Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

M.R. understøttes af en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoc stipendium (133722/1204517N) og for kontinuerlig støtte af Fundación hjerte-kar-de Colombia og den Administrative afdeling for videnskab, Teknologi og Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkode 656671250485). M.M. er understøttet af et CVE ph.d.-stipendium (1S48018N). M.G.H. blev støttet af en VIB institutionelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), The Foundation for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det Europæiske Forskningsråd (ERC) (starter Grant 281961 - AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 - annonce-VIP). Forfatterne anerkender Jeason Haughton for hans hjælp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hendes hjælp udfører hale vene injektioner og Caroline Eykens for at levere billeder af transfekteret HEK293T celler. M.G.H. erkender Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Produktionen af rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruger materialer og udstyr, der er fælles for de fleste molekylærbiologiske laboratorier og celle kultur faciliteter. Det tillader brugeren at få ren, prækliniske grade AAV vektorer, der kan bruges til at målrette flere celle og væv typer på tværs af en vifte af in vitro- og i vivo applikationer. En af de største fordele af denne protokol, i forhold til andre (dvs. CsCl-baserede rensning), er kortere arbejdstid behov. Klar-til-brug AAV vektorer er opnåelige i højst 6 arbejdsdage efter den indledende Transfektion af HEK293T celler.
Flere faktorer kan negativt påvirke det endelige udbytte eller kvaliteten af AAV vektor. Dårlig Transfektion effektivitet er en af hovedårsagerne til en lav viral udbytte33. En stor anbefaling er brugen af HEK293T celler, der ikke har været passaged mere end 20 gange og har ikke en celle sammenløbet større end 90% på tidspunktet for Transfektion21. Derudover har Transfektion valgte metode stor indflydelse på resultaterne. Denne protokol er baseret på anvendelse af PEI. PEI er en kationiske polymer med evnen til at levere eksogene DNA til cellekernen gennem generation af komplekser af polymer og nukleinsyre, kendt som polyplexes, som er overtaget af celle og trafikerede via endosomes34. PEI-baserede Transfektion er nemt og hurtigt at udføre, i modsætning til andre almindeligt anvendte metoder, såsom DNA udfældes sammen med calcium fosfat35. PEI-baserede Transfektion er også meget billigere i forhold til andre nyindførte metoder, såsom brugen af kationiske lipider og magnet-medieret Transfektion36.
Rensning strategi spiller en nøglerolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserede purifications har tendens til at indeholde en højere procentdel af Tom viruspartikler (20%)20. Dette opvejes til en vis grad af den omstændighed, at iodixanol-baserede rensning rutinemæssigt resulterer i AAV vektor præparater med en partikel til smitteevne ratio på mindre end 100. Dette udgør en betydelig forbedring i forhold til konventionelle CsCl-baserede procedurer, som er betydeligt tab af partikel smitteevne rapporteret37. En anden fælles alternativ metode til at rense AAV vektorer er kromatografi-baserede rensning. Denne metode har dog den store ulempe, at en bestemt kolonne er påkrævet for hver vektor kapsid bruges: for eksempel, mens AAV2 er klassisk isoleret ved hjælp af heparin kolonner, denne metode virker ikke med AAV4 og AAV5, som ikke besidder heparin-binding Steder på deres capsids38. I betragtning af at kromatografi rensning er også dyrt, er iodixanol-baserede rensning generelt mere egnet til laboratorier, der ønsker at producere høj kvalitet partier af AAV vektorer på en lille skala33,39, 40. for at maksimere det endelige udbytte og renhed af vektoren, extreme care er dog nødvendigt når du foretager iodixanol forløb. De forskellige iodixanol fraktioner skal overføres til ultracentrifugering røret ved hjælp af en steril Pasteur pipette hvis spids er rørende mur af røret: iodixanol bør bortvises fra pipetten, langsomt og konstant. Som vektor partikler ophobes i 40% iodixanol lag, skal pleje tages for at sikre, at grænsefladerne gradient ikke blander20. Endelig, den brøkdel, som indeholder vektoren bør inddrives ved indsættelse af en rustfrit stål stump nål med en måler ikke større end 20 G. For at maksimere vektor opsving, skal den klare fraktion hentes i sin helhed. Under dette trin er timing afgørende. For at undgå at gå på kompromis med renheden af forberedelsen, er det vigtigt at stoppe samlingen, før andre (kontaminerende) faser af forløbet er indsamlet.
Forskelle i den fremkomne vektor titer kan tilskrives også vektoren iboende evne til at producere emballerede partikler. En sammenligning mellem forskellige AAV serotyper viste, at nogle AAV vektorerne er sværere at producere på en højere titer end andre (f.eks. AAV2)41. Udfældning af vektoren, under trinnet udvanding kan være en mulig årsag til en lavere titer og forhindres nemt ved at undgå overkoncentration33. Derudover er det også muligt, at effektiviteten af iodixanol gradient-baserede rensning lidt varierer mellem serotyper, og derfor, forskelle i titer fås med forskellige serotyper kan observeres41.
Endelig skal det påpeges, at selv om qPCR er en meget præcis metode til DNA kvantificering nogle iboende variabilitet i teknikken kan observeres. Nøjagtighed i titreringen afhænger primært præcis pipettering og korrekt vortexing af alle løsninger. For at garantere den mest nøjagtige titer læsning, qPCR uafhængigt kan gentages, og de opnåede værdier i gennemsnit. Valget af primere præsenteret i denne protokol er baseret på rækkefølgen af CBA initiativtageren beliggende i pTransgene plasmid brugt i vores laboratorium. CBA promotor er en stærk syntetiske promotor, som er meget udbredt i feltet vektor at drive udtryk på tværs af flere celletyper. Det indeholder flere elementer, herunder cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; initiativtageren, første exon og den første intron af CBA gen; og splejsning acceptoren af kanin β-globin genet. Men primere kan være konstrueret til stort set ethvert element, som ligger i udtrykket kassette (herunder promotor, transgene og regulerende elementer). Sammenligning af titer på tværs af partier er også muligt, at yde primere bruges mod regioner fælles for de pågældende vektorer.
Til sidst, kan denne protokol bruges til at producere AAV vektorer med en række capsids, genom konfigurationer, promoter typer og transgen laster. Dette vil tillade brugere at nemt tilpasse de endelige egenskaber ved deres vektorer der passer bedst til eksperimentelle behov. I eksemplet præsenteres i de repræsentative resultater, brugen af PHP. B kapsid, som effektivt krydser BBB, gav højeffektive genekspression i CNS, følgende hale vene injektion32. Systemisk administration af CNS penetrant vektorer har betydelige fordele i form af mulige bivirkninger2,17,32. Et muligt alternativ til perifere injektion, samtidig undgå forbehold af invasive teknikker, er Intratekal levering, som består af levering af AAV vektor i cerebrospinalvæsken. Denne leveringsbetingelser rute er vist sig for at være effektiv, viser udbredt udtryk af transgenet i hele CNS, mindre off target effekter i perifere organer, og lave niveauer af immunrespons42. Intratekal injektioner er dog meget mere udfordrende, da de kræver højere tekniske færdigheder end halen vene injektion.
Kapsid videreudvikling at forfine denne teknologi vil blive drevet af mulighederne for AAV vektor brug i gen terapi programmer. Sådanne tilgange tilbyde attraktive muligheder for at behandle i øjeblikket uhelbredelig CNS lidelser, såsom Amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom, Parkinsons og Alzheimers sygdom18.

I de sidste 30 år, er wild-type AAVs blevet manipuleret til at oprette rekombinant AAV vektorer, som har vist sig for at være usædvanligt nyttige værktøjer til genoverførsel i CNS1,2,3,4, 5,6 og gen terapi tilgange til sygdom (herunder godkendt af FDA og EMA terapier)4,7. Deres egnethed til brug i CNS stammer i vid udstrækning fra deres evne til at inficere ikke dividere, post mitotiske celler, der typisk findes i CNS8. Men AAV-baserede vektorer har også fordelen, at en langsigtet udtryk for enhver given terapeutiske transgen4,9 mens fremkalde en mildere immunrespons i forhold til andre virale vektorer7, 8,10,11,12.
De vigtigste elementer i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Wild-type AAVs er enkeltstrenget (ss) DNA virus med en genom ca 5 kilobases (kb)13. For produktion af rekombinant AAV vektorer, rep og cap gener (nødvendigt for genom replikering og samling af viral kapsid) er slettet fra genomet af vildtype AAV og leveres i trans, forlader plads til en udtrykket kassette indeholdende transgen14,15. De inverted terminal gentagne sekvenser (ITRs) af den oprindelige virale genom er de eneste opbevarede elementer i en AAV vektor, da disse er afgørende for replikation og pakning3,10,14. AAV vektorer kan være udviklet til at forbedre transgen udtryk; en mutation i et af ITRs fører til dannelsen af en hårnål loop, der effektivt gør det muligt for generation af en supplerende DNA strand3,7,15. Den største fordel ved denne konfiguration, kaldes en selv-supplerende (sc) genom, er, at det omgår behovet for anden-strand syntese typisk i AAVs, betydeligt øge hastighed og niveauer af transgenet udtryk konventionelle livscyklus 1. ikke desto mindre, ved hjælp af en scAAV genom reducerer lasteevne vektorens til ca. 2,4 kb. Dette omfatter transgen sekvenser, samt eventuelle lovgivningsmæssige sekvenser som projektledere eller mikroRNA-bindingssteder, at begrænse udtryk til specifikke celle typer16.
AAV kapsid bestemmer vektor-vært celle interaktion og giver en grad af celle type eller væv tropisme for en AAV serotype, som også kan udnyttes til at begrænse transgen udtryk til bestemte steder. Flere AAV serotyper findes i naturen, mens andre har været produceret i laboratorier gennem rekombinant fremgangsmåder (dvs. PHP. B). Derudover nogle capsids også skænke andre nyttige egenskaber, såsom evne til at krydse BBB, resulterer i levering af transgener i hele CNS efter systemisk indgift. Dette har vist sig for AAV9 og for nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som følge heraf disse serotyper viser sig for at være særlig relevant for nye gen terapi tilgange for neurodegenerative lidelser1,17,18.
Formålet med denne protokol er at beskrive en omkostningseffektiv metode til mindre produktion af AAV vektorer med høj titer og renhed. Selvom resultaterne præsenteres her bruge PHP. B kapsid og et scAAV udtryk kassette, protokollen er egnet til fremstilling af flere AAV vektor serotyper og genom konfigurationer, hvilket giver maksimal eksperimentelle fleksibilitet. Dog kan vektor udbytte og endelige renhed variere afhængigt af den valgte serotype.
Selve protokollen er en variant af metoden klassisk tri-Transfektion for viral vektor produktion og omfatter brug af en iodixanol gradient vektor oprydning, som i forhold til den klassiske brug af cæsium chlorid (CsCl) forløb, har været rapporteret for at producere AAV vektorer af højere renhed i et mere tid-effektive måde19,20,21.
Trinene Transfektion, rensning og koncentration er beregnet til at udføres efter god laboratoriepraksis (GLP) i en vævskultur laboratorium normeret til viral vektor arbejde. Hver opgave skal udføres i overensstemmelse med de relevante lokale og nationale lovgivning vedrørende viral vektor produktion og brug. Arbejde skal udføres under en laminar flow hætte og i sterile forhold. Inde i funktionen vektor anbefales det at bære en lab forklæde, ud over den regelmæssige vævskultur laboratoriekittel. Desuden bør et dobbelt par handsker samt plast overtrækssko, blive båret på alle tidspunkter.
Før start vektor produktion, sikre alt nødvendigt udstyr og plasmider er tilgængelige. 1) pCapsid plasmid indeholder rep genet, der koder fire nonstrukturelle proteiner nødvendige for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og fælles landbrugspolitik gen, der koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmid indeholder gener E4, E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produktion i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmid indeholder transgen udtryk kassette, flankeret af to ITRs. Disse plasmider kan være syntese de novo i laboratoriet ved hjælp af sekvenser tilgængelige online22. For plasmider gjort de novo, er især dem der indeholder roman transgener, sekventering påkrævet, for at sikre, at de transgene og ITRs er korrekte. Alternativt, premade plasmider kan erhverves direkte igennem online plasmid repositories. Når det er nødvendigt, plasmider kan forstærkes og renset ved hjælp af standard kits, ifølge producentens instruktioner23.
Vektor titer og renhed kan påvirke transduktion evne til vektor. Supplerende protokoller leveres for at vurdere kvaliteten af den producerede vektor. De endelige vektorer vil være nyttig for studier af CNS cellefunktion i både in vitro- og i vivo applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gen leveringsværktøjer baseret på adeno-associeret virus (AAVs) er et populært valg for levering af transgener til centralnervesystemet (CNS), herunder gen terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan inficere både delende og ikke-dividere celler og yde langsigtet transgen udtryk. Vigtigere, nogle serotyper, som den nyligt beskrevne PHP. B, kan krydse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, efter systemisk levering. AAV vektorer kan fremstilles effektivt i laboratoriet. Robust og reproducerbare protokoller er dog forpligtet til at indhente AAV vektorer med tilstrækkelig renhed niveauer og titer værdier højt nok til i vivo applikationer. Denne protokol beskriver en effektiv og reproducerbare strategi for AAV vektor produktion, baseret på en iodixanol gradient rensning strategi. Metoden iodixanol rensning er velegnede til at opnå partier af høj-titer AAV vektorer af høj renhed, sammenlignet med andre metoder, rensning. Protokollen er desuden generelt hurtigere end andre i øjeblikket beskrevne metoder. Derudover en kvantitativ polymerase kæde reaktion (qPCR)-baseret strategi er beskrevet for en hurtig og præcis bestemmelse af vektor titer, samt en sølvfarvning metode til at bestemme renheden af vektor batch. Endelig, repræsentative resultater af genet levering til CNS, efter systemisk indgift af AAV-PHP. B, præsenteres. Sådanne resultater bør være muligt i alle laboratorier ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i denne artikel.

AAV9 blev betragtet som, indtil for nylig, at være den mest effektive AAV vektor serotype i krydser BBB og transducing celler i CNS, efter perifer administration. Et betydeligt fremskridt i kapsid design blev opnået når Deverman et al. rapporterede anvendelsen af en kapsid udvalg metode kaldet Cre rekombination-baserede AAV-målrettet udvikling (Opret)17. Brug denne metode, identificeret de en ny kapsid, opkaldt PHP. B, som de rapporteret som stand til at transduce størstedelen af astrocytter og neuroner i flere regioner, CNS, efter systemisk injektion17. På dette tidspunkt, det bør bemærkes, at selv om PHP. B giver positive resultater i C57/Bl6 mus, (som var den stamme, de oprindelige isolering forsøgsdyr), foreløbige rapporter tyder på dets effektivitet kan variere i en stamme-afhængige måde. Yderligere eksperimenter vil uden tvivl kaste mere lys over denne sag31.
Trods disse problemer, PHP. B giver spændende muligheder for noninvasiv genmanipulation i CNS af mus, herunder proof-of-concept gen terapi eksperimenter i sygdomsmodeller. Som sådan, valgte vi at evaluere effektiviteten af transgenet udtryk ved hjælp af PHP. B versus AAV9, som har været den 'gyldne' vektor for CNS transduktion efter perifer administration siden 20092. Hvis du vil udføre en direkte sammenligning af både serotyper, under optimale betingelser for transgen udtryk, brugte vi en sc genom konfiguration32. Begge vektorer transporteres transgen til grøn fluorescerende proteiner (NGL) under kontrol af den allestedsnærværende kylling β-actin (CBA) promotor. C57/Bl6 hunmus på postnatal dag 42 (ca 20 g i vægt) modtaget en dosis af 1 x 1012 vg pr. mus enten scAAV2/php. B-CBA-NGL eller scAAV2/9-CBA-NGL. Vektor administration blev udført via hale vene injektion. Forsøgene blev godkendt af det etiske udvalg af KU Leuven.
Tre uger postinjection, mus undergik transcardial perfusion med iskold PBS, efterfulgt af 4% (w/v) iskold PARAFORMALDEHYD (PFA). Deres hjerner er høstet og undergik yderligere postfixation af en natten inkubation i den samme fiksativ, før du overfører til 0,01% (w/v) Na-indeholder/PBS for opbevaring indtil videre analyse. Bagefter, hjerner var sektionerede ved hjælp af en vibrerende mikrotom, og Immunhistokemi blev udført på 50 µm tykt sektioner.
For at vurdere niveauet af transgenet udtryk, afsnit var plettet med primære antistoffer mod normal god landbrugspraksis (kanin anti-NGL), med påvisning af sekundære antistoffer konjugeret med et fluorescerende farvestof (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet målinger (i arbitrære enheder [au]) bekræftede en betydelig stigning i normal god landbrugspraksis udtryk når en sc genom og PHP. B kapsid blev brugt i forhold til AAV9. Stigninger i normal god landbrugspraksis var overholdt i cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillehjernen (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0.0032), og hjernestammen (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (fig. 4 c).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figur 4: systemisk levering af scAAV2/PHP. B-CBA-NGL fører til en høj normal god landbrugspraksis udtryk i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-NGL eller scAAV2/9-CBA-normal god landbrugspraksis (1 x 1012 vg/mus) blev administreret til 6 uger gamle C57/Bl6 mus via hale vene injektion. Normal god landbrugspraksis var opdaget ved hjælp af Immunhistokemi på koronale hjernen afsnit 3 uger postinjection. (A) Den cerebrum og (B) lillehjernen og hjernestammen er vist. Skalere barer = 1 mm. (C) kvantificering af relative fluorescens intensiteter blev udført for at bestemme niveauerne for normal god landbrugspraksis signal opnåede med hver vektor (10 dele pr mus; tre mus hver vektor gruppe). En en-vejs ANOVA test blev udført, efterfulgt af en tosidede Student's t-test; dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse; p < 0,01; AU. arbitrære enheder. pCapsid, brugt til AAV vektor produktion, indeholder genet rep fra serotype 2 og gen cap fra serotype PHP. B eller AAV9, i overensstemmelse hermed. Dette tal er blevet ændret fra Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Her, beskriver vi en strategi for effektiv og reproducerbar til at producere, titer og kvalitetskontrol partier af adeno-associeret virus vektorer. Det giver brugeren mulighed for opnå en vektor forberedelse med høj titer (≥ 1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høj renhed, klar til in vitro- brug eller i vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Ved at følge denne protokol, brugeren vil være i stand til at producere AAV vektorer af høj renhed og udbytte egnet til in vitro eller in vivo applikationer. Denne protokol kan bruges til at producere og rense en række AAV-serotyper med forskelle i konfigurationer. Det kan være nyttigt at kombinere disse to elementer for at opnå celletype og vævsspecifikt udtryk.Produktion af nogle serotyper kan give til lavere udbytte. Dette er produktion, hvor der er tætte serotyper og bør evalueres individuelt. Påvisning af disse procedurer vil shelly Fripont, en tekniker fra vores laboratorium.Efter dyrkning af HEK-cellerne blandes 360 mikrogram hjælpeplasmid, 180 mikrogram plasmid, der koderede vektorkapidet, og 180 mikrogram plasmid, der indeholder transgenet i 18 milliliter 150 millimolar natriumchlorid, for at forberede DNA-blandingen. Fordel denne blanding over tre 50 milliliter koniske rør. I et nyt konisk rør blandes 840 mikrogram PEI og seks milliliter 150 millimolar natriumchlorid for at forberede PEI-blandingen til seks cellekulturretter.Derefter tilsættes seks milliliter af PEI mix, dråbe for dråbe, til en af de koniske rør, der indeholder DNA-blandingen. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Fjern derefter seks cellekulturretter fra kuvøsen.I en laminar flow hætte, helt aspirere mediet fra hver skål. Skyl opvasken med fem milliliter forvarmt DPBS for at fjerne spor af mediet. Vip forsigtigt hver skål for at sikre, at DPBS fordeles jævnt over hele overfladen.Derefter forsigtigt aspirere DPBS. Tilsæt 12 milliliter DMEM en til hver skål langsomt, med en pipette placeret på kanten af skålen. Bland PEI og DNA blandingen ved pipettering det op og ned tre til fem gange.Tilføj to milliliter af denne blanding til hver af de seks celle kultur retter i en dråbe for dråbe mode, og sørg for at omhyggeligt distribuere det over hele overfladen. Gentag denne proces ved hjælp af seks cellekulturretter ad gangen, indtil du når 18 cellekulturretter. Ryst forsigtigt cellekulturretterne for at distribuere PEI DNA-blandingen.Inkuber de transficerede celler ved 37 grader Celsius med 95 procent fugtighed og fem procent kuldioxid i fem timer. Derefter tilsættes yderligere 12 milliliter DMEM 10 til hver af de 18 retter uden at fjerne det allerede eksisterende medium. Fortsæt inkubering af transficerede celler under de samme forhold.Ved 72 timer efter transfektion skal du bruge en celleskraber til omhyggeligt at løsne cellerne fra hver kulturskål. Saml medium og cellerne i to kultur retter i en 15 milliliter konisk rør, holdes på is. Centrifuge rørene ved 420 gange G og ved fire grader Celsius i 10 minutter med acceleration og deceleration af centrifuge indstillet til maksimum.Kassér forsigtigt supernatanten fra hvert rør ved forsigtigt at hælde det i en affaldsbeholder. Derefter placere rør, der indeholder celle pellets på is. Vi suspenderer hver pellet i to milliliter lysis buffer og blandes ved pipettering op og ned fem til 10 gange.Træk AAV'en fra tre rør sammen. Til at begynde, fryse de re-suspenderet celler ved at placere dem i en spand, der indeholder tøris blandet med ethanol. Derefter tø cellerne ved straks at placere dem i et vandbad indstillet til 37 grader Celsius.Gentag denne fryse og tø cyklus tre gange for at lyse cellerne og frigive AAV partikler. Efter det tredje optøningstrin centrifuge ved 1167 gange G og ved fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør forsigtigt supernatanterne for at rengøre 50 milliliter koniske rør.Der tilsættes nuklease til hvert rør til en endelig koncentration på 50 enheder pr. milliliter supernatant. Inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter, mens hvirvlende rørene hver 10 minutter for at sikre, at nuklease er grundigt blandet med supernatant. Centrifuge på 13490 gange G og ved fire grader Celsius i 20 minutter for at afklare supernatant.Derefter fjernes stemplet på en 10 millilitersprøjte, et 0,45 mikrometerfilter fastgøres til sprøjten, og det anbringes oven på et rent konisk rør på 50 milliliter. Fyld forsigtigt sprøjten med den afklarede supernatant. Brug stemplet til at tvinge lysatet gennem filteret.Dernæst forberede hver af de iodixanol fraktioner i fire separate 50 milliliter koniske rør, som skitseret i tabel et af tekstprotokollen. Pipette otte milliliter af 15 procent iodixanol i hver af de tre ultracentrifuge rør. Pipette 5,5 milliliter 25 procent iodixanol i et rent 50 milliliter konisk rør.Ved hjælp af en ikke-gradueret Pasteur pipette, omhyggeligt lag 5,5 milliliter af 25 procent iodixanol opløsning under 15 procent iodixanol opløsning. Tilføj løsningerne på 40 og 60 procent som beskrevet i tekstprotokollen. Iodixanol fraktioner bør ikke blande på lagdeling.Ved hjælp af en Pasteur pipette, lag den rå lysate på toppen af 15 procent iodixanol gradient, dråbe for dråbe, for at undgå at forstyrre grænsefladen mellem den rå lysate og iodixanol opløsning. Fyld hver ultracentrifugering rør med lysis buffer, indtil menisken når bunden af røret hals, for at sikre røret ikke kollapser under de meget høje kræfter, der genereres under ultracentrifugering. Luk rørene ved hjælp af passende låg.Ved hjælp af en digital skala skal du sørge for, at alle tre ultracentrifugeringsrør har samme vægt. Justering af vægten efter behov ved at tilføje mere lysis buffer oven på det rå lysat. Brug en fast vinkel titanium rotor til centrifuge rørene ved 301580 gange G og ved 12 grader Celsius i en time og 40 minutter ved hjælp af maksimal acceleration og deceleration.Dernæst vedhæfte en nål til en fem milliliter sprøjte. Fjern afstandshuleren fra rørene i rotoren, og genfind rørene efter centrifugalisering. Aspirat kun 40 procent iodixanol fraktion, som indeholder vektor partikler.Enten behandle prøven eller gemme den på fire grader Celsius. Her er en protokol demonstreret, der kan bruges til at producere AAV vektorer med en række kapsider, genom konfigurationer, promotor typer, og transgene laster. I dette eksempel producerede og rensede vi to forskellige AAV-vektorer, der udtrykte det grønne fluorescerende protein fra et selvfristet genom.De to vektorer er kendetegnet ved forskellige capsids: PHPB og AAV9. De blev leveret, via hale vene injektion, i voksne C57 sorte seks mus. For at vurdere niveauet af transgene udtryk tre uger efter injektionen farves sektioner med primære antistoffer mod GFP med detektion ved hjælp af sekundære antistoffer, der er konjugeret til et fluorescerende farvestof.Fluorescensintensitetsmålinger viser en betydelig stigning i GFP-udtrykket, når PHPB-vektoren anvendes i forhold til AAV9. Stigninger i GFP blev observeret i cerebrum, lillehjernen, og i hjernestammen. Den nøjagtige samling af den vektor, der indeholder brøk, er afgørende for denne protokol.I tilfælde af at dette ikke sker ordentligt, vektor udbytte samt vektor renhed er negativt påvirket. At være i stand til at producere AAV vektorer, små laboratorier vil være i stand til at drage fordel af mange eksperimentelle muligheder for at levere gener i centralnervesystemet. Denne protokol kræver brug af en ultracentrifuge, og det er vigtigt at modtage ordentlig træning, før du håndterer dette for at undgå ulykker.Desuden klassificeres AAV-vektorer ofte som biologiske farer, og derfor bør du konsultere lokale bestemmelser, før du håndterer og administrerer dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion af lentivirusvektorer til transduktion af celler fra det centrale nervesystem

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og Tips til intravenøs indgift af Adeno-associeret Virus at rotter og evaluering af centralnervesystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

En i Ovo Model til test Insulin-mimetiske forbindelser

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associeret Virus-medieret transgen udtryk i genetisk definerede neuroner i rygmarven

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte Intratekal injektion af rekombinant Adeno-associeret virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konvektion forbedret levering af Optogenetic adeno-associeret viral vektor til cortex af rhesus Macaque under vejledning af online MRI-billeder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: En Wheel Control-baseret gaming platform til at studere human sensorisk kontrol

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...