Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

M.R. wordt ondersteund door een Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) postdoctoral fellowship (133722/1204517N) en de voortdurende steun van de Fundación cardiovasculaire de Colombia en de administratieve afdeling Wetenschappen, erkent Technologie en innovatie (Grant CT-FP44842-307-2016, projectcode 656671250485). M.M. wordt ondersteund door een FWO doctorale fellowship (1S48018N). M.G.H. werd gesteund door een VIB institutionele grant en externe steun van de Thierry Latran Stichting (SOD-VIP), de Stichting Alzheimer onderzoek (SAO-FRA) (P #14006), het FWO (Grant 1513616N) en de European Research Council (ERC) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Bewijs van Concept subsidie 713755 - AD-VIP). De auteurs erkennen Jeason Haughton voor zijn hulp met muis veehouderij, Stephanie Castaldo voor haar instructies voor het uitvoeren van de staart ader injecties en Caroline Eykens voor het verstrekken van de beelden van transfected cellen van de HEK293T. M.G.H. erkent Michael Dunlop, Peter Hickman en Dean Harrison.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De productie van recombinante vectoren van AAV beschreven hier gebruik materialen en uitrusting die gemeenschappelijk zijn voor de meeste moleculaire biologie labs en cel cultuur faciliteiten. Het stelt de gebruiker te verkrijgen pure, preklinische rang AAV vectoren die richten op meerdere cel- en weefseltransplantaties typen in een heel scala van in vitro en in vivo toepassingen kunnen worden gebruikt. Een van de grootste voordelen van dit protocol, in vergelijking met anderen (dat wil zeggen, CsCl gebaseerde zuivering), is de kortere werktijd nodig. Kant-en-klare AAV vectoren zijn verkrijgbaar in maximaal 6 werkdagen na de initiële transfectie van HEK293T cellen.
Verschillende factoren kunnen negatieve invloed hebben op de uiteindelijke opbrengst of de kwaliteit van de AAV-vector. Arme transfectie efficiëntie is een van de belangrijkste redenen voor een lage virale opbrengst33. Een belangrijke aanbeveling is het gebruik van HEK293T cellen, die hebben niet meer dan 20 keer gepasseerd zijn en hoeft niet een cel samenloop groter is dan 90% op het moment van transfectie21. Bovendien, heeft de methode van de transfectie gekozen een grote invloed op de resultaten. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van PEI. PEI is een kationische polymeer met de mogelijkheid om het leveren van exogene DNA aan de celkern door middel van de generatie van complexen van polymeer en nucleic zuur, bekend als polyplexes, die in beslag zijn genomen door de cel en verhandelde via Endosomen34. PEI gebaseerde transfectie is gemakkelijk en snel uit te voeren, in tegenstelling tot andere veelgebruikte methoden, zoals het co neerslaan van DNA met calciumfosfaat35. PEI gebaseerde transfectie is ook veel goedkoper in vergelijking met andere onlangs ingevoerde methoden, zoals het gebruik van kationische lipiden en magneet-gemedieerde transfectie36.
De zuivering strategie speelt een sleutelrol in het protocol. Vergeleken met andere methoden, neiging iodixanol gebaseerde zuivering om een hoger percentage van lege virale deeltjes (20%)20bevatten. Dit wordt gecompenseerd, tot op zekere, door het feit dat iodixanol gebaseerde zuivering routinematig in AAV vector preparaten met een deeltje-naar-infectiviteit-verhouding van minder dan 100 resulteert. Dit betekent een aanzienlijke verbetering in vergelijking met conventionele CsCl gebaseerde procedures, waarvoor aanzienlijke verlies van deeltje infectiviteit gerapporteerde37is. Een andere gemeenschappelijke alternatieve methode voor het zuiveren van AAV vectoren is chromatografie-gebaseerde zuivering. Echter, deze methode heeft het grote nadeel dat een bepaalde kolom vereist voor elke vector Eiwitmantel gebruikt is: bijvoorbeeld, terwijl AAV2 klassiek geïsoleerd met behulp van heparine kolommen is, deze methode werkt niet met AAV4 en AAV5, die niet beschikken over heparine-bindende sites op hun capsids38. Gezien het feit dat de chromatografie zuivering ook duur is, is iodixanol gebaseerde zuivering over het algemeen meer geschikt voor laboratoria die wil produceren van kwalitatief hoogwaardige batches van AAV vectoren op een kleine schaal33,39, 40. het maximaliseren van de uiteindelijke opbrengst en de zuiverheid van de vector, uiterste zorg is echter nodig bij het maken van de iodixanol verlopen. De verschillende iodixanol breuken moeten worden overgedragen aan de ultracentrifugatie buis met behulp van een steriele Pipet van Pasteur waarvan tip is het aanraken van de wand van de buis: iodixanol moet worden verbannen uit de pipet langzaam en continu. De vector deeltjes zich ophopen in de 40% iodixanol laag, moet zorg men zich ervan vergewissen dat de kleurovergang interfaces Meng geen20. Tot slot, de breuk met de vector hersteld zouden moeten worden door het inbrengen van een botte naald van roestvrij staal met een graadmeter niet groter is dan 20 G. Maximaliseren van de terugwinning van de vector, moet de duidelijke breuk in zijn geheel worden opgehaald. Tijdens deze stap is de timing van cruciaal belang. Om te voorkomen dat afbreuk te doen aan de zuiverheid van de voorbereiding, is het essentieel om te stoppen met de collectie voordat andere (verontreinigende) fasen van het verloop worden verzameld.
Verschillen in de verkregen vector-titer kunnen ook worden toegeschreven aan het intrinsieke vermogen van de vector te produceren verpakte deeltjes. Een vergelijking tussen verschillende AAV serotypen bleek dat sommige AAV-vectoren moeilijker zijn te produceren op een hogere titer dan anderen (bijvoorbeeld AAV2)41. Neerslag van de vector; tijdens de demineralisatie stap, kan een mogelijke oorzaak voor een lagere titer en eenvoudig voorkomen door het vermijden van overconcentration33. Bovendien, het is ook mogelijk dat de efficiëntie van iodixanol verloop gebaseerde zuivering enigszins tussen serotypes verschilt en, derhalve, verschillen in de titer verkregen met verschillende serotypes kunnen worden waargenomen41.
Ten slotte moet erop worden gewezen dat hoewel qPCR een zeer nauwkeurige methode voor DNA kwantificering is sommige inherente variabiliteit in de techniek kan worden waargenomen. Nauwkeurigheid in de titratie is voornamelijk afhankelijk van de precieze pipetteren en de juiste vortexing voor alle oplossingen. Om te garanderen de nauwkeurigste titer lezen, de qPCR zelfstandig kan worden herhaald, en de verkregen waarden worden gemiddeld. De keuze van de inleidingen gepresenteerd in dit protocol is gebaseerd op de volgorde van de promotor van de CBA gelegen in de pTransgene-plasmide gebruikt in ons laboratorium. De promotor CBA is een sterke synthetische promotor die over meerdere celtypen wijd in het vectorveld op station expressie is gebruikt. Het bevat meerdere elementen, met inbegrip van het cytomegalovirus (CMV) vroege enhancer element; de promotor, eerste exon en de eerste intron van het CBA-gen; en de splice acceptor van het konijn β-globine-gen. Inleidingen kunnen echter worden ontworpen voor vrijwel elk element dat is gelegen binnen de cassette van de expressie (met inbegrip van de promotor, transgenic en regulerende elementen). De vergelijking van de titer over partijen is ook mogelijk, mits inleidingen worden gebruikt tegen gebieden gemeen hebben de betrokken vectoren.
Kortom, kan dit protocol worden gebruikt voor de productie van AAV vectoren met een scala aan capsids, genoom configuraties, promotor types en transgenic ladingen. Hierdoor zullen de gebruikers aan te passen gemakkelijk de uiteindelijke kenmerken van hun vectoren best aan experimentele behoeften. In het voorbeeld gepresenteerd in de representatieve resultaten, het gebruik van de PHP. B Eiwitmantel, die efficiënt de BBB kruist, gaf hoogefficiënte genexpressie in het VNV, volgende staart veneuze injectie32. De systemische toediening van CNS penetrant vectoren heeft aanzienlijke voordelen met betrekking tot de mogelijke bijwerkingen2,17,32. Een mogelijk alternatief voor perifere injectie, terwijl het vermijden van de valkuilen van invasieve technieken, is intrathecale levering, die uit de levering van de AAV-vector in de cerebrospinale vloeistof bestaat. Deze bezorgingsroute is bewezen effectief, waarin wijdverbreide uitdrukking van transgenic over de CNS, minder af-target effecten in perifere organen, en lage niveaus van immuunrespons42. Intrathecale injecties zijn echter veel meer uitdagend, zoals zij hogere technische vaardigheden dan staart veneuze injectie vereist.
Verdere ontwikkeling van de Eiwitmantel om deze technologie te verfijnen zal worden bepaald door de mogelijkheden voor AAV vector gebruik in gen-therapie-toepassingen. Een dergelijke aanpak bieden aantrekkelijke mogelijkheden om te behandelen momenteel ongeneeslijke CNS aandoeningen, zoals Amyotrofische laterale sclerose, de ziekte van Charcot-Marie-Tooth, Parkinson en de ziekte van Alzheimer18.

In de afgelopen 30 jaar, zijn wild-type AAVs ontworpen om te maken van recombinante AAV vectoren, die hebben bewezen bijzonder nuttige hulpmiddelen voor genenoverdracht naar de CNS1,2,3,4, 5,6 en gen-therapie benaderingen van ziekte (met inbegrip van FDA en EMA-goedgekeurde therapieën)4,7. Hun geschiktheid voor gebruik in het VNV is grotendeels afgeleid van hun vermogen om niet-delende, post mitotische cellen infecteren, meestal te vinden in de CNS-8. AAV gebaseerde vectoren hebben echter ook het voordeel dat een langdurige uitdrukking van een bepaalde therapeutische transgenic4,9 terwijl aanleiding kunnen geven tot een mildere immune reactie in vergelijking met andere virale vectoren7, 8,10,11,12.
De belangrijkste elementen van een vector AAV zijn het genoom en de Eiwitmantel. Wild-type AAVs zijn single-stranded (ss) DNA virussen met een genoom van ongeveer 5 kilobases (kb)13. Voor de productie van recombinante AAV vectoren, de rep en cap genen (nodig voor de replicatie van het genoom en de vergadering van de virale Eiwitmantel) zijn verwijderd uit het genoom van de wild-type AAV en in trans, ruimte wordt gelaten voor een expressie cassette met de transgenic14,15. De omgekeerde terminal herhalen sequenties (ITRs) van het oorspronkelijke virale genoom zijn de enige bewaarde elementen in een vector van AAV, zoals deze zijn essentieel voor replicatie en verpakking3,10,14. AAV vectoren kunnen worden ontworpen om transgenic expressie; een mutatie in één van de ITRs leidt tot de vorming van een haarspeld-lus waarmee effectief de generatie van een complementaire DNA strand3,7,15. Het belangrijkste voordeel van deze configuratie genoemd van het genoom van een zelf-complementaire (sc), is dat het de behoefte aan tweede-onderdeel synthese typisch in de conventionele levenscyclus van AAVs, aanzienlijk verhogen van de snelheid en de niveaus van transgenic expressie mijdt 1. niettemin, met behulp van een scAAV genoom vermindert de capaciteit van de lading van de vector tot ongeveer 2,4 kb. Het gaat hierbij om transgenic sequenties, evenals een regulerende sequenties zoals initiatiefnemers of microRNA-bandplaatsen, uitdrukking aan een bepaalde cel typen16beperken.
De AAV Eiwitmantel bepaalt de vector-host cel interactie en verleent een zekere mate van cel type of weefsel tropisme voor een AAV serotype, die kan ook worden benut om te beperken transgenic expressie aan specifieke locaties. Verschillende AAV serotypen worden gevonden in de natuur, terwijl anderen zijn vervaardigd in laboratoria door middel van recombinant benaderingen (dat wil zeggen, PHP. B). Daarnaast schenken sommige capsids ook andere nuttige kenmerken, zoals de mogelijkheid om over te steken de BBB, resulterend in de levering van transgenen in het centraal zenuwstelsel na systemische toediening. Dit is aangetoond voor AAV9, evenals voor de recent beschreven PHP. B Eiwitmantel17. Dientengevolge, deze serotypen blijken te zijn met name relevant voor nieuwe benaderingen van gen-therapie voor neurodegeneratieve aandoeningen1,17,18.
Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een voordelige methode voor de kleinschalige productie van AAV vectoren met hoge titer en zuiverheid. Hoewel de resultaten gepresenteerd hier gebruik maken van de PHP. B Eiwitmantel en een scAAV expressie cassette, het protocol is geschikt voor de productie van verschillende AAV vector serotypes en genoom configuraties, waardoor maximale experimentele flexibiliteit. Echter, de opbrengst van de vector en de laatste zuiverheid kunnen variëren afhankelijk van het gekozen serotype.
Het protocol zelf is een variant van de klassieke tri-transfectie methode voor de productie van de virale vector en omvat het gebruik van een iodixanol verloop voor vector-opschonen, die in vergelijking met het klassieke gebruik van cesium chloride (CsCl) verlopen, is geweest gemeld aan het produceren van AAV vectoren van hogere zuiverheid in een meer tijd-efficiënte manier19,20,-21.
De transfectie, zuivering en concentratiestappen zijn bedoeld om te worden uitgevoerd overeenkomstig de goede laboratoriumpraktijken (GLP) in een laboratorium van de weefselcultuur voor virale vector werk gewaardeerd. Elke taak moet worden uitgevoerd met inachtneming van de lokale en nationale wetgeving betreffende virale vector productie en gebruik. Werk moet worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow en onder steriele omstandigheden. Binnen de vector-faciliteit, is het aanbevolen om het dragen van een schort lab, naast de reguliere weefselkweek laboratoriumjas. Bovendien moet een dubbele paar handschoenen, evenals kunststof overschoenen, te allen tijde worden gedragen.
Voordat beginnen de vector-productie, zorgen voor alle benodigde apparatuur en plasmiden beschikbaar zijn. 1) pCapsid plasmide bevat de rep -gen dat codeert voor vier niet-structurele eiwitten nodig voor replicatie, namelijk Rep78, Rep68, Rep52 en Rep40, en het GLB -gen dat codeert voor drie Eiwitmantel structurele eiwitten, namelijk VP1 VP2 en VP3. 2) pHelper plasmide bevat de genen E4 E2Aen VA van adenovirus, die AAV productie in HEK293T cellen vergemakkelijken. 3) pTransgene plasmide bevat de transgenic expressie cassette, geflankeerd door twee ITRs. Deze plasmiden kunnen gesynthetiseerd DOVO in het laboratorium met behulp van reeksen beschikbaar online22. Voor plasmiden DOVOgemaakt, is met name de scripts die roman transgenen, sequencing vereist, om ervoor te zorgen dat de transgenic en ITRs juist zijn. Anderzijds kunnen premade plasmiden direct worden verworven via online plasmide repositories. Indien nodig, plasmiden kunnen worden versterkt en gezuiverd met behulp van standaard kits, volgens de fabrikant instructies23.
Vector titer en zuiverheid kunnen nadelig beïnvloeden het vermogen van de transductie van de vector. Aanvullende protocollen worden geleverd om te evalueren van de kwaliteit van de geproduceerde vector. De definitieve vectoren zal zitten nuttig voor studies van de functie cel CNS in zowel in vitro als in vivo toepassingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gene levering hulpmiddelen op basis van adeno-geassocieerde virussen (AAVs) zijn een populaire keuze voor de levering van transgenen aan het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van gen-therapie-toepassingen. AAV vectoren zijn niet-repliceren, kunnen zowel de scheidingslijn en de niet-delende cellen infecteren en op lange termijn transgenic expressie. Nog belangrijker is, sommige serotypen, zoals het zojuist beschreven PHP. B, kan Kruis de bloed-hersen-barrière (BBB) in diermodellen, na systemische levering. AAV vectoren kunnen efficiënt geproduceerd worden in het laboratorium. Robuust en reproduceerbare protocollen zijn echter vereist om te verkrijgen van AAV vectoren met voldoende zuiverheid niveaus en waarden van de titer hoog genoeg voor in vivo toepassingen. Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare strategie voor AAV vector productie, op basis van een strategie voor de kleurovergang zuivering van iodixanol. De iodixanol zuivering methode is geschikt voor het verkrijgen van batches van hoge-titer AAV vectoren van hoge zuiverheid, in vergelijking met andere methoden van zuivering. Bovendien is het protocol over het algemeen sneller dan andere methoden die momenteel beschreven. Bovendien een kwantitatieve polymerase ketting reactie (qPCR)-gebaseerde strategie wordt beschreven voor een snelle en nauwkeurige bepaling van de vector-titer, evenals een silver kleuring methode om te bepalen van de zuiverheid van de vector-partij. Ten slotte, representatieve resultaten van gene levering aan de CNS, na systemische toediening van AAV-PHP. B, worden gepresenteerd. Dergelijke resultaten moeten mogelijk zijn in alle laboratoria met behulp van de protocollen die in dit artikel beschreven.

AAV9 werd overwogen, tot voor kort als de meest effectieve AAV vector serotype in overschrijding van de BBB en transducing van cellen van het centraal zenuwstelsel, na de perifere toediening. Een belangrijke stap vooruit in Eiwitmantel ontwerp werd bereikt toen Deverman et al. rapporteerde het gebruik van een Eiwitmantel selectiemethode Cre recombinatie gebaseerde AAV-gerichte evolutie (maken)17genoemd. Met behulp van deze methode, zij een nieuwe Eiwitmantel, genaamd PHP geïdentificeerd. B, die zij als kundig voor de meerderheid van astrocyten en neuronen in meerdere regio's van CNS, na systemische injectie17transduce gemeld. Op dit punt, het moet worden opgemerkt dat hoewel PHP. B biedt positieve resultaten in C57/Bl6 muizen (dat was de stam in de eerste isolatie-experimenten), voorlopige rapporten suggereren dat de doeltreffendheid ervan kan variëren in een stam-afhankelijke manier. Verdere experimenten zal ongetwijfeld meer licht werpen op deze kwestie31.
Echter, ondanks deze problemen, PHP. B biedt spannende mogelijkheden voor het manipuleren van de noninvasive gen in het VNV van muizen, met inbegrip van proof-of-concept gene therapie experimenten in ziekte modellen. Als zodanig, kozen we voor de evaluatie van de efficiëntie van transgenic expressie met behulp van PHP. B versus AAV9, dat is de vector van de 'gouden standaard' voor CNS transductie na toediening van de perifere sinds 20092. Voor het uitvoeren van een directe vergelijking van beide serotypes, onder optimale omstandigheden voor transgenic expressie, gebruikten we een sc genoom configuratie32. Beide vectoren droeg de transgenic voor de groen fluorescente proteïne (GFP) onder de controle van de alomtegenwoordige kip β-actine (CBA) promotor. Vrouwelijke C57/Bl6 muizen op postnatale dag 42 (ongeveer 20 gram in gewicht) ontvangen een dosis van 1 x 1012 vg per muis van beide scAAV2/PHP. B-CBA-GFP of scAAV2/9-CBA-GFP. Vector beheer was uitgevoerd via staart veneuze injectie. De experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven.
Drie weken postinjection, de muizen onderging transcardial perfusie met ijskoude PBS, gevolgd door 4% (m/v) ijskoude paraformaldehyde (PFA). Hun hersenen zijn geoogst en onderging verdere postfixation door een overnachting incubatie in de dezelfde fixeer, vóór de overbrenging tot 0,01% (g/v) nb-azide/PBS voor opslag tot verdere analyse. Daarna, de hersenen zijn gesegmenteerd met behulp van een vibrerende microtoom, en immunohistochemistry werd uitgevoerd op 50 µm dik secties.
Om te beoordelen van de niveaus van transgenic expressie, secties met primaire antilichamen tegen GFP (konijn anti-GFP), werden gekleurd met detectie met behulp van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof (anti-konijn Alexa Fluor 488) (figuur 4A, B ). Fluorescentie intensiteit metingen (in willekeurige eenheden [au]) bevestigd dat een aanzienlijke toename van de GFP expressie wanneer een sc genoom en de PHP. B Eiwitmantel werden gebruikt ten opzichte van AAV9. GFP stijgingen werden waargenomen in de hersenen (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), het cerebellum (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), en de hersenstam (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figuur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figuur 4: systemische levering van scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leidt tot een hoge GFP-expressie in het VNV. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP of scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/muis) werd toegediend aan 6-weken oude C57/Bl6 muizen via staart veneuze injectie. GFP werd ontdekt met behulp van immunohistochemistry op coronale hersenen secties 3 weken postinjection. (A) het cerebrum en (B) de kleine hersenen en hersenstam worden getoond. Schaal bars = 1 mm. (C) de kwantificering van de fluorescentie van de relatieve intensiteiten werd uitgevoerd om te bepalen van de niveaus van GFP signaal bereikt met elke vector (10 secties per muis; drie muizen per vector groep). Een one-way ANOVA test werd uitgevoerd, gevolgd door een tweezijdige Student t-test; de gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking; p < 0,01; au. willekeurige eenheden. pCapsid, gebruikt voor de productie van de vector van AAV, bevat het gen rep van serotype 2 en het gene GLB van serotype PHP. B of AAV9, dienovereenkomstig. Dit cijfer is gewijzigd van Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Door dit protocol te volgen, zal de gebruiker in staat zijn om AAV vectoren van hoge zuiverheid en opbrengst geschikt voor in vitro of in vivo toepassingen te produceren. Dit protocol kan worden gebruikt voor het produceren en zuiveren van een reeks AAV-serotypen met verschillen in configuraties. Het combineren van deze twee elementen kan nuttig zijn om celtype en weefselspecifieke expressie te verkrijgen.Productie van sommige serotypes kan geven aan een lagere opbrengst. Dit is de productie waarbij er nauwe serotypen zijn en op individuele basis moet worden geëvalueerd. Het aantonen van deze procedures zal Shelly Fripont, een technicus van ons laboratorium.Na het kweken van de HEK-cellen, meng 360 microgram helper plasmide, 180 microgram plasmide codering van de vector capsid, en 180 microgram plasmide met het transgeen in 18 milliliter van 150 millimolar natriumchloride om de DNA-mix voor te bereiden. Verdeel deze mix over drie 50 milliliter conische buizen. Meng in een nieuwe conische buis 840 microgram PEI en zes milliliter natriumchloride van 150 millimolar om de PEI-mix voor te bereiden op zes celkweekschotels.Voeg vervolgens zes milliliter van de PEI-mix, druppel voor druppel, toe aan een van de conische buizen die de DNA-mix bevatten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens zes celkweekgerechten uit de couveuse.In een laminaire flow kap, volledig aspirate het medium van elk gerecht. Spoel de gerechten af met vijf milliliter voorverwarmde DPBS om sporen van het medium te verwijderen. Kantel elke schotel voorzichtig om ervoor te zorgen dat DPBS gelijkmatig over het hele oppervlak wordt verdeeld.Vervolgens, voorzichtig aspirate de DPBS. Voeg 12 milliliter DMEM een aan elke schotel langzaam, met een pipet geplaatst aan de rand van de schotel. Meng het PEI- en DNA-mengsel door het drie tot vijf keer op en neer te buigen.Voeg twee milliliter van dit mengsel aan elk van de zes celkweek gerechten in een druppel voor druppel mode, zorg ervoor dat zorgvuldig te verdelen over het hele oppervlak. Herhaal dit proces met behulp van zes celkweek gerechten tegelijk tot het bereiken van 18 celkweek gerechten. Schud voorzichtig de celkweekschotels om het PEI DNA-mengsel te verdelen.Incubeer de doorfecteerde cellen op 37 graden Celsius met 95 procent vochtigheid en vijf procent kooldioxide gedurende vijf uur. Voeg hierna nog eens 12 milliliter DMEM 10 toe aan elk van de 18 gerechten zonder het reeds bestaande medium te verwijderen. Doorgaan met het uitbroeden van de transfected cellen in dezelfde omstandigheden.Gebruik na 72 uur na de transfectie een celschraper om de cellen zorgvuldig los te maken van elk kweekgerecht. Verzamel het medium en de cellen van twee kweekgerechten in een 15 milliliter conische buis, bewaard op ijs. Centrifugeer de buizen op 420 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten met de versnelling en vertraging van de centrifuge ingesteld op maximaal.Gooi de supernatant voorzichtig van elke buis door het voorzichtig in een afvalcontainer te gieten. Plaats vervolgens de buizen met de celkorrels op ijs. We schorten elke pellet op in twee milliliter lysebuffer en mengen door vijf tot 10 keer op en neer te pipetten.Trek de AAV uit drie buizen, samen. Om te beginnen, bevriezen de opnieuw opgehangen cellen door ze te plaatsen in een emmer met droogijs vermengd met ethanol. Ontdooi vervolgens de cellen door ze onmiddellijk in een waterbad te plaatsen dat op 37 graden Celsius is ingesteld.Herhaal deze vries- en dooicyclus drie keer om de cellen te lyseen en de AAV-deeltjes vrij te geven. Na de derde ontdooiing stap, centrifuge op 1167 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatants voorzichtig over om 50 milliliter conische buizen schoon te maken.Voeg nuclease toe aan elke buis aan een laatste concentratie van 50 eenheden per milliliter supernatant. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, terwijl wervelende de buizen om de 10 minuten om ervoor te zorgen dat de nuclease is grondig gemengd met de supernatant. Centrifuge op 13490 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten om de supernatant te verduidelijken.Verwijder hierna de zuiger van een spuit van 10 milliliter, bevestig een filter van 0,45 micrometer aan de spuit en plaats deze bovenop een schone conische buis van 50 milliliter. Vul de spuit voorzichtig met de verduidelijkte supernatant. Gebruik de zuiger om het lysaat door het filter te forceren.Bereid vervolgens elk van de iodixanolfracties voor in vier afzonderlijke conische buizen van 50 milliliter, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Pipette acht milliliter van 15 procent iodixanol in elk van de drie ultracentrifugebuizen. Pipette 5,5 milliliter van 25 procent iodixanol in een schone 50 milliliter conische buis.Met behulp van een niet-afgestudeerde Pasteur pipet, zorgvuldig laag 5,5 milliliter van 25 procent iodixanol oplossing onder de 15 procent iodixanol oplossing. Voeg de oplossingen van 40 procent en 60 procent toe zoals beschreven in het tekstprotocol. Iodixanol fracties mogen niet mengen op gelaagdheid.Met behulp van een Pasteur pipet, laag de ruwe lysate op de top van de 15 procent iodixanol gradiënt, druppel voor druppel, om te voorkomen dat verstoring van de interface tussen de ruwe lysaat en de iodixanol oplossing. Vul elke ultracentrifugatiebuis met lysebuffer totdat de meniscus de basis van de buisnek bereikt, om ervoor te zorgen dat de buis niet instort onder de zeer hoge krachten die tijdens ultracentrifugatie worden gegenereerd. Sluit de buizen met de juiste deksels.Zorg er met behulp van een digitale weegschaal voor dat alle drie de ultracentrifugatiebuizen hetzelfde gewicht hebben. Het gewicht zo nodig aanpassen, door meer lyse buffer toe te voegen bovenop het ruwe lysaat. Gebruik een titanium rotor met vaste hoek om de buizen op 301580 keer G en bij 12 graden Celsius gedurende een uur en 40 minuten te centrifugeren met maximale acceleratie en vertraging.Bevestig vervolgens een naald aan een spuit van vijf milliliter. Verwijder de afstandsaar van de buizen in de rotor en herstel de buizen na centrifugalisatie. Aspirate alleen de 40 procent iodixanol fractie die de vector deeltjes bevat.Verwerk het monster of bewaar het op vier graden Celsius. Hier wordt een protocol aangetoond dat kan worden gebruikt om AAV-vectoren te produceren met een verscheidenheid aan capsids, genoomconfiguraties, promotortypen en transgene ladingen. In dit voorbeeld produceerden en gezuiverd we twee verschillende AAV-vectoren die het groene fluorescerende eiwit uitdrukten uit een zelf-complementair genoom.De twee vectoren onderscheiden zich door verschillende capsids:PHPB en AAV9. Zij werden geleverd, via staartaderinjectie, in volwassen C57 zwarte zes muizen. Om de niveaus van transgene expressie drie weken na injectie te evalueren, worden secties gekleurd met primaire antilichamen tegen GFP met detectie met behulp van secundaire antilichamen geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof.Fluorescentieintensiteitsmetingen tonen een aanzienlijke toename van de GFP-expressie wanneer de PHPB-vector wordt gebruikt ten opzichte van AAV9. Toename van GFP werden waargenomen in het cerebrum, het cerebellum en in de hersenstam. Het nauwkeurig verzamelen van de vector met een fractie is cruciaal voor dit protocol.In het geval dat dit niet goed gebeurt, worden de vectoropbrengst en de vectorzuiverheid negatief beïnvloed. In staat zijn om AAV-vectoren te produceren, zullen kleine laboratoria in staat zijn om te profiteren van tal van experimentele mogelijkheden om genen in het centrale zenuwstelsel te leveren. Dit protocol vereist het gebruik van een ultracentrifuge en het is belangrijk om een goede training te krijgen voordat dit wordt behandeld om ongelukken te voorkomen.Bovendien worden AAV-vectoren vaak geclassificeerd als biohazards en daarom moet u lokale regelgeving raadplegen voordat u ze behandelt en beheert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Een Model In Ovo voor het testen van de insuline-mimetische verbindingen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Een wheel control-based gaming platform voor het bestuderen van menselijke sensorimotor controle

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...