是一个重大的改进, 据报告, 传统的粒子传染性损失很大,37。纯化 aav 载体的另一种常见替代方法是基于色谱的纯化。但是, 此方法的主要缺点是, 使用的每个向量 catid 都需要一个特定的列: 例如, 虽然 aav2 使用肝素列进行了经典隔离, 但此方法不适用于不具有肝素结合的 aav4 和 aav5在他们的反复无常38网站。考虑到色谱纯化也很昂贵, 碘化醇基纯化通常更适合希望生产小规模 aav 载体的实验室33、39、40. 然而, 为了最大限度地提高载体的最终产率和纯度, 在制作碘化醇梯度时需要格外小心。各种碘化醇馏分应转移到超离心管使用无菌巴斯德移液器, 其尖端接触管壁: 碘沙诺应缓慢而连续地从移液器中排出。当矢量颗粒积累在40% 碘沙诺层, 需要注意确保梯度接口不混合20。最后, 应通过插入一个不超过 20 g 的不锈钢钝针来回收含有矢量的分数。为了最大限度地恢复矢量, 应完整地检索清除分数。在此步骤中, 计时至关重要。为了避免影响制剂的纯度, 必须在收集梯度的其他 (污染) 阶段之前停止收集。
所得到的矢量滴度的差异也可归因于矢量产生包状粒子的内在能力。不同 aav 血清型的比较表明, 一些 aav 载体在更高的滴度下更难产生 (例如 aav2)41。在脱盐步骤中, 矢量的沉淀可能是滴度较低的一个可能原因, 通过避免过度集中33很容易防止.此外, 还可以观察到, 在血清型之间, 碘二醇梯度基纯化的效率略有不同, 因此, 可以观察到不同血清型获得的滴度的差异41。
最后, 需要指出的是, 尽管 qpcr 是 dna 定量的一种非常准确的方法, 但可以观察到该技术中的一些固有的可变性。滴定的准确性主要取决于所有溶液的精确移液和适当的涡流。为了保证最精确的滴度读数, qpcr 可以独立重复, 得到的值是平均的。该方案中介绍的引物的选择是基于位于我们实验室使用的 pTransgene 质粒中的 cba 启动子的序列。cba 启动子是一个强大的合成启动子, 广泛用于向量场, 以推动表达跨多个细胞类型。它包含多种元素, 包括巨细胞病毒 (cmv) 早期增强因子;cba 基因的启动子、第一外显子和第一内含子;以及兔β-球蛋白基因的接合受体。然而, 引物可以设计用于几乎任何元素的表达盒内 (包括启动子, 转基因, 和调节元素)。还可以对批次的滴度进行比较, 前提是对有关载体共有的区域使用引物。
总之, 该协议可用于产生具有多种脂质、基因组配置、启动子类型和转基因货物的 aav 载体。这将使用户能够轻松地调整其矢量的最终特征, 以最适合实验需求。在代表性结果中介绍的示例中, php 的使用。b 衣壳有效地穿过 bbb, 在尾静脉注射32只后, 在中枢神经系统中得到了高效的基因表达。中枢神经系统渗透载体的系统管理在可能的副作用2、17、32方面具有相当大的优势。外周注射的一个可能的替代方法是鞘内注射, 它包括将 aav 载体输送到脑脊液中。这种传递途径被证明是有效的, 显示了转基因在中枢神经系统的广泛表达, 外周器官的非目标效应较小, 免疫反应水平较低.然而, 鞘内注射更具挑战性, 因为他们需要比尾巴静脉注射更高的技术技能。
进一步的准备工作, 以完善这一技术, 将推动 aav 载体在基因治疗应用中的应用机会。这种方法为治疗目前无法治愈的中枢神经系统疾病提供了有吸引力的可能性, 如肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿病、帕金森症和阿尔茨海默氏症18。

在过去的30年里, 野生类型的 aav 被设计成创建重组的 aav 载体, 这些载体已被证明是将基因转移到 cns1、2、3、4、 5,6和基因治疗方法的疾病 (包括 fda 和 ema 批准的疗法)4,7。它们在中枢神经系统中的适用性在很大程度上来自于它们感染非分裂、有丝分裂后细胞的能力, 这些细胞通常存在于中枢神经系统8中。然而, 基于 aav 的载体也有一个优势, 即允许任何特定治疗性转基因 4、9 的长期表达, 同时与其他病毒载体7相比, 能引起较温和的免疫反应, 8、10、11、12。
任何 aav 载体的主要元素都是基因组和衣壳。野生 aav 是单链 dna 病毒, 基因组约为5千基 (kb)13。对于重组 aav 载体的生产,代表和盖帽基因 (用于基因组复制和病毒 calsid 的组装所必需的) 从野生类型 aav 的基因组中删除, 并以反式方式提供, 为含有转基因14,15的表达盒。原始病毒基因组的倒置末端重复序列 (itr) 是 aav 载体中唯一保留的元素, 因为这些元素对于复制和包装3、10、14至关重要。aav 载体可以被设计来增强转基因表达;其中一个 itr 中的突变导致一个发夹循环的形成, 有效地允许生成一个互补的 dna 链3,7,15。这种称为自我互补 (sc) 基因组的结构的主要优点是, 它绕过了 aav 常规生命周期中典型的二线合成的需要, 大大提高了转基因表达的速度和水平1. 然而, 使用 scaav 基因组将载体的货运能力降低到约 2.4 kb。这包括转基因序列, 以及任何调节序列, 如启动子或微 rna 结合位点, 以限制表达到特定的细胞类型16。
aav 衣壳确定了载体-宿主细胞的相互作用, 并赋予 aav 血清型一定程度的细胞类型或组织取向, 这也可以被用来限制转基因表达到特定的位置。在自然界中发现了几种 aav 血清型, 而另一些是通过重组方法 (即 php) 在实验室生产的。此外, 一些船长还赋予其他有用的特征, 如穿越 bbb 的能力, 导致在系统给药后在整个中枢神经系统中传递转基因。这已经为 aav9 以及最近描述的 php 展示了这一点。b 衣帽17。因此, 这些血清型被证明与神经退行性疾病的新基因治疗方法特别相关,1、17、18.
该协议的目的是描述一种具有成本效益的方法, 用于小规模生产具有较高滴度和纯度的 aav 矢量。虽然这里介绍的结果使用 php。b 衣壳和 scaav 表达盒, 该协议适用于生产几种 aav 载体血清型和基因组配置, 具有最大的实验灵活性。然而, 矢量产率和最终纯度可能因选择的血清型而异。
该协议本身是用于病毒载体生产的经典三转染方法的一个变种, 并结合了在载体清理中使用碘沙诺梯度的方法, 与传统上使用氯化铯 (cscl) 梯度相比, 该梯度已被采用了报告以更省时的方式产生纯度更高的 aav 载体19、20、21。
转染、纯化和浓缩步骤打算根据良好的实验室实践 (glp) 在一个组织培养实验室进行, 该实验室的活性受到病毒载体工作的评价。每项任务都需要按照有关病毒载体生产和使用的相关地方和国家立法执行。工作必须在层流罩下和无菌条件下进行。在矢量设施内, 除了常规的组织培养实验室外套外, 还建议佩戴实验室围裙。此外, 任何时候都应戴双手套以及塑料套鞋。
在开始矢量生产之前, 请确保提供所有必要的设备和质粒。1) pcapsid 质粒包含编码复制所需的四种非结构蛋白的代表基因, 即 rep78、rep68、rep52 和 rep40, 以及编码三种结构衣壳蛋白 (vp1、vp2 和 vp3) 的盖帽基因。2) 助流素质粒中含有腺病毒的 e4、e2a和va基因, 促进了 hek293t 细胞中 aav 的产生。3) pTransgene 质粒含有两个 itr 的转基因表达盒。这些质粒可以在实验室中使用在线提供的序列重新合成 22.对于新制造的质粒, 特别是那些含有新转基因的质粒, 需要进行测序, 以确保转基因和 itr 是正确的。另外, 预制质粒可以通过在线质粒存储库直接获得。必要时, 可根据制造商的说明23使用标准试剂盒对质粒进行放大和纯化。
矢量滴度和纯度会对病媒的传导能力产生不利影响。提供了其他协议来评估所产生的矢量的质量。最终载体将有助于中枢神经系统细胞功能的体外和体内应用研究。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

基于腺病毒相关病毒 (aav) 的基因传递工具是将转基因传递到中枢神经系统 (cns) 的热门选择, 包括基因治疗应用。aav 载体是不可复制的, 能够感染分裂和非分裂细胞, 并提供长期的转基因表达。重要的是, 一些血清型, 如新描述的 php。b, 在系统分娩后, 可以在动物模型中跨越血脑屏障 (bbb)。aav 矢量可以在实验室中高效地产生。然而, 需要可靠和可重复的协议来获得纯度水平足够高的 aav 载体, 并获得足够高的滴度值, 以满足体内的应用。该协议描述了一种基于碘沙诺梯度纯化策略的 aav 矢量生产的高效、可重现的策略。与其他纯化方法相比, 碘沙诺纯化方法适用于获得成批的高纯度高滴度 aav 载体。此外, 该协议通常比目前描述的其他方法更快。此外, 还描述了一种基于定量聚合酶链反应 (qpcr) 的策略, 用于快速、准确地测定矢量滴度, 以及银染色方法来确定矢量批次的纯度。最后, 在对 aav-php 进行系统管理后, 向中枢神经系统传递基因的代表性结果。b, 被介绍。在使用本文中描述的协议的所有实验室中, 这样的结果都应该是可能的。

直到最近, aav9 还被认为是继外围给药后, 在穿越 bbb 和转移中枢神经系统细胞方面最有效的 aav 载体血清型。当 deverman 等人报告使用了一种名为 cre 重组的基于 aav 靶向进化 (create) 17 的衣帽材选择方法时, 在衣帽口设计方面取得了重大进展。使用这种方法, 他们确定了一个新的 capsid, 名为 php。b, 他们报告说, 它能够在多个中枢神经系统区域中的星形胶质细胞和神经元中通过, 在全身注射17。在这一点上, 应该注意的是, 即使 php。b 在 c57/bl6 小鼠 (这是最初隔离实验中使用的菌株) 中提供了积极的结果, 初步报告表明, 它的效率可能因应变依赖而有所不同。毫无疑问, 进一步的实验将使人们对这一问题有更多的了解。
然而, 尽管存在这些问题, php。b 为小鼠中枢神经系统的无创基因操作提供了令人兴奋的可能性, 包括疾病模型中的概念验证基因治疗实验。因此, 我们选择使用 php 来评估转基因表达的效率。b对aav9, 自2009年以来, aav9 一直是继外围管理之后的中枢神经系统传导的 "金本位" 载体。为了对这两种血清型进行直接比较, 在转基因表达的最佳条件下, 我们使用了 sc 基因组配置32。这两个载体都在无处不在的鸡β-肌动蛋白 (cba) 启动子的控制下携带绿色荧光蛋白 (gfp) 的转基因。女性 c57/bl6 小鼠在产后第42天 (体重约20克) 接受了 1 x 10 12 vg的剂量。b-cba-gfp 或 scaav间或9-cb-gfp。尾静脉注射进行病媒给药。这些实验得到了 ku leuven 道德委员会的批准。
注射三周后, 小鼠接受冰凉 pbs 的心肺灌注, 其次是4% 的冰凉二聚甲醛 (pfa)。他们的大脑被收获, 并通过在同一固定剂的隔夜孵育进行进一步的后固定, 然后转移到 0.01% (w/v) Na-azide/PBS 储存, 直到进一步分析。然后, 用振动微体对大脑进行切片, 并在50μm 厚的切片上进行免疫组织化学。
为了评估转基因表达的水平, 用初级抗体对 gfp (兔抗 gfp) 染色, 并使用与荧光染料 (抗家兔亚历克莎氟化物 488) 结合的二级抗体进行检测 (图4 a, b).荧光强度测量 (任意单位 [au]) 证实, 当 sc 基因组和 php 时, gfp 表达显著增加。b 衣壳相对于 aav9 使用。在大脑中观察到 gfp 的增加 (2205±161 对 1441±99 au;p = 0.0032), 小脑 (2601 ±196 vs . 1734±135 au;p = 0.0032) 和脑干 (3082±319 vs. 2485±88 au;p = 0.0038) (图 4c)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> 图 4: 系统交付的 scAAV2/PHP。b-cba-gfp 导致 cns 中的 gfp 表达率很高。php。对6周大的 c57/bl6 小鼠进行了 b-cba-gfp 或 scAAV2/9-CBA-GFP (1 x10 12 vg/micp") 的应用。在注射后3周的冠状脑切片上, 使用免疫组织化学检测 gfp。(a) 显示大脑和 (b) 小脑和脑干。标度条 = 1 毫米 (c) 对相对荧光强度进行量化, 以确定每个矢量达到的 gfp 信号水平 (每只小鼠10个部分; 每个向量组3个小鼠)。进行了单向方差分析测试, 随后进行了双尾学生 t 测试; 数据表示为均值±标准偏差;* *p < 0.01;金。任意单位。用于 aav 载体生产的 pcapsid 包含了来自血清型2的基因代表和来自血清型 php 的基因帽。b 或 aav9, 相应。这一数字已从 rincon 等人32人处修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

与腺相关病毒的向量的生产、纯化和质量控制

在这里, 我们描述了一种高效和可重现的策略, 用于生产、滴度和质量控制批次的腺病毒相关病毒载体。它允许用户获得高滴度 (≥1 x10 13 载体基因组) 和高纯度的载体制备, 可在体外或体内使用。

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

通过遵循此协议，用户将能够生产高纯度的 AAV 向量，并生产适合体外或体内应用的 AAV 载体。该协议可用于生产和纯化一系列配置差异的 AAV 血清型。结合这两个元素对于获得细胞类型和组织特异性表达非常有用。生产一些血清型可以给较低的产量。这是生产，有密切的血清型，应该单独评估。展示这些程序的将是雪莉弗里蓬特，一个技术人员从我们的实验室。生长 HEK 细胞后，混合 360 微克的帮助质粒、180 微克质粒编码向量帽，以及 180 微克含有转基因的质粒，在 18 毫升 150 毫摩尔氯化钠中准备 DNA 混合物。将这种混合物分布在三个 50 毫升锥形管上。在一个新的锥形管中，混合840微克PEI和6毫升150毫摩尔氯化钠，为六个细胞培养皿准备PEI混合物。然后，将六毫升的PEI混合物，滴滴，到含有DNA混合物的锥形管之一。在室温下孵育20分钟。接下来，从培养箱中取出六个细胞培养皿。在层流罩中，从每道菜中完全吸出介质。用五毫升预热的 DPBS 冲洗盘子，以去除介质的痕迹。轻轻倾斜每个盘，以确保 DPBS 均匀分布在整个表面上。然后，轻轻地吸吸 DPBS。在每道菜中缓慢加入12毫升DMEM，在菜边放置一个移液器。混合PEI和DNA混合物，通过上下移液三到五次。以滴滴的方式将这种混合物的两毫升添加到六个细胞培养皿中，确保小心地将其分布到整个表面上。一次使用六个细胞培养皿重复此过程，直到达到 18 个细胞培养菜。轻轻摇动细胞培养皿以分配PEI DNA混合物。在37摄氏度下孵育转染细胞，湿度为95%，二氧化碳为5%，为5小时。在此之后，在18个菜中每个菜中再加12毫升DMEM 10，而不去除预先存在的介质。在相同的条件下继续孵育转染的细胞。在转染后72小时，使用细胞刮刀小心地将细胞从每个培养皿中分离出来。在15毫升圆锥管中收集两个培养皿的培养皿的培养和细胞，保存在冰上。在 420 倍 G 和 4 摄氏度下将管离心 10 分钟，离心机的加速和减速设定为最大值。小心地将上流液从每管中丢弃，轻轻将其倒入废物处理容器中。然后，将含有细胞颗粒的管子放在冰上。我们将每个颗粒悬浮在两毫升的解液缓冲液中，通过上下移液 5 到 10 次混合。将 AAV 从三个管子中拉出，一起。首先，将重新悬浮的细胞放入含有与乙醇混合的干冰桶中，将其冷冻。然后立即将细胞放在37摄氏度的水浴中，解冻细胞。重复此冻结和解冻循环三次，以融化细胞并释放 AAV 颗粒。第三次解冻步骤后，离心机在1167倍G和4摄氏度15分钟。小心地转移超自然剂以清洁 50 毫升锥形管。将核酸酶添加到每根管中，最终浓度为每毫升上一毫升50单位。在37摄氏度下孵育30分钟，同时每10分钟旋转一次管子，以确保核酸酶与上清液彻底混合。在13490倍G和4摄氏度的离心机20分钟，以澄清上清。在此之后，取出 10 毫升注射器的柱塞，将 0.45 微米过滤器连接到注射器上，并将其放在干净的 50 毫升锥形管上。小心地用澄清的上一位液填充注射器。使用柱塞强制通过过滤器的 lysate。接下来，在四个独立的50毫升圆锥管中准备每个碘异醇馏分，如文本协议表之一所述。将8毫升15%的碘糖醇放入三个超离心管中。将 5.5 毫升的 25% 碘异醇放入干净的 50 毫升锥形管中。使用非分级巴斯德移液器，在 15% 的碘异醇溶液下小心地将 5.5 毫升的 25% 碘异醇溶液层下。添加文本协议中描述的 40% 和 60% 的解决方案。碘异醇分数不应在分层上混合。使用巴斯德移液器，将粗液酸盐层对15%的碘盐梯度进行分层，一滴一滴地，以避免干扰粗液酸盐和碘盐溶液之间的界面。将每个超离心管填充开解缓冲液，直到半月板到达管颈底部，以确保管在超离心过程中产生的极高力下不会坍塌。使用适当的盖子关闭管子。使用数字刻度，确保所有三个超离心管具有相同的重量。必要时调整重量，在粗液解体上添加更多的解液缓冲液。使用固定角度钛转子，在 301580 倍 G 和 12 摄氏度下用最大加速和减速将管离心 1 小时 40 分钟。接下来，将针头连接到五毫升注射器上。从转子中的管子上拆下气塞，并在离心后回收管。只吸吸含有矢量粒子的40%碘盐分数。处理样品或将其存放在摄氏四度。在这里，演示了一个协议，可用于生产具有各种帽、基因组配置、启动子类型和转基因货物的 AAV 载体。在此示例中，我们生成并纯化了两种不同的 AAV 载体，这些载体表示来自自免费基因组的绿色荧光蛋白。这两个向量由不同的大写字母区分：PHPB 和 AAV9。他们通过尾静脉注射被送到成年C57黑六只小鼠体内。为了评估注射三周后的转基因表达水平，各部分染色有针对GP的初级抗体，使用与荧光染料结合的二级抗体进行检测。荧光强度测量显示，当使用 PHPB 矢量相对于 AAV9 时，GFP 表达式显著增加。在脑、小脑和脑干中观察到GP的增加。准确收集包含分数的矢量对于此协议至关重要。如果这样做不正确，矢量产量以及矢量纯度将受到不利影响。由于能够产生AV载体，小型实验室将能够利用许多实验可能性在中枢神经系统中传递基因。该协议要求使用超离心水，并且必须在处理此操作之前接受适当的培训，以避免事故。此外，AAV病媒通常被归类为生物危害，因此，在处理和管理它们之前，您应该参考当地法规。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

颅内注射腺相关病毒载体

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

科研

神经科学

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

从中枢神经系统转导细胞的慢病毒载体生产

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9（AAV9）载体递送

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

腺相关病毒对大鼠的静脉管理方法和技巧及中枢神经系统转导的评价

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

腺相关病毒和共聚焦显微镜对器官脑切片胶质细胞器的可视化和实时成像

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

用于测试胰岛素模拟化合物的蛋模型

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

腺相关病毒介导的脊髓基因神经元的转基因表达

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

重组腺相关病毒在成年小鼠中的直接注射

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

在在线 MRI 图像的指导下,对流增强将视遗传阿德诺相关病毒载体输送到 Rhesus Macaque 的皮质

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

轮式康：一个基于车轮控制的游戏平台，用于研究人类传感器运动控制

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...