Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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M.r. stützt sich auf einen Fonds Voor Wetenschappelijk verwendet Vlaanderen (FWO) postdoctoral Fellowship (133722/1204517N) und die kontinuierliche Unterstützung der Fundación Herz-Kreislauf-de Colombia und die Administrative Abteilung Wissenschaft anerkennt, Technologie und Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projekt-Code 656671250485). M.M. wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium FWO (1S48018N). M.G.H. wurde durch eine institutionelle Förderung VIB und externe Unterstützung von Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), die Stiftung für Alzheimer-Forschung (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) und der European Research Council (ERC) (Starting Grant unterstützt. 281961 - AstroFunc; Nachweis der Concept Grant 713755 - AD-VIP). Die Autoren erkennen Jeason Haughton für seine Hilfe bei Maus Tierhaltung, Stephanie Castaldo für ihre Hilfe die Rute Vene Injektionen durchführen und Caroline Eykens für die Bereitstellung der Bilder von transfizierten Zellen HEK293T. M.G.H. räumt Michael Dunlop, Peter Hickman und Dean Harrison.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren beschrieben hier verwendet Materialien und Ausrüstung für die meisten molekularbiologischen Labors und Zelle-Kultur-Einrichtungen. Es ermöglicht dem Benutzer rein, präklinische Grade AAV-Vektoren zu erhalten, die auf mehrere Arten von Zellen und Gewebe in einem Spektrum von in Vitro und in Vivo Anwendungen verwendet werden kann. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls, im Vergleich zu anderen (d. h. CsCl-basierte Reinigung), ist die kürzere Arbeitszeit benötigt. Ready-to-Use-AAV-Vektoren sind erhältlich in maximal 6 Werktagen nach der anfänglichen Transfektion von HEK293T Zellen.
Mehrere Faktoren können die endgültige Rendite oder die Qualität des AAV Vektors negativ beeinflussen. Armen Transfection Leistungsfähigkeit ist einer der Hauptgründe für eine geringe virale Ausbeute33. Eine wichtige Empfehlung ist die Verwendung von HEK293T Zellen, die haben nicht mehr als 20 mal passagiert gewesen und haben keinen Zelle Zusammenfluss größer als 90 % zum Zeitpunkt der Transfektion21. Darüber hinaus hat die Transfektion Methode ausgewählt einen großen Einfluss auf die Ergebnisse. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von PEI. PEI ist ein kationisches Polymer mit der Lieferfähigkeit exogenen DNA in den Zellkern durch die Erzeugung von komplexen Polymer und Nukleinsäure, bekannt als Polyplexes, die durch die Zelle und verschleppte über Endosomen34aufgegriffen werden. PEI-basierte Transfektion ist einfach und schnell durchzuführen, im Gegensatz zu anderen weit verbreiteten Methoden wie die Co Fällung von DNA mit Calcium-Phosphat-35. PEI-basierte Transfektion ist auch viel billiger im Vergleich zu anderen neu eingeführten Methoden, z. B. die Verwendung von kationischen Lipiden und Magnet-vermittelte Transfektion36.
Die Reinigung-Strategie spielt eine Schlüsselrolle im Protokoll. Im Vergleich zu anderen Methoden, tendenziell Iodixanol-basierte Reinigungen einen höheren Anteil an leeren Viruspartikel (20 %)20enthalten. Dies ist, zu einem gewissen Grad dadurch kompensiert, dass Iodixanol-basierte Reinigung routinemäßig AAV Vektor Vorbereitungen mit einem Partikel-Infektiosität-Verhältnis von weniger als 100 ergibt. Dies bedeutet eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zu herkömmlichen CsCl-basierte Verfahren, für die erheblichen Verlust des Partikels Infektiosität gemeldeten37ist. Eine weitere gemeinsame alternative Methode zur AAV-Vektoren zu reinigen ist die Chromatographie-basierte Reinigung. Diese Methode hat jedoch den großen Nachteil, die eine bestimmte Spalte benötigt für jeden Vektor Kapsid verwendet wird: zum Beispiel während AAV2 klassisch mit Heparin Spalten isoliert ist, diese Methode funktioniert nicht mit AAV4 und AAV5, die keine Heparin-bindende besitzen Seiten auf ihre Capsids38. Wenn man bedenkt, dass Chromatographie Reinigung auch teuer ist, ist Iodixanol-basierte Reinigung in der Regel besser geeignet für Laboratorien, die wollen qualitativ hochwertigen Chargen der AAV-Vektoren auf einem kleinen Maßstab33,39, 40. jedoch um die letzte Ausbeute und Reinheit des Vektors zu maximieren, äußerste Sorgfalt ist erforderlich, wenn die Iodixanol Steigungen machen. Die verschiedenen Fraktionen Iodixanol sollte der Ultrazentrifugation Röhre mit einer sterilen Pasteurpipette, dessen Spitze die Wand des Rohres berührt, übertragen werden: Iodixanol sollte aus der Pipette ausgestoßen werden, langsam und kontinuierlich. Wie die Vektor-Partikel in der 40 % Iodixanol Schicht ansammeln, muss sorgfältig darauf zu achten, dass der Gradienten Schnittstellen nicht20mischen. Zu guter Letzt sollte die Fraktion mit den Vektor durch die Einfügung einer Edelstahl-stumpfen Nadel mit einem Messgerät nicht größer als 20 G. wiederhergestellt werden Zur Maximierung der Vektor Erholung soll der klaren Bruch in seiner Gesamtheit abgerufen werden. Während dieses Schrittes ist das Timing entscheidend. Um zu vermeiden, beeinträchtigen die Reinheit des Präparats, gilt es, die Sammlung zu stoppen, bevor andere (Verunreinigungen) Phasen des Verlaufs gesammelt werden.
Unterschiede in den erhaltenen Vektor-Titer können die intrinsische Fähigkeit des Vektors, verpackte Teilchen erzeugen auch zugeschrieben werden. Ein Vergleich zwischen verschiedenen AAV Serotypen hat gezeigt, dass einige AAV-Vektoren sind schwieriger zu einem höheren Titer als andere (z. B. AAV2) produzieren41. Niederschlag des Vektors, während der Entsalzung Schritt kann ein möglicher Grund für eine niedrigere Titer und leicht durch die Vermeidung von Überkonzentration33verhindert. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die Effizienz der Iodixanol Gradient basierende Reinigung leicht zwischen Serotypen unterscheidet und daher Abweichungen in der Titer mit verschiedenen Serotypen erhalten41beobachtet werden.
Schließlich muss darauf hingewiesen werden, dass obwohl qPCR ein sehr genaues Verfahren zur DNA-Quantifizierung ist einige inhärente Variabilität in der Technik beobachtet werden kann. Genauigkeit bei der Titration ist in erster Linie abhängig von präzises pipettieren und ordnungsgemäße vortexen aller Lösungen. Um die genauesten Titer lesen zu gewährleisten, kann die qPCR selbstständig wiederholt werden, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Wahl der Primer präsentiert in diesem Protokoll basiert auf der Reihenfolge der CBA-Promotors befindet sich in der pTransgene-Plasmid in unserem Labor verwendet. Der CBA-Promoter ist ein starke synthetische Förderer, die in das Vektorfeld auf Laufwerk Ausdruck über mehrere Zelltypen verbreitet ist. Es enthält mehrere Elemente, einschließlich das Cytomegalovirus (CMV) frühen Enhancer-Element; der Projektträger, ersten Exon und die ersten Intron des CBA-Gens; und den Spleiß-Akzeptor des Kaninchen-β-Globin-Gens. Jedoch können Primer für nahezu jedes Element innerhalb der Expressionskassette (einschließlich der Projektträger, Transgen und regulatorische Elemente) ausgelegt werden. Der Vergleich der Titer in Chargen ist auch möglich, die Primer gegen Regionen üblich, die betreffenden Vektoren eingesetzt werden.
Abschließend kann dieses Protokoll verwendet werden, um AAV-Vektoren mit einer Vielzahl von Capsids, Genom-Konfigurationen, Projektträger Typen und Transgen Ladungen zu produzieren. Dies ermöglicht Benutzern die endgültigen Eigenschaften ihrer Vektoren zu experimentellen Anforderungen am besten entsprechen anpassen. Im Beispiel in die repräsentativen Ergebnisse präsentiert die Verwendung von PHP. B Kapsid, die effizient die BBB kreuzt, gab hocheffiziente Genexpression im ZNS, folgende Rute Vene Injektion32. Die systemische Gabe von CNS Durchdringungsmittel Vektoren hat erhebliche Vorteile in Bezug auf mögliche Nebenwirkungen2,17,32. Eine mögliche Alternative zur peripheren Injektion unter Vermeidung der Vorbehalte der invasiven Techniken ist intrathekale Lieferung, bestehend aus Lieferung von der AAV-Vektor in die cerebrospinale Flüssigkeit. Diese Tour ist als wirksam erwiesen, weit verbreitete Ausdruck des Transgens über ZNS, weniger Ziel Wirkungen in peripheren Organe und geringe Immunantwort42zeigen. Jedoch sind intrathekale Injektion viel schwieriger, da sie höhere technische Fähigkeiten als Rute Vene Injektion erfordern.
Die Chancen für AAV Vektor Gen-Therapie-Anwendungen werden Kapsid Weiterentwicklung dieser Technologie verfeinern angetrieben. Solche Ansätze bieten attraktive Möglichkeiten zur Behandlung von unheilbarer CNS-Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Parkinson und Alzheimer-Krankheit18.

In den letzten 30 Jahren wurden Wildtyp Flugabwehrpanzer entwickelt, rekombinante AAV-Vektoren zu erstellen, die haben sich als außerordentlich nützliche Werkzeuge für den Gentransfer in die CNS1,2,3,4, 5,6 und Gen-Therapie Ansätze zur Krankheit (einschließlich der FDA und EMA zugelassene Therapien)4,7. Ihre Eignung für den Einsatz im ZNS ergibt sich weitgehend aus ihrer Fähigkeit, nicht teilen, Post-mitotische Zellen infizieren, in der Regel in der CNS8gefunden. AAV-basierte Vektoren haben jedoch auch den Vorteil, dass einen langfristige Ausdruck von jedem gegebenen therapeutischen Transgen4,9 während eine milderen Immunantwort im Vergleich zu anderen viralen Vektoren7zu entlocken, 8,10,11,12.
Die wichtigsten Elemente der jeden Vektor AAV sind das Genom und das Kapsid. Wildtyp Flugabwehrpanzer sind einzelsträngig (ss) DNA-Viren mit einem Genom ca. 5 Kilobases (kb)13. Für die Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren, die Rep und GAP Genen (notwendig für die Replikation des Genoms und die Montage von viralen Kapsid) aus dem Genom der Wildtyp AAV gelöscht und in Trans, lässt Raum für eine Expressionskassette enthält die Transgen-14,-15. Die invertierten terminal wiederholte Sequenzen (ITRs) des ursprünglichen Virusgenoms sind die einzigen beibehaltene Elemente in einen Vektor AAV sind unerlässlich für die Replikation und Verpackung3,10,14. AAV-Vektoren können entwickelt werden, um Transgene Ausdruck zu verbessern; eine Mutation in einem der ITRs führt zur Bildung einer Haarnadel-Schleife, die effektiv die Erzeugung eines komplementären DNA-Strang3,7,15 ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Konfiguration, eine selbst-ergänzende (sc) Genom bezeichnet ist, dass es die Notwendigkeit einer zweiten Strang Synthese typisch in den herkömmlichen Lebenszyklus der Flugabwehrpanzer, erheblich erhöhen die Geschwindigkeit und die Höhe der Transgen-Expression umgeht 1. dennoch mit einem ScAAV Genom die Ladekapazität des Vektors auf ca. 2,4 kb reduziert. Dazu gehören Transgen-Sequenzen, sowie alle regulatorischen Sequenzen wie Promotoren oder MicroRNA-Bindungsstellen, Ausdruck auf bestimmte Zelle Arten16zu beschränken.
Das AAV-Kapsid bestimmt die Vektor-Host Zelle Interaktion und verleiht ein Maß an Zelle Typ oder Gewebe Tropismus für ein AAV-Serotyp, die auch ausgenutzt werden kann, um Transgene Ausdruck an bestimmte Orte zu beschränken. Mehreren AAV Serotypen sind in der Natur gefunden, während andere im Labor durch rekombinante Ansätze (z.B. PHP. hergestellt wurden (B). Darüber hinaus einige Capsids verleihen auch andere nützlichen Eigenschaften, wie die Fähigkeit, die BBB, wodurch die Lieferung von transgenen in der CNS nach systemischen Verabreichung zu überqueren. Dies hat für AAV9 sowie für die kürzlich beschriebene PHP gezeigt. B Kapsid17. Infolgedessen sind diese Serotypen erweist sich als besonders relevant für neue Gen-Therapie-Ansätze für Neurodegenerative Erkrankungen1,17,18.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine kostengünstige Methode für die Kleinserienproduktion der AAV-Vektoren mit hoher Titer und Reinheit zu beschreiben. Obwohl die hier vorgestellten Ergebnisse die PHP verwenden. B Kapsid und ein ScAAV Expressionskassette, eignet sich das Protokoll für die Produktion von mehreren AAV-Vektor-Serotypen und Genom-Konfigurationen, maximale experimentelle Flexibilität erlaubt. Jedoch können der Vektor Ertrag und die endgültige Reinheit abhängig von der gewählten Serotyp variieren.
Das Protokoll selbst ist eine Variante der klassischen Tri-Transfektion Methode für die Produktion von viralen Vektoren und beinhaltet die Verwendung von einer Iodixanol Steigung für Vektor-Bereinigung, die, im Vergleich zu der klassischen Verwendung von Cäsium-Chlorid (CsCl) Gradienten, wurde berichtet, dass um AAV-Vektoren von höherer Reinheit in einer Zeit effizienter Weise19,20,21zu produzieren.
Die Transfektion, Reinigung und Konzentration Schritte sollen entsprechend gute Laborpraxis (GLP) durchgeführt werden, in einer Gewebekultur Labor für virale Vektor Arbeit bewertet. Jede Aufgabe muss in Übereinstimmung mit den einschlägigen lokalen und nationalen Rechtsvorschriften zur Produktion von viralen Vektoren durchgeführt werden und verwenden. Arbeit muss unter einem Laminar-Flow-Haube und unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Im Inneren der Vektor-Anlage empfiehlt es sich, einen Laborkittel, zusätzlich zu den regulären Gewebekultur Laborkittel zu tragen. Darüber hinaus sollte ein doppeltes Paar Handschuhe sowie Kunststoff Überschuhe jederzeit getragen werden.
Vor Beginn der Vektor-Produktion gewährleisten die notwendige Ausrüstung und Plasmide verfügbar sind. (1) pCapsid Plasmid enthält das Rep -gen, das vier Nichtstrukturproteinen notwendig für die Replikation, Rep78, Rep68, Rep52 und Rep40, codiert und der GAP -gen, das drei strukturelle Kapsid-Proteine, nämlich VP1, VP2 und VP3 kodiert. (2) pHelper Plasmid enthält die Gene, E4, E2Aund VA von Adenovirus, die AAV Produktion in HEK293T Zellen zu erleichtern. (3) pTransgene Plasmid enthält das Transgen Expressionskassette, flankiert von zwei ITRs. Diese Plasmide kann synthetisiert de Novo im Labor mit Sequenzen zur Verfügung online-22. Für Plasmide de Novogemacht ist vor allem solche, die neuartige transgene Sequenzierung erforderlich, um sicherzustellen, dass das Transgen und ITRs korrekt sind. Vorgefertigten Plasmide können alternativ direkt durch Online-Plasmid Repositories erworben werden. Bei Bedarf, Plasmide können verstärkt werden und gereinigt mit standard-Kits, gemäß des Herstellers Anweisungen23.
Vektor-Titer und Reinheit können die Transduktion Fähigkeit des Vektors beeinträchtigen. Zusatzprotokolle werden geliefert, um die Qualität des produzierten Vektors zu bewerten. Die endgültige Vektoren werden für Studien der CNS-Zellfunktion in in Vitro und in Vivo Anwendungen nützlich sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gen Lieferung Tools basierend auf Adeno-assoziierten Viren (Flugabwehrpanzer) sind eine beliebte Wahl für die Lieferung von transgenen an das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich Gen-Therapie-Anwendungen. AAV-Vektoren sind nicht replizieren, trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und bieten langfristigen Transgene Ausdruck. Wichtiger ist, einige Serotypen, wie die neu beschriebene PHP. B, kann über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in Tiermodellen, nach systemischen Lieferung. AAV-Vektoren können effizient im Labor hergestellt werden. Stabile und reproduzierbare Protokolle sind jedoch erforderlich, AAV-Vektoren mit ausreichend Reinheitsgrade und Titer Werte hoch genug für in-Vivo Anwendungen zu erhalten. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Strategie für AAV Vektor Produktion, basierend auf einer Iodixanol gradient Reinigung Strategie. Die Iodixanol Reinigungsverfahren eignet sich für Chargen von hoher Titer AAV-Vektoren von hoher Reinheit zu erhalten, im Vergleich zu anderen Reinigungsverfahren. Darüber hinaus ist das Protokoll in der Regel schneller als andere Methoden, die derzeit beschrieben. Darüber hinaus eine quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)-Strategiespiel ist für eine schnelle und genaue Bestimmung der Vektor-Titer, sowie eine silberne Färbung Methode festzustellen, die Reinheit der Vektor Charge beschrieben. Zu guter Letzt repräsentative Ergebnisse der gen-Lieferung an die CNS nach systemischer Gabe von AAV-PHP. B, werden vorgestellt. Solche Ergebnisse sollte in allen Labors mit den Protokollen, die in diesem Artikel beschriebenen möglich sein.

AAV9 galt bis vor kurzem die effektivste AAV Vektor Serotyp überqueren die BBB und transducing Zellen des ZNS, nach peripheren Gabe sein. Ein wichtiger Fortschritt im Kapsid Design wurde erreicht bei Deverman Et Al. berichtet ein Kapsid-Auswahl-Methode namens Cre Rekombination basierende AAV-bezogene Entwicklung (CREATE)17. Mit dieser Methode identifiziert sie eine neue Kapsid, PHP benannt. B, die sie in der Lage, die Mehrheit der Astrozyten und Neuronen in mehreren CNS Regionen nach systemische Injektion17transduzieren ausgewiesen. Es sollte an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass auch wenn PHP. B liefert positive Ergebnisse bei C57/Bl6 Mäusen (die der Stamm in der ersten Isolierung Experimente verwendet wurde), vorläufige Berichte deuten darauf hin, dass seine Effizienz in einem Stamm-abhängigen Weise variieren. Weitere Experimente werden, kein Zweifel, mehr Licht auf diese Frage31.
Doch trotz dieser Probleme, PHP. B bietet spannende Möglichkeiten für nicht-invasive Genmanipulation im ZNS von Mäusen, einschließlich Beweis-vonkonzept Gen Therapie Experimente in Krankheitsmodellen. Als solche haben wir die Effizienz der Transgen-Ausdruck mit Hilfe von PHP zu bewerten. B im Vergleich zu AAV9, die der "Goldstandard" Vektor für CNS Transduktion nach peripheren Gabe seit 20092wurde. Um einen direkten Vergleich der beiden Serotypen, unter optimalen Bedingungen für Transgene Ausdruck durchführen haben wir ein sc Genom Konfiguration32verwendet. Beide Vektoren durchgeführt das Transgen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle des Veranstalters allgegenwärtigen Huhn β-Aktin (CBA). Weibliche C57/Bl6 Mäuse an postnatalen Tag 42 (Gewicht ca. 20 g) erhalten eine Dosis von 1 x 1012 Vg per Mausklick entweder scAAV2/PHP. B-CBA-GFP oder scAAV2/9-CBA-GFP. Vektor-Verwaltung wurde durchgeführt über Heck Vene Injektion. Die Experimente wurden von der Ethikkommission der KU Leuven genehmigt.
Drei Wochen Steroidtherapie, unterzog sich die Mäuse Transcardial Perfusion mit eiskaltem PBS, gefolgt von 4 % (w/V) eiskalte Paraformaldehyd (PFA). Ihre Gehirne wurden geerntet und weitere Postfixation durch eine Übernachtung Inkubation in der gleichen Fixiermittel vor der Übertragung auf 0,01 % (w/V) Na-Azid/PBS für die Lagerung bis zur weiteren Analyse unterzogen. Danach die Gehirne wurden mit Hilfe einer vibrierenden Mikrotom geschnitten und Immunohistochemistry wurde auf 50 µm dicke Schichten durchgeführt.
Um die Höhe der Transgen-Expression zu bewerten, wurden Abschnitte mit primären Antikörper gegen GFP (Kaninchen Anti-GFP), gebeizt, mit Erkennung mit sekundären Antikörper konjugiert zu einem Fluoreszenzfarbstoff (Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488) (Abbildung 4A, B ). Fluoreszenz-Intensität-Messungen (in beliebigen Einheiten [au]) bestätigt eine deutliche Zunahme der GFP-Ausdruck, wenn ein sc Genom und PHP. B-Kapsid dienten im Vergleich zu AAV9. Beobachtet wurden Erhöhungen der GFP in das Großhirn (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), das Kleinhirn (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), und dem Hirnstamm (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Abbildung 4: systemische Lieferung von scAAV2/PHP. B-CBA-GFP führt zu einer hohen GFP Ausdruck im ZNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP oder scAAV2/9-CBA-GLP (1 x 1012 Vg/Maus) war 6 Wochen alten C57/Bl6 Mäuse über Heck Vene Injektion verabreicht. GFP wurde mit Immunohistochemistry auf koronalen Gehirn Abschnitte 3 Wochen Steroidtherapie nachgewiesen. (A) das Großhirn und (B) das Kleinhirn und der Hirnstamm gezeigt. Skalieren von Balken = 1 mm. (C) die Quantifizierung der relativen Fluoreszenz Intensität durchgeführt wurde, um festzustellen, das Niveau der GFP Signal mit jeder Vektor (10 Teile pro Maus; drei Mäuse pro Schaltgruppe) erreicht. Ein One-Way ANOVA durchgeführt wurde, gefolgt von einem zweiseitigen Student t-test; die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; p < 0,01; Au. willkürliche Einheiten. pCapsid, verwendet für AAV-Vektor-Produktion, enthält gen Rep vom Serotyp 2 und die gen- Kappe vom Serotyp PHP. B oder AAV9, entsprechend. Diese Zahl wurde von Rincon geändert Et Al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Durch die Befolgung dieses Protokolls wird der Benutzer in der Lage sein, AAV-Vektoren von hoher Reinheit und Ausbeute zu produzieren, die für In-vitro- oder In-vivo-Anwendungen geeignet sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Reihe von AAV-Serotypen mit unterschiedlichen Konfigurationen zu erzeugen und zu reinigen. Das Kombinieren dieser beiden Elemente kann nützlich sein, um zelltyp- und gewebespezifische Expression zu erhalten.Die Produktion einiger Serotypen kann zu einem geringeren Ertrag führen. Dies ist eine Produktion, in der es enge Serotypen gibt und individuell bewertet werden sollte. Die Technische Daten dieser Verfahren wird Shelly Fripont, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren.Nach dem Anbau der HEK-Zellen mischen Sie 360 Mikrogramm Hilfsplasmid, 180 Mikrogramm Plasmid, das für das Vektorcapsid kodiert, und 180 Mikrogramm Plasmid, das das Transgen enthält, in 18 Milliliter 150 Millimollar-Natriumchlorid, um den DNA-Mix vorzubereiten. Verteilen Sie diese Mischung über drei 50 Milliliter konische Röhren. Mischen Sie in einer neuen konischen Röhre 840 Mikrogramm PEI und sechs Milliliter 150 Millimolarenatriumchlorid, um den PEI-Mix für sechs Zellkulturgerichte vorzubereiten.Dann fügen Sie sechs Milliliter der PEI-Mischung, Tropfen für Tropfen, zu einem der konischen Röhren, die den DNA-Mix enthalten. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes entfernen Sie sechs Zellkulturgerichte aus dem Brutkasten.In einer laminaren Strömungshaube, das Medium von jeder Schale vollständig aspirieren. Spülen Sie die Gerichte mit fünf Millilitern vorgewärmter DPBS, um Spuren des Mediums zu entfernen. Neigen Sie vorsichtig jede Schale, um sicherzustellen, dass DPBS gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt ist.Dann, saugen Sie die DPBS vorsichtig an. Fügen Sie 12 Milliliter DMEM eins zu jeder Schale langsam, mit einer Pipette am Rand der Schale platziert. Mischen Sie die PEI- und DNA-Mischung, indem Sie sie drei- bis fünfmal nach oben und unten pipetieren.Fügen Sie zwei Milliliter dieser Mischung zu jedem der sechs Zellkultur-Gerichte in einer Tropfen-für-Tropfen-Mode, um sicherzustellen, dass sorgfältig über die gesamte Oberfläche zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit sechs Zellkulturgerichten gleichzeitig, bis 18 Zellkulturgerichte erreicht sind. Schütteln Sie vorsichtig die Zellkultur-Gerichte, um die PEI-DNA-Mischung zu verteilen.Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius mit 95 Prozent Luftfeuchtigkeit und fünf Prozent Kohlendioxid für fünf Stunden. Danach fügen Sie jedem der 18 Gerichte weitere 12 Milliliter DMEM 10 hinzu, ohne das bereits vorhandene Medium zu entfernen. Setzen Sie die Inkubation der transfizierten Zellen unter den gleichen Bedingungen fort.Nach 72 Stunden nach der Transfektion verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sorgfältig von jeder Kulturschale zu lösen. Sammeln Sie das Medium und die Zellen von zwei Kulturgerichten in einer 15 Milliliter konischen Röhre, auf Eis gehalten. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 420 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, wobei die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf maximum eingestellt ist.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus jedem Rohr, indem Sie ihn vorsichtig in einen Entsorgungsbehälter gießen. Legen Sie dann die Rohre, die die Zellpellets enthalten, auf Eis. Wir hängen jedes Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer aus und mischen, indem wir fünf- bis zehnmal nach oben und unten pfeifen.Ziehen Sie den AAV aus drei Rohren zusammen. Zunächst frieren Sie die wieder suspendierten Zellen ein, indem Sie sie in einen Eimer mit Trockeneis, das mit Ethanol vermischt ist, legen. Dann tauen Sie die Zellen auf, indem Sie sie sofort in ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius legen.Wiederholen Sie diesen Gefrier- und Tauzyklus dreimal, um die Zellen zu lysieren und die AAV-Partikel freizusetzen. Nach dem dritten Auftauschritt zentrifugieren Sie bei 1167 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie die Überräube vorsichtig, um 50 Milliliter konische Rohre zu reinigen.Fügen Sie jedem Rohr Nuklease zu einer Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter Überstand hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, während die Rohre alle 10 Minuten wirbeln, um sicherzustellen, dass die Nuklease gründlich mit dem Überstand gemischt wird. Zentrifuge bei 13490 mal G und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um den Überstand zu klären.Danach entfernen Sie den Kolben einer 10-Milliliter-Spritze, befestigen Sie einen 0,45-Mikrometer-Filter an der Spritze und legen Sie ihn auf ein sauberes 50-Milliliter-Konusrohr. Füllen Sie die Spritze vorsichtig mit dem geklärten Überstand. Verwenden Sie den Kolben, um das Lysat durch den Filter zu erzwingen.Als nächstes bereiten Sie jede der Iodixanol-Fraktionen in vier separaten 50 Milliliter konischen Röhren vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Pipette acht Milliliter von 15 Prozent Iodixanol in jedes der drei Ultrazentrifugenrohre. Pipette 5,5 Milliliter von 25 Prozent Iodixanol in eine saubere 50 Milliliter konische Röhre.Mit einer nicht-graduierten Pasteur Pipette, sorgfältig Schicht 5,5 Milliliter von 25 Prozent Iodixanol Lösung unter der 15 Prozent Iodixanol-Lösung. Fügen Sie die Lösungen von 40 % und 60 % hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Iodixanol-Fraktionen sollten sich nicht bei der Schichtung vermischen.Mit einer Pasteur-Pipette, Schicht das grobe Lysat auf die 15 Prozent Iodixanol Gradient, Tropfen für Tropfen, um zu vermeiden, stören die Schnittstelle zwischen dem rohen Lysat und der Iodixanol-Lösung. Füllen Sie jedes Ultrazentrifugationsrohr mit Lysepuffer, bis der Meniskus die Basis des Rohrhalses erreicht, um sicherzustellen, dass das Rohr nicht unter den sehr hohen Kräften zusammenbricht, die während der Ultrazentrifugation erzeugt werden. Schließen Sie die Rohre mit geeigneten Deckeln.Stellen Sie mit einer digitalen Waage sicher, dass alle drei Ultrazentrifugationsrohre das gleiche Gewicht haben. Anpassen des Gewichts nach Bedarf, indem mehr Lysepuffer auf dem Rohlysat hinzugefügt wird. Verwenden Sie einen festen Winkel TitanRotor, um die Rohre bei 301580 mal G und bei 12 Grad Celsius für eine Stunde und 40 Minuten mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren.Als nächstes befestigen Sie eine Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie den Abstandsraum aus den Rohren im Rotor, und bergen Sie die Rohre nach der Zentrifugalisierung zurück. Aspirieren Sie nur die 40-prozentige Iodixanol-Fraktion, die die Vektorpartikel enthält.Verarbeiten Sie die Probe oder lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Hier wird ein Protokoll demonstriert, das zur Herstellung von AAV-Vektoren mit einer Vielzahl von Kapsiden, Genomkonfigurationen, Promotortypen und Transgenladungen verwendet werden kann. In diesem Beispiel haben wir zwei verschiedene AAV-Vektoren produziert und gereinigt, die das grüne fluoreszierende Protein aus einem selbstkomplementären Genom exprimierten.Die beiden Vektoren unterscheiden sich durch verschiedene Capsids: PHPB und AAV9. Sie wurden mittels Schwanzveneninjektion in erwachsene C57-schwarze sechs Mäuse abgegeben. Um die Transgenexpression drei Wochen nach der Injektion zu bewerten, werden Abschnitte mit primären Antikörpern gegen GFP mit Detektion mit sekundären Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sind, gefärbt.Fluoreszenzintensitätsmessungen zeigen eine signifikante Zunahme der GFP-Expression, wenn der PHPB-Vektor relativ zu AAV9 verwendet wird. Zuwächse in GFP wurden im Großhirn, im Kleinhirn und im Hirnstamm beobachtet. Die genaue Erfassung des Vektors, der den Bruch enthält, ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung.Falls dies nicht richtig gemacht wird, werden die Vektorausbeute sowie die Vektorreinheit beeinträchtigt. In der Lage, AAV-Vektoren zu produzieren, werden kleine Labore in der Lage sein, zahlreiche experimentelle Möglichkeiten zu nutzen, um Gene im zentralen Nervensystem zu liefern. Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge und es ist wichtig, eine angemessene Schulung zu erhalten, bevor Sie dies behandeln, um Unfälle zu vermeiden.Darüber hinaus werden AAV-Vektoren oft als Biogefahren eingestuft und daher sollten Sie lokale Vorschriften konsultieren, bevor Sie sie behandeln und verwalten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Eine radgesteuerte Gaming-Plattform zum Studium der menschlichen sensorimotorischen Steuerung

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...