Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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M.R. est pris en charge par un Fonds voor bourse postdoctorale Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) et reconnaît l’appui continu de la Fundación cardiovasculaire de Colombie et du département des sciences administratives, La technologie et l’Innovation (subvention CT-FP44842-307-2016, le code de projet 656671250485). M.M. est soutenu par une bourse de doctorat de FWO (1S48018N). M.G.H. était soutenu par une subvention institutionnelle du VIB et le soutien extérieur du Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), la fondation d’Alzheimer Research (SAO-FRA) (P #14006), le FWO (Grant 1513616N) et le Conseil européen de recherche (CER) (Starting Grant 281961 - AstroFunc ; Preuve de Concept Grant 713755 - AD-VIP). Les auteurs remercient Jeason Haughton pour son aide avec l’élevage de souris, Stephanie Castaldo pour son aide à effectuer les injections de veine de queue et Caroline Eykens pour fournir les images de cellules HEK293T transfectées. M.G.H. reconnaît Michael Dunlop, Peter Hickman et Dean Harrison.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La production des vecteurs d’AAV recombinants décrite ici utilise des matériaux et équipements communs à la plupart des laboratoires de biologie moléculaire et des installations de culture de cellules. Il permet à l’utilisateur d’obtenir des vecteurs d’AAV pure, précliniques de qualité qui peuvent être utilisés pour cibler plusieurs types de cellules et de tissus dans un éventail d’applications in vitro et in vivo . Un des plus grands avantages du présent protocole, par rapport aux autres (p. ex., axée sur le CsCl purification), est le plus court temps de travail nécessaire. Prêt-à-utiliser des vecteurs d’AAV peuvent être obtenus dans un délai maximum de 6 jours ouvrables après la transfection initiale de cellules HEK293T.
Plusieurs facteurs peuvent influencer négativement le rendement final ou la qualité du vecteur AAV. Efficacité de transfection pauvre est l’une des principales raisons pour un faible rendement virale33. Une recommandation majeure est l’utilisation de cellules HEK293T qui n’ont pas été repiquées plus de 20 fois et n’ont pas une confluence de cellule supérieure à 90 % au moment de la transfection21. En outre, la méthode de transfection sélectionnée a un impact majeur sur les résultats. Ce protocole est basé sur l’utilisation du PEI. PEI est un polymère cationique avec la capacité de livrer des ADN exogène dans le noyau de la cellule grâce à la génération des complexes de polymère et d’acide nucléique, appelée polyplexes, qui sont absorbés par la cellule et les victimes de la traite par endosomes34. Transfection axée sur le PEI est facile et rapide à réaliser, contrairement aux autres méthodes répandues, comme la coprécipitation d’ADN avec le phosphate de calcium,35. Aussi, transfection axée sur le PEI est beaucoup moins cher par rapport aux autres méthodes nouvellement introduites, telles que l’utilisation des lipides cationiques et36de la transfection induite par l’aimant.
La stratégie de purification joue un rôle clé dans le protocole. Par rapport aux autres méthodes, axée sur l’iodixanol des purifications ont tendance à contiennent un pourcentage plus élevé de particules virales vides (20 %),20. Cela est compensé, dans une certaine mesure, par le fait qu’axée sur l’iodixanol purification résulte systématiquement dans les préparations de vecteur AAV avec un ratio de particules à l’infectivité inférieur à 100. Il s’agit d’une amélioration significative par rapport aux procédures conventionnelles CsCl-basé, pour lesquels une perte substantielle d’infectiosité de la particule est signalé37. Une autre méthode alternative commune à épurer des vecteurs d’AAV est axée sur la chromatographie en phase de purification. Toutefois, cette méthode a l’inconvénient majeur qu’une colonne spécifique est requise pour chaque capside vecteur utilisé : par exemple, tandis que AAV2 est classiquement isolées à l’aide de colonnes de l’héparine, cette méthode ne fonctionne pas avec AAV4 et AAV5, qui ne possèdent pas de liant l’héparine sites sur leurs capsides38. Considérant que la purification par chromatographie est aussi cher, axée sur l’iodixanol purification est généralement plus adaptée pour les laboratoires qui désirent se produire des lots de haute qualité des vecteurs d’AAV sur une petite échelle33,39, 40. Toutefois, afin de maximiser le rendement final et la pureté du vecteur, un soin extrême est nécessaire lors des gradients d’iodixanol. Les diverses fractions d’iodixanol devraient être transférées à l’ultracentrifugation tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile dont l’extrémité est en contact avec la paroi du tube : iodixanol devrait être expulsé de la pipette lentement et continuellement. Comme les particules de vecteur s’accumulent dans la couche d’iodixanol de 40 %, soins doivent être prises pour s’assurer que les interfaces dégradés ne mélangent pas20. Enfin, la fraction contenant le vecteur devrait être recouvrée par l’insertion d’une aiguille émoussée en acier inoxydable avec un calibre ne dépassant pas 20 G. Pour maximiser la récupération de vecteur, la fraction claire doit être récupérée dans son intégralité. Au cours de cette étape, le timing est critique. Pour ne pas compromettre la pureté de la préparation, il est essentiel d’arrêter la collection avant la collecte des autres phases (contamination) du dégradé.
Différences dans le titre de vecteur obtenus peuvent être attribuées aussi à la capacité intrinsèque du vecteur pour produire des particules emballés. Une comparaison entre différents sérotypes d’AAV a montré que certains vecteurs AAV sont plus difficiles à produire à un titre plus élevé que d’autres (p. ex., AAV2)41. Précipitation du vecteur, pendant l’étape de dessalement, peut être une raison possible pour un titre plus faible et facilement prévenue en évitant la surconcentration33. En outre, il est également possible que l’efficacité de la purification d’axée sur le gradient iodixanol diffère légèrement entre sérotypes et, par conséquent, divergences dans le titre obtenu avec des sérotypes différents sont observés en41.
Enfin, il doit être souligné que, même si qPCR est une méthode très précise pour la quantification de l’ADN certaine variabilité inhérente à la technique peut être observée. Précision dans le titrage dépend principalement le pipetage précis et bonne agitation de toutes les solutions. Afin de garantir le titre plus précis de lecture, le qPCR peut être indépendamment répété, et les valeurs obtenues en moyenne. Le choix des amorces présentées dans le présent protocole est basé sur la séquence du promoteur ABC situé dans le plasmide pTransgene utilisé dans notre laboratoire. Le promoteur de l’ABC est un ardent promoteur synthétique qui est largement utilisé dans le champ de vecteurs d’expression en voiture à travers plusieurs types de cellules. Il incorpore plusieurs éléments, y compris l’élément de l’enrichisseur début cytomégalovirus (CMV) ; le promoteur, premier exon et le premier intron du gène ABC ; et l’accepteur d’épissage de la β-globine de lapin. Cependant, les amorces peuvent être conçus pour pratiquement n’importe quel élément situé à l’intérieur de la cassette d’expression (y compris le promoteur, transgène et des éléments réglementaires). La comparaison du titre dans l’ensemble de lots est également possible, fournir des amorces sont utilisés contre les régions communes pour les vecteurs en question.
En conclusion, ce protocole peut être utilisé pour produire des vecteurs d’AAV avec une variété de capsides, configurations de génome, types de promoteur et cargaisons de transgene. Cela permettra aux utilisateurs d’adapter facilement les caractéristiques finales de leurs vecteurs pour satisfaire au mieux les besoins expérimentaux. Dans l’exemple présenté dans les résultats représentatifs, l’utilisation de PHP. Capside de B, qui traverse la BHE efficacement, a donné l’expression des gènes très efficace dans le SNC, suivant queue veine injection32. L’administration systémique de vecteurs par ressuage CNS a des avantages considérables en termes d’effets secondaires possibles de17,2,32. Une alternative possible à injection périphérique, tout en évitant les mises en garde des techniques invasives, est intrathécale, qui se compose de la livraison du vecteur AAV dans le liquide céphalo-rachidien. Cet itinéraire de livraison est avéré efficace, montrant une expression très répandue du transgène à travers le système nerveux central, moins d’effets hors-cible dans les organes périphériques et de faibles niveaux de réponse immunitaire42. Toutefois, des injections intrathécales sont beaucoup plus difficiles, car ils exigent des compétences plus techniques que l’injection dans la veine queue.
Perfectionnement de capside pour affiner cette technologie sera pilotée par les possibilités d’utilisation de vecteurs AAV dans les applications de la thérapie génique. Ces approches offrent des possibilités attrayantes pour traiter les troubles du SNC actuellement incurables, comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth maladie, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer18.

Au cours des 30 dernières années, AAVs sauvage ont été conçus pour créer des vecteurs d’AAV recombinants, qui sont sont avérées pour être des outils extrêmement utiles pour le transfert de gène dans les CNS1,2,3,4, 5,6 et la thérapie génique s’approche de la maladie (y compris les thérapies et EMA-approuvé par la FDA)4,7. Leur aptitude à l’emploi dans le système nerveux central provient en grande partie de leur capacité à infecter des cellules post-mitotiques, non de division, on trouve généralement dans le CNS8. Cependant, les vecteurs AAV-basés ont également l’avantage de permettre une expression à long terme de toute donnée de transgènes thérapeutiques4,9 , tout en suscitant une réponse immunitaire plus douce par rapport aux autres vecteurs viraux7, 8,10,11,12.
Les principaux éléments d’un vecteur AAV sont le génome et la capside. AAVs sauvage sont monocaténaires (ss) virus à ADN avec un génome d’environ 5 kilobases (kb)13. Pour la production des vecteurs d’AAV recombinants, les gènes de rep et de cap (nécessaires pour la réplication du génome et l’assemblage de la capside virale) sont supprimés à partir du génome de l’AAV sauvage et prévues en trans, laissant la place à une cassette d’expression contenant le transgène14,15. Les ordres terminaux répétition inversées (ITRs) du génome viral initial sont les seuls éléments conservés dans un vecteur AAV, car celles-ci sont essentielles pour la réplication et l’emballage de3,10,14. Des vecteurs d’AAV peuvent être conçues pour amplifier l’expression du transgène ; une mutation dans l’un de l’ITRs conduit à la formation d’une boucle en épingle à cheveux qui effectivement permet la génération d’un ADN complémentaire brin3,7,15. Le principal avantage de cette configuration, appelée un génome complémentaires (sc), est qu’il contourne la nécessité pour la synthèse du deuxième brin typique dans le cycle de vie classique de AAVs, augmentant considérablement la vitesse et les niveaux d’expression de transgènes 1. Néanmoins, à l’aide d’un génome de scAAV réduit la capacité de chargement du vecteur à environ 2,4 kb. Cela inclut des séquences de transgène, ainsi que des séquences régulatrices telles que des promoteurs ou des sites de liaison de micro-ARN, afin de limiter l’expression de types spécifiques de cellules16.
La capside AAV détermine l’interaction de cellule hôte-vecteur et confère un niveau de tropisme cellulaire de type ou de tissu pour un sérotype AAV, qui peut également être exploitée afin de limiter l’expression du transgène à des emplacements spécifiques. Plusieurs sérotypes d’AAV sont trouvent dans la nature, tandis que d’autres ont été produites dans des laboratoires à travers des approches recombinants (c.-à-d., PHP. B). en outre, certains capsides confèrent également autres caractéristiques utiles, telles que la capacité à traverser la BHE, résultant dans la prestation des transgènes dans tout le système nerveux central après administration systémique. Ceci a été démontré pour la AAV9, ainsi que pour le PHP récemment décrit. B capside17. En conséquence, ces sérotypes sont avèrent particulièrement pertinentes pour de nouvelles approches de thérapie génique pour neurodégénératives troubles1,17,18.
Le but du présent protocole est de décrire une méthode rentable pour la production à petite échelle des vecteurs d’AAV avec titre élevé et la pureté. Bien que les résultats présentés ici utilisent le PHP. B capside et une cassette d’expression scAAV, le protocole est convenable pour la production de plusieurs sérotypes de vecteur d’AAV et configurations de génome, ce qui permet une flexibilité maximale expérimentale. Toutefois, le rendement de vecteur et de la pureté finale peuvent varier selon le sérotype choisi.
Le protocole lui-même est une variante de la méthode de tri-transfection classique pour la production de vecteurs viraux et incorpore l’utilisation d’un gradient d’iodixanol pour vecteur nettoyage, qui, par rapport à l’utilisation classique de gradients de césium de chlorure (CsCl), a été rapporté des vecteurs d’AAV de pureté supérieure à un temps plus efficace manière19,20,21.
Les étapes de la transfection, purification et concentration sont destinées à être effectuées selon les bonnes pratiques de laboratoire (bpl) dans un laboratoire de culture tissulaire conçu au travail vecteur viral. Chaque tâche doit être exécutée en conformité avec la législation locale et nationale concernant la production de vecteurs viraux et utiliser. Travail doit être effectué sous une hotte à flux laminaire et dans des conditions stériles. À l’intérieur de l’installation de vecteur, il est recommandé de porter un tablier de laboratoire, en plus de la blouse de laboratoire réguliers de culture tissulaire. Par ailleurs, une double paire de gants, ainsi que les couvre-chaussures en plastique, il faut porter en tout temps.
Avant de commencer la production de vector, s’assurer que tout l’équipement nécessaire et plasmides sont disponibles. 1) pCapsid plasmide contient le gène rep qui encode quatre protéines non structurelles nécessaires pour la réplication, à savoir Rep78, Rep68, Rep52 et Rep40 et le gène de la PAC qui encode les trois protéines de la capside structurelle, à savoir VP1, VP2 et VP3. 2) pHelper plasmide contient les gènes E4, E2Aet VA de l’adénovirus, qui facilitent la production de cellules HEK293T AAV. 3) pTransgene plasmide contient la cassette d’expression de transgènes, flanquée de deux RTI. Ces plasmides peuvent être synthétisés de novo dans le laboratoire à l’aide de séquences disponibles en ligne22. Pour les plasmides, faites de novo, surtout ceux contenant des transgènes roman, séquençage est nécessaire, pour s’assurer que le transgène et la RTI est corrects. Alternativement, premade plasmides peuvent être directement acquises par le biais de dépôts de plasmide en ligne. Lorsque cela est nécessaire, les plasmides peuvent être amplifiés et purifié à l’aide de kits standard, selon instructions23 les directives du fabricant.
Titre de vecteur et de la pureté peuvent compromettre la capacité de transduction du vecteur. Protocoles additionnels sont fournis pour évaluer la qualité du produit vecteur. Les vecteurs finales sera utiles pour l’étude de la fonction de cellule de CNS dans des applications aussi bien in vitro et in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Outils de livraison de gène issus des virus adéno-associés (AAVs) sont un choix populaire pour la livraison des transgènes au système nerveux central (CNS), y compris les applications de la thérapie génique. Des vecteurs d’AAV sont non répliquées, capable d’infecter des cellules en division et non de division et de fournir l’expression transgénique à long terme. Ce qui est important, certains sérotypes, tels que le PHP nouvellement décrit. B, peut traverser la sang-encéphalique (BHE) dans des modèles animaux, après délivrance systémique. Des vecteurs d’AAV peuvent être efficacement produites en laboratoire. Cependant, les protocoles robustes et reproductibles sont tenus d’obtenir des vecteurs d’AAV avec des niveaux suffisants de pureté et de valeurs titre suffisamment élevées pour des applications in vivo . Ce protocole décrit une stratégie efficace et reproductible pour la production de vecteur AAV, basée sur une stratégie de purification gradient d’iodixanol. La méthode de purification iodixanol est adaptée pour l’obtention de lots de vecteurs AAV haut-titre de haute pureté, par rapport aux autres méthodes de purification. En outre, le protocole est généralement plus rapide que les autres méthodes actuellement décrites. En outre, une quantitative polymerase chain réaction (qPCR)-basé de stratégie est décrite pour la détermination rapide et précise de la titre de vecteur, ainsi qu’une méthode de coloration à l’argent déterminer la pureté du lot vector. Enfin, des résultats représentatifs de l’injection de gène dans le SNC, suite à l’administration systémique d’AAV-PHP. B, sont présentés. Ces résultats devraient être possibles dans tous les laboratoires utilisant les protocoles décrits dans cet article.

AAV9 était considéré, jusqu'à une date récente, d’être le plus efficace sérotype de vecteur AAV en traversant la BHE et transduction des cellules du SNC, après administration périphérique. Une avancée significative dans la conception de la capside a été atteint lorsque Dhalladoo et coll. ont signalé l’utilisation d’une méthode de sélection de capside appelée Cre axée sur la recombinaison ciblées AAV evolution (CREATE)17. En utilisant cette méthode, ils ont identifié une nouveau capside, nommée PHP. B, qui ils ont signalé comme étant en mesure de transmettre la majorité des astrocytes et neurones dans plusieurs régions du CNS, après injection systémique17. À ce stade, il convient de noter que même si PHP. B fournit des résultats positifs chez les souris C57/Bl6 (qui était la souche utilisée dans les expériences d’isolement initial), les rapports préliminaires suggèrent que son efficacité peut varier d’une manière dépendante de la souche. D’autres expériences seront, sans aucun doute, jeter plus de lumière sur cette question31.
Cependant, malgré ces problèmes, PHP. B offre des possibilités passionnantes pour la manipulation de gènes non invasive dans le système nerveux central de souris, y compris les expériences de thérapie de gène de validation dans les modèles de maladies. Par conséquent, nous avons choisi d’évaluer l’efficacité d’expression de transgene en utilisant PHP. B par rapport à AAV9, qui a été le vecteur « étalon-or » pour la transduction CNS après administration périphérique depuis 20092. Pour effectuer une comparaison directe des deux sérotypes, dans des conditions optimales pour l’expression du transgène, nous avons utilisé une configuration de génome du sc32. Les deux vecteurs qui relèvent du transgène pour protéine fluorescente verte (GFP) le contrôle du promoteur omniprésent poulet β-actine (CBA). Les souris C57/Bl6 femelles au jour post-natal 42 (environ 20 g en poids) ont reçu une dose de 1 x 1012 vg par souris soit scAAV2/php. B-ABC-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP. Administration de vecteur a été exécuté par injection dans la veine queue. Les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique de la KU Leuven.
Post-injection de trois semaines, les souris ont subi transcardial perfusion avec du PBS glacee, suivie de 4 % (p/v) de paraformaldéhyde glacee (PFA). Leurs cerveaux ont été récoltés et subit encore postfixation par une incubation durant la nuit dans le fixateur même, avant de les transférer à 0,01 % (p/v) : Na-azoture/PBS pour stockage jusqu'à une analyse plus approfondie. Par la suite, les cerveaux étaient sectionnés à l’aide d’un microtome vibrant et immunohistochimique a été réalisée sur 50 µm de coupes épaisses.
Afin d’évaluer les niveaux d’expression du transgène, sections ont été colorées avec des anticorps primaires contre GFP (lapin anti-GFP), avec détection en utilisant des anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent (anti-lapin Alexa Fluor 488) (Figure 4 a, B ). Mesures d’intensité de fluorescence (en unités arbitraires [au]) a confirmé une augmentation significative de l’expression de la GFP lorsqu’un sc génome et le PHP. Capside B ont été utilisés par rapport à AAV9. Augmentations GFP ont été observées dans le cerveau (2105 161 en ± vs 1441 de la ± 99 UA ; p = 0,0032), le cervelet (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 UA ; p = 0,0032) et le tronc cérébral (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 UA ; p = 0,0038) (Figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figure 4 : délivrance systémique de scAAV2/PHP. B-ABC-GFP conduit à une forte expression de GFP dans le SNC. scAAV2/PHP. B-ABC-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/souris) a été administré à des souris C57/Bl6 âgés de 6 semaines par injection dans la veine queue. GFP a été détectée par immunohistochimie sur post-injection de cerveau coronale sections 3 semaines. (A) le cerveau et (B) le cervelet et le tronc cérébral sont indiqués. Barreaux de l’échelle = 1 mm. (C) la quantification des intensités de fluorescence relative a été réalisée afin de déterminer les niveaux de signal GFP réalisé avec chaque vecteur (10 articles par souris ; trois souris par groupe vector). Un aller simple test ANOVA a été réalisé, suivie de l’élève à deux t-test ; les données sont exprimées en moyenne ± écart-type ; p < 0,01 ; UA. unités arbitraires. pCapsid, utilisé pour la production de vecteur d’AAV, contient le gène rep de sérotype 2 et le gène cap de sérotype PHP. B ou AAV9, en conséquence. Ce chiffre a été modifié par Rincon Al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

En suivant ce protocole, l’utilisateur sera en mesure de produire des vecteurs AAV de haute pureté et de rendement adaptés aux applications in vitro ou in vivo. Ce protocole peut être utilisé pour produire et purifier une gamme de sérotypes AAV avec des différences dans les configurations. La combinaison de ces deux éléments peut être utile pour obtenir le type de cellule et l’expression spécifique de tissu.La production de certains sérotypes peut donner à un rendement inférieur. Il s’agit d’une production où il existe des sérotypes proches et doit être évaluée sur une base individuelle. Shelly Fripont, technicienne de notre laboratoire, démontrera ces procédures.Après la croissance des cellules HEK, mélanger 360 microgrammes de plasmide d’aide, 180 microgrammes de plasmide codant le capsid vectoriel, et 180 microgrammes de plasmide contenant le transgène en 18 millilitres de chlorure de sodium de 150 millimlaires pour préparer le mélange d’ADN. Répartir ce mélange sur trois tubes coniques de 50 millilitres. Dans un nouveau tube conique, mélanger 840 microgrammes de l’Île-du-Prince-Édouard et six millilitres de chlorure de sodium de 150 millimlaires pour préparer le mélange de l’Île-du-Prince-Édouard pour six plats de culture cellulaire.Ajouter ensuite six millilitres du mélange de l’Île-du-Prince-Édouard, goutte à goutte, à l’un des tubes coniques contenant le mélange d’ADN. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, retirez six plats de culture cellulaire de l’incubateur.Dans une hotte d’écoulement laminaire, aspirer complètement le milieu de chaque plat. Rincer la vaisselle avec cinq millilitres de DPBS préchauffé pour enlever les traces du milieu. Inclinez doucement chaque plat pour vous assurer que le DPBS est réparti uniformément sur toute la surface.Ensuite, aspirez doucement le DPBS. Ajouter 12 millilitres de DMEM un à chaque plat lentement, avec une pipette placée sur le bord du plat. Mélangez le mélange de l’Î.-P.-É. et de l’ADN en le faisant monter et descendre trois à cinq fois.Ajouter deux millilitres de ce mélange à chacun des six plats de culture cellulaire d’une manière goutte à goutte, en s’assurant de le distribuer soigneusement sur toute la surface. Répétez ce processus à l’aide de six plats de culture cellulaire à la fois jusqu’à atteindre 18 plats de culture cellulaire. Secouez doucement les plats de culture cellulaire pour distribuer le mélange d’ADN de l’Î.-P.-É.Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius avec 95 pour cent d’humidité et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Après cela, ajouter 12 millilitres supplémentaires de DMEM 10 à chacun des 18 plats sans enlever le milieu préexistant. Continuez à couver les cellules transfectées dans les mêmes conditions.À 72 heures après la transfection, utilisez un grattoir cellulaire pour détacher soigneusement les cellules de chaque plat de culture. Recueillir le milieu et les cellules de deux plats de culture dans un tube conique de 15 millilitres, maintenu sur la glace. Centrifuger les tubes à 420 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec l’accélération et la décélération de la centrifugeuse réglée au maximum.Jetez soigneusement le supernatant de chaque tube en le versant doucement dans un récipient d’élimination des déchets. Ensuite, placez les tubes contenant les granulés cellulaires sur la glace. Nous suspendons chaque granulé en deux millilitres de tampon de lyse et mélangeons en pipetting de haut en bas cinq à dix fois.Tirez l’AAV de trois tubes, ensemble. Pour commencer, congeler les cellules re-suspendues en les plaçant dans un seau contenant de la glace sèche mélangée à de l’éthanol. Décongelez ensuite les cellules en les plaçant immédiatement dans un bain d’eau fixé à 37 degrés Celsius.Répétez ce cycle de gel et de dégel trois fois pour lyser les cellules et libérer les particules AAV. Après la troisième étape de décongélation, centrifugeuse à 1167 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer délicatement les supernatants pour nettoyer les tubes coniques de 50 millilitres.Ajouter la nucléase à chaque tube à une concentration finale de 50 unités par millilitre de supernatant. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, tout en tourbillonnant les tubes toutes les 10 minutes pour s’assurer que la nucléase est bien mélangée avec le surnatant. Centrifugeuse à 13490 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour clarifier le surnatant.Après cela, retirez le piston d’une seringue de 10 millilitres, fixez un filtre de 0,45 micromètre à la seringue et placez-le sur un tube conique propre de 50 millilitres. Remplissez soigneusement la seringue avec le supernatant clarifié. Utilisez le piston pour forcer le lysate à travers le filtre.Ensuite, préparez chacune des fractions iodixanol en quatre tubes coniques distincts de 50 millilitres, comme indiqué dans le tableau un du protocole de texte. Pipette huit millilitres de 15 pour cent iodixanol dans chacun des trois tubes d’ultracentrifugeuse. Pipette 5,5 millilitres de 25 pour cent iodixanol dans un tube conique propre de 50 millilitres.À l’aide d’une pipette Pasteur non graduée, superposez soigneusement 5,5 millilitres de solution iodixanol à 25 % en dessous de la solution iodoxanol à 15 %. Ajoutez les solutions de 40 % et 60 % décrites dans le protocole texte. Les fractions iodixanol ne doivent pas se mélanger sur la superposition.À l’aide d’une pipette Pasteur, superposer le lysate brut au-dessus du gradient iodixanol de 15 %, goutte à goutte, pour éviter de perturber l’interface entre le lysate brut et la solution iodanol. Remplissez chaque tube d’ultracentrifugation d’un tampon de lyse jusqu’à ce que le ménisque atteigne la base du col du tube, pour s’assurer que le tube ne s’effondre pas sous les forces très élevées générées lors de l’ultracentrifugation. Fermez les tubes à l’aide de couvercles appropriés.À l’aide d’une balance numérique, assurez-vous que les trois tubes d’ultracentrifugation ont le même poids. Ajuster le poids au besoin, en ajoutant plus de tampon de lyse sur le dessus du lysate brut. Utilisez un rotor de titane à angle fixe pour centrifuger les tubes à 301580 fois G et à 12 degrés Celsius pendant une heure et 40 minutes en utilisant une accélération et une décélération maximales.Ensuite, fixez une aiguille à une seringue de cinq millilitres. Retirez l’espaceur des tubes du rotor et récupérez les tubes après centrifugalisation. N’aspirez que la fraction iodixanol à 40 % qui contient les particules vectorielles.Soit traiter l’échantillon ou le stocker à quatre degrés Celsius. Ici, un protocole est démontré qui peut être utilisé pour produire des vecteurs AAV avec une variété de capsides, configurations du génome, types promoteurs, et des cargaisons transgéniques. Dans cet exemple, nous avons produit et purifié deux vecteurs AAV différents qui exprimaient la protéine fluorescente verte à partir d’un génome auto-complémentaire.Les deux vecteurs se distinguent par des capsides différentes : PHPB et AAV9. Ils ont été livrés, par injection de veine de queue, chez six souris noires C57 adultes. Pour évaluer les niveaux d’expression transgénique trois semaines après l’injection, les sections sont tachées d’anticorps primaires contre le GFP avec détection à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent.Les mesures de l’intensité de fluorescence montrent une augmentation significative de l’expression du PF G lorsque le vecteur PHPB est utilisé par rapport à l’AAV9. Des augmentations de GFP ont été observées dans le cerveau, le cervelet, et dans le tronc cérébral. La collecte précise du vecteur contenant la fraction est cruciale pour ce protocole.Dans le cas où cela n’est pas fait correctement, le rendement vectoriel ainsi que la pureté du vecteur sont affectés négativement. Capables de produire des vecteurs AAV, les petits laboratoires seront en mesure de profiter de nombreuses possibilités expérimentales pour délivrer des gènes dans le système nerveux central. Ce protocole nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse et il est important de recevoir une formation adéquate avant de le manipuler afin d’éviter les accidents.En outre, les vecteurs AAV sont souvent classés comme biohazards et, par conséquent, vous devriez consulter les réglementations locales avant de les manipuler et de les gérer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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