Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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यूननट एक शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) postdoctoral फैलोशिप (133722/1204517N) द्वारा समर्थित है और Fundación हृदय डे कोलंबिया और विज्ञान के प्रशासनिक विभाग के सतत समर्थन स्वीकार करता है, प्रौद्योगिकी और नवाचार (अनुदान सीटी-FP44842-307-2016, परियोजना कोड ६५६६७१२५०४८५). M.M. an FWO डॉक्टरेट फैलोशिप (1S48018N) द्वारा समर्थित है । M.G.H. एक VIB संस्थागत अनुदान और थियरी Latran फाउंडेशन (वतन वीआईपी), अल्जाइमर अनुसंधान (साओ-एफआरए) (पी # 14006), FWO (अनुदान 1513616N), और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) के लिए फाउंडेशन से बाहरी समर्थन द्वारा समर्थित था (शुरू अनुदान २८१९६१-AstroFunc; अवधारणा अनुदान ७१३७५५-विज्ञापन-वीआईपी) का सबूत । लेखक माउस पशुपालन के साथ उनकी मदद के लिए Jeason Haughton स्वीकार करते हैं, उसे पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने में मदद के लिए स्टेफ़नी Castaldo, और Eykens transfected कोशिकाओं की छवियों को प्रदान करने के लिए कैरोलीन HEK293T । M.G.H. माइकल डनलप, पीटर Hickman, और डीन हैरिसन स्वीकार करता है ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर का उत्पादन यहां वर्णित सामग्री और सबसे आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं और सेल संस्कृति सुविधाओं के लिए आम उपकरण का उपयोग करता है । यह उपयोगकर्ता शुद्ध प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, नैदानिक ग्रेड AAV वैक्टर कि इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में की एक श्रृंखला में एकाधिक सेल और ऊतक प्रकार के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का सबसे बड़ा लाभ में से एक, दूसरों की तुलना में (यानी, CsCl आधारित शुद्धि), कम काम समय की जरूरत है । तैयार करने के लिए उपयोग AAV वैक्टर HEK293T कोशिकाओं के प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद 6 कार्य दिवसों की एक अधिकतम में प्राप्य हैं ।
कई कारकों नकारात्मक अंतिम उपज या AAV वेक्टर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । गरीब अभिकर्मक दक्षता एक कम वायरल उपज३३के लिए मुख्य कारणों में से एक है । एक प्रमुख सिफारिश HEK293T कोशिकाओं है कि 20 से अधिक बार नहीं किया गया है और एक सेल संगम अभिकर्मक21के समय ९०% से अधिक नहीं है का उपयोग है । इसके अलावा, अभिकर्मक विधि चयनित परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है । यह प्रोटोकॉल बेई के उपयोग पर आधारित है । पी बेई और न्यूक्लिक एसिड के परिसरों की पीढ़ी के माध्यम से सेल नाभिक को exogenous डीएनए देने की क्षमता के साथ एक cationic बहुलक है, polyplexes, जो सेल द्वारा उठाए गए है और endosomes३४के माध्यम से अवैध रूप से जाना जाता है के रूप में जाना जाता है । पी-आधारित अभिकर्मक आसान और तेजी से प्रदर्शन करने के लिए है, इसके विपरीत में अन्य व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों, जैसे कैल्शियम फॉस्फेट३५के साथ सह डीएनए की वर्षा के रूप में. इसके अलावा, पी आधारित अभिकर्मक बहुत सस्ता है जब अंय नए शुरू तरीकों की तुलना में ऐसे cationic लिपिड और चुंबक के उपयोग के रूप में, अभिकर्मक३६मध्यस्थता ।
शुद्धिकरण रणनीति प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । अंय तरीकों की तुलना में, iodixanol आधारित शुद्धि के लिए खाली वायरल कणों का एक उच्च प्रतिशत शामिल करते है (20%)20। यह ऑफसेट है, एक हद तक, तथ्य यह है कि iodixanol आधारित शुद्धि नियमित रूप से एक कण के साथ AAV सदिश की तैयारी में परिणाम-से कम १०० के अनुपात infectivity । यह पारंपरिक CsCl-आधारित प्रक्रियाओं की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके लिए कण infectivity की पर्याप्त हानि३७की सूचना दी है । एक अंय आम वैकल्पिक विधि AAV वैक्टर शुद्ध करने के लिए क्रोमैटोग्राफी आधारित शुद्धि है । हालांकि, इस विधि प्रमुख दोष है कि एक विशिष्ट कॉलम प्रत्येक वेक्टर कैप्सिड इस्तेमाल के लिए आवश्यक है: उदाहरण के लिए, जबकि AAV2 प्रतिष्ठित हेपरिन कॉलम का उपयोग कर अलग है, इस पद्धति AAV4 और AAV5, जो हेपरिन-बाध्यकारी अधिकारी के साथ काम नहीं करता है उनके capsids३८पर साइटें । यह देखते हुए कि क्रोमैटोग्राफी शुद्धि भी महंगा है, iodixanol आधारित शुद्धि आम तौर पर एक छोटे पैमाने३३,३९पर AAV वैक्टर के उच्च गुणवत्ता बैचों का उत्पादन करने के लिए इच्छा है कि प्रयोगशालाओं के लिए अधिक उपयुक्त है, ४०. हालांकि, अंतिम उपज और सदिश की शुद्धता को अधिकतम करने के लिए, चरम देखभाल की जरूरत है जब iodixanol ढाल बनाते हैं । विभिंन iodixanol भिन्न ultracentrifugation ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट जिसका टिप ट्यूब की दीवार को छू रहा है का उपयोग कर: iodixanol धीरे और लगातार पिपेट से निष्कासित कर दिया जाना चाहिए. के रूप में वेक्टर कणों ४०% iodixanol परत में जमा, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि ढाल इंटरफेस20मिश्रण नहीं है लिया जाना चाहिए । अंत में, सदिश युक्त अंश 20 ग्राम से अधिक नहीं गेज के साथ एक स्टेनलेस स्टील कुंद सुई के सम्मिलन से पुनर्प्राप्त किया जाना चाहिए वेक्टर वसूली को अधिकतम करने के लिए, स्पष्ट अंश अपनी संपूर्णता में प्राप्त किया जाना चाहिए । इस चरण के दौरान, समय महत्वपूर्ण है । तैयारी की पवित्रता समझौता से बचने के लिए, यह आवश्यक है कि संकलन को रोकने के लिए अंय (दूषित) ढाल के चरणों से पहले एकत्र कर रहे हैं ।
प्राप्त वेक्टर titer में अंतर भी वेक्टर के डिब्बाबंद कणों का उत्पादन करने के लिए आंतरिक क्षमता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । विभिंन AAV serotypes के बीच एक तुलना पता चला है कि कुछ AAV वैक्टर अधिक दूसरों की तुलना में एक उच्च titer में उत्पादन मुश्किल है (जैसे, AAV2)४१। वेक्टर की वर्षण के दौरान, एक कम titer के लिए एक संभावित कारण हो सकता है और आसानी से३३एकाग्रता से परहेज द्वारा रोका । इसके अलावा, यह भी संभव है कि iodixanol ढाल आधारित शुद्धि की दक्षता थोड़ा serotypes के बीच अलग है और इसलिए, अलग serotypes के साथ प्राप्त titer में विसंगतियों४१मनाया जा सकता है ।
अंत में, यह कहा जा करने की जरूरत है कि भले ही qPCR डीएनए के लिए एक बहुत ही सटीक तरीका है ठहराव तकनीक में कुछ निहित परिवर्तनशीलता मनाया जा सकता है । अनुमापन में सटीकता मुख्य रूप से सटीक pipetting और सभी समाधानों के उचित भंवर पर निर्भर करता है । सबसे सटीक titer पढ़ने की गारंटी के लिए, qPCR स्वतंत्र रूप से दोहराया जा सकता है, और प्राप्त मूल्यों औसत । इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्राइमरों का चुनाव हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त pTransgene प्लाज्मिड में स्थित CBA प्रवर्तक के अनुक्रम पर आधारित है. CBA प्रमोटर एक मजबूत सिंथेटिक प्रमोटर है कि व्यापक रूप से वेक्टर क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है एकाधिक सेल प्रकार के पार अभिव्यक्ति ड्राइव है । यह cytomegalovirus (सीएमवी) जल्दी बढ़ाने तत्व सहित कई तत्वों, शामिल हैं; प्रवर्तक, प्रथम एक्सॉन, और CBA जीन के प्रथम intron; और खरगोश β-ग्लोबिन जीन का ब्याह स्वीकार । हालांकि, प्राइमर वस्तुतः किसी भी अभिव्यक्ति कैसेट (प्रमोटर, transgene, और विनियामक तत्वों सहित) के भीतर स्थित तत्व के लिए डिजाइन किया जा सकता है । बैचों भर में titer की तुलना भी संभव है, प्राइमरों के लिए आम क्षेत्रों के खिलाफ इस्तेमाल किया जाता है सवाल में वैक्टर ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल के लिए capsids, जीनोम विंयास, प्रमोटर प्रकार और transgene कार्गो की एक किस्म के साथ AAV वैक्टर उत्पादन किया जा सकता है । यह उपयोगकर्ताओं को आसानी से अपने वैक्टर के अंतिम विशेषताओं के अनुकूलन के लिए सबसे अच्छा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप करने की अनुमति देगा । प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत उदाहरण में, PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड, जो कुशलतापूर्वक BBB पार, सीएनएस में अत्यधिक कुशल जीन अभिव्यक्ति दी, निंनलिखित पूंछ नस इंजेक्शन३२। सीएनएस व्याप्ति वैक्टर के प्रणालीगत प्रशासन संभव पक्ष प्रभाव2,17,३२के मामले में काफी लाभ है । परिधीय इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प है, जबकि आक्रामक तकनीक की निरंतर परहेज, intrathecal वितरण है, जो मस्तिष्कमेरु द्रव में AAV वेक्टर के वितरण के होते हैं । इस वितरण मार्ग को प्रभावी, सीएनएस भर में transgene की व्यापक अभिव्यक्ति दिखा साबित हो रहा है, कम से परिधीय अंगों में लक्ष्य प्रभाव, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया४२के निंन स्तर । वे पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में उच्च तकनीकी कौशल की आवश्यकता के रूप में हालांकि, intrathecal इंजेक्शन, बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण हैं ।
इसके अलावा कैप्सिड विकास इस प्रौद्योगिकी को परिष्कृत करने के लिए जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में AAV वेक्टर उपयोग के लिए अवसरों के द्वारा संचालित किया जाएगा । इस तरह के दृष्टिकोण पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग18के रूप में वर्तमान में लाइलाज सीएनएस विकारों के इलाज के लिए आकर्षक संभावनाएं प्रदान करते हैं ।

पिछले 30 वर्षों में, वंय प्रकार AAVs को रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर, जो1,2,3,4सीएनएस में जीन हस्तांतरण के लिए असाधारण उपयोगी उपकरण साबित हो गया है बनाने के लिए इंजीनियर किया गया है, 5,6 और जीन थेरेपी रोग के लिए दृष्टिकोण (एफडीए सहित-और EMA-अनुमोदित चिकित्सा)4,7। सीएनएस में उपयोग के लिए उनकी उपयुक्तता काफी हद तक संक्रमित गैर-विभाजित, पोस्ट-mitotic कोशिकाओं, आम तौर पर8सीएनएस में पाया करने की क्षमता से निकला है । हालांकि, AAV आधारित वैक्टर भी किसी भी चिकित्सीय transgene4,9 की एक लंबी अवधि के अभिव्यक्ति की अनुमति का लाभ है, जबकि अंय वायरल वैक्टर7की तुलना में एक मामूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना, 8,10,11,12.
किसी भी AAV वेक्टर के मुख्य तत्व जीनोम और कैप्सिड हैं । वाइल्ड-टाइप AAVs लगभग 5 kilobases (केबी)13के जीनोम के साथ सिंगल-कतरा (ss) डीएनए वायरस है । रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर के उत्पादन के लिए, प्रतिनिधि और टोपी जीन (जीनोम प्रतिकृति और वायरल कैप्सिड के विधानसभा के लिए आवश्यक) जंगली प्रकार AAV के जीनोम से हटा दिया और ट्रांस मेंप्रदान की जाती हैं, एक के लिए कमरे में जा अभिव्यक्ति कैसेट युक्त transgene14,15. उल्टे टर्मिनल दोहराने अनुक्रम मूल वायरल जीनोम के (ITRs) एक AAV वेक्टर में ही बने तत्वों रहे हैं, के रूप में इन प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए आवश्यक है3,10,14। AAV वैक्टर transgene अभिव्यक्ति बढ़ाने के लिए इंजीनियर जा सकता है; ITRs में से एक में उत्परिवर्तन एक hairpin पाश के गठन की ओर जाता है जो प्रभावी ढंग से एक पूरक डीएनए किनारा3,7,15की पीढ़ी की अनुमति देता है । इस विंयास का मुख्य लाभ, एक आत्म पूरक (अनुसूचित जाति) जीनोम, कि यह AAVs के पारंपरिक जीवन चक्र में ठेठ दूसरा किनारा संश्लेषण की आवश्यकता नजरअंदाज, काफी गति और transgene अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि 1. फिर भी, एक scAAV जीनोम का उपयोग कर लगभग २.४ kb के लिए वेक्टर के कार्गो क्षमता कम कर देता है । यह transgene अनुक्रम, साथ ही किसी भी नियामक अनुक्रम जैसे प्रवर्तकों या microRNA-बाइंडिंग साइट्स, विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए16शामिल हैं ।
AAV कैप्सिड वेक्टर-होस्ट सेल इंटरैक्शन निर्धारित करता है और किसी AAV सीरोटाइप के लिए सेल प्रकार या टिशू tropism की डिग्री प्रदान करती है, जिसे विशिष्ट स्थानों पर transgene अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है । कई AAV serotypes प्रकृति में पाए जाते हैं, जबकि अंय प्रयोगशालाओं में रिकॉमबिनेंट दृष्टिकोण के माध्यम से उत्पादन किया गया है (यानी, PHP । ख). इसके अलावा, कुछ capsids भी अंय उपयोगी विशेषताओं, इस तरह के BBB पार करने की क्षमता के रूप में, प्रणालीगत प्रशासन के बाद सीएनएस भर transgenes के वितरण में जिसके परिणामस्वरूप । यह AAV9 के लिए दिखाया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में हाल ही में PHP वर्णित है । B कैप्सिड17. एक परिणाम के रूप में, इन serotypes neurodegenerative विकारों1,17,18के लिए नए जीन थेरेपी के दृष्टिकोण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक साबित हो रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य उच्च titer और शुद्धता के साथ AAV वैक्टर के छोटे पैमाने पर उत्पादन के लिए एक लागत प्रभावी विधि का वर्णन है । हालांकि परिणाम यहां प्रस्तुत PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड और एक scAAV अभिव्यक्ति कैसेट, प्रोटोकॉल कई AAV वेक्टर serotypes और जीनोम विंयास के उत्पादन के लिए उपयुक्त है, अधिकतम प्रयोगात्मक लचीलापन की अनुमति । हालांकि, वेक्टर उपज और अंतिम पवित्रता चुना सीरोटाइप के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
प्रोटोकॉल ही वायरल वेक्टर उत्पादन के लिए शास्त्रीय त्रिकोणीय अभिकर्मक विधि का एक संस्करण है और वेक्टर साफ अप के लिए एक iodixanol ढाल के उपयोग को शामिल किया गया है, जो, सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) ढाल के शास्त्रीय उपयोग की तुलना में, गया है अधिक समय में उच्च शुद्धता के AAV वैक्टर उत्पादन करने के लिए रिपोर्ट कुशल तरीके से19,20,21।
अभिकर्मक, शुद्धि और एकाग्रता कदम एक ऊतक संस्कृति वायरल वेक्टर काम के लिए रेटेड प्रयोगशाला में अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) के अनुसार किया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं । प्रत्येक कार्य के लिए प्रासंगिक स्थानीय और राष्ट्रीय वायरल वेक्टर उत्पादन और उपयोग के विषय में कानून के अनुपालन में किया जाना चाहिए । काम एक लामिना प्रवाह हुड के नीचे और बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए । वेक्टर सुविधा के अंदर, यह नियमित रूप से ऊतक संस्कृति लैब कोट के अलावा एक प्रयोगशाला एप्रन पहनने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, दस्ताने की एक डबल जोड़ी, साथ ही प्लास्टिक के जूते, हर समय पर पहना जाना चाहिए ।
वेक्टर उत्पादन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक उपकरण और plasmids उपलब्ध हैं । 1) pCapsid प्लाज्मिड प्रतिनिधि जीन है कि चार गैर संरचनात्मक प्रतिकृति, अर्थात् Rep78, Rep68, Rep52, और Rep40, और टोपी जीन है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना तीन संरचनात्मक कैप्सिड प्रोटीन, अर्थात् VP1, VP2, और VP3 के लिए आवश्यक encodings शामिल हैं । 2) pHelper प्लाज्मिड एडीनोवायरस, जो AAV कोशिकाओं में HEK293T उत्पादन की सुविधा से जीन E4, E2A, और VA शामिल हैं । 3) pTransgene प्लाज्मिड transgene अभिव्यक्ति कैसेट, दो ITRs द्वारा पार्श्व शामिल हैं । इन plasmids को प्रयोगशाला में डी नोवो को संश्लेषित किया जा सकता है जो ऑनलाइनउपलब्ध अनुक्रम का उपयोग कर रहा है । plasmids के लिए डी नोवोबनाया, विशेष रूप से उन उपंयास transgenes युक्त, अनुक्रमण, सुनिश्चित करें कि transgene और ITRs सही है बनाने के लिए आवश्यक है । वैकल्पिक रूप से, निर्मित plasmids सीधे ऑनलाइन प्लाज्मिड खजाने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । जब आवश्यक हो, plasmids प्रवर्धित और मानक किट का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है, निर्माता के निर्देश के अनुसार23.
वेक्टर titer और पवित्रता सदिश की transduction क्षमता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है । अतिरिक्त प्रोटोकॉल उत्पादित वेक्टर की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए आपूर्ति की जाती है । अंतिम वैक्टर दोनों विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में सीएनएस सेल समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

adeno-जुड़े विषाणुओं पर आधारित जीन वितरण उपकरण (AAVs) जीन थेरेपी अनुप्रयोगों सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को transgenes के वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प हैं । AAV वैक्टर गैर नकल कर रहे हैं, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम है और दीर्घकालिक transgene अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण बात, कुछ serotypes, जैसे कि नव वर्णित PHP । बी, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) पशु मॉडलों में पार कर सकते हैं, प्रणालीगत प्रसव के बाद । AAV वैक्टर कुशलता से प्रयोगशाला में उत्पादन किया जा सकता है । हालांकि, मजबूत और reproducible प्रोटोकॉल पर्याप्त शुद्धता के स्तर के साथ AAV वैक्टर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और vivo अनुप्रयोगों में पर्याप्त उच्च titer मान । इस प्रोटोकॉल एक iodixanol ढाल शोधन रणनीति के आधार पर, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन । iodixanol शुद्धिकरण विधि उच्च शुद्धता के उच्च titer AAV वैक्टर के बैचों प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है, जब अन्य शोधन विधियों की तुलना में. इसके अलावा, प्रोटोकॉल आम तौर पर तेजी से अंय तरीकों से वर्तमान में वर्णित है । इसके अलावा, एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) आधारित रणनीति वेक्टर titer का एक तेजी से और सही निर्धारण के लिए, साथ ही एक चांदी धुंधला विधि वेक्टर बैच की पवित्रता का निर्धारण करने के लिए वर्णित है । अंत में, सीएनएस को जीन वितरण के प्रतिनिधि परिणाम, AAV-PHP के प्रणालीगत प्रशासन के बाद । बी, प्रस्तुत कर रहे हैं । इस तरह के परिणाम सभी प्रयोगशालाओं में इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संभव होना चाहिए ।

AAV9, हाल ही में जब तक माना जाता था, BBB और transducing कोशिकाओं सीएनएस के पार करने में सबसे प्रभावी AAV वेक्टर सीरोटाइप, परिधीय प्रशासन के बाद । कैप्सिड डिजाइन में एक महत्वपूर्ण अग्रिम प्राप्त किया गया था जब Deverman एट अल । एक कैप्सिड चयन विधि के उपयोग की सूचना Cre पुनर्संयोजन आधारित AAV-लक्षित विकास (बनाने)17। इस विधि का प्रयोग, वे एक नया कैप्सिड, PHP नाम की पहचान की । बी, जो वे कई सीएनएस क्षेत्रों में astrocytes और न्यूरॉन्स के बहुमत transduce करने में सक्षम के रूप में रिपोर्ट, प्रणालीगत इंजेक्शन17के बाद. इस बिंदु पर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भले ही PHP । बी C57/Bl6 चूहों में सकारात्मक परिणाम प्रदान करता है (जो प्रारंभिक अलगाव प्रयोगों में इस्तेमाल किया तनाव था), प्रारंभिक रिपोर्टों के सुझाव अपनी कार्यकुशलता एक तनाव पर निर्भर तरीके से भिंन हो सकते हैं । इसके अलावा प्रयोगों होगा, कोई संदेह नहीं है, इस मुद्दे पर अधिक प्रकाश डाला31.
हालांकि, इन मुद्दों के बावजूद, PHP । बी चूहों के सीएनएस में इनवेसिव जीन हेरफेर के लिए रोमांचक संभावनाएं प्रदान करता है, सबूत की अवधारणा रोग मॉडल में जीन चिकित्सा प्रयोगों सहित । जैसे, हम PHP का उपयोग कर transgene अभिव्यक्ति की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए चुना है । बी बनाम AAV9 है, जो ' सोने की गई है ' मानक transduction सीएनएस के लिए सदिश के बाद से २००९2परिधीय प्रशासन के बाद । दोनों serotypes की एक सीधी तुलना करने के लिए, transgene अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम शर्तों के तहत, हम एक अनुसूचित जाति जीनोम विंयास३२का इस्तेमाल किया । दोनों वैक्टर transgene ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए सर्वव्यापी चिकन β-actin (CBA) प्रवर्तक के नियंत्रण में किया जाता है । Female C57/Bl6 चूहों पर जन्मोत्तर दिवस ४२ (वजन में लगभग 20 ग्राम) 1 x 10 की एक खुराक प्राप्त की या तो scAAV2/PHP के माउस प्रति12 वी. पी । B-CBA-GFP or scAAV2/9-CBA-GFP. वेक्टर प्रशासन पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था । इस प्रयोग को केयू Leuven की नैतिक समिति ने मंजूरी दी थी ।
तीन सप्ताह postinjection, चूहों बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ transcardial छिड़काव, 4% (डब्ल्यू/वी) बर्फ ठंडा paraformaldehyde (पीएफए) के बाद से गुजरा । उनके दिमाग और काटा गया था एक ही निर्धारण में एक रात की गर्मी से आगे postfixation, ०.०१% (डब्ल्यू/वी) Na-azide के लिए स्थानांतरित करने से पहले और आगे विश्लेषण तक भंडारण के लिए/ इसके बाद, दिमाग एक हिल microtome का उपयोग कर खोदी गई, और immunohistochemistry ५० µm मोटी वर्गों पर प्रदर्शन किया गया ।
transgene अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, वर्गों GFP (खरगोश विरोधी GFP) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, एक फ्लोरोसेंट डाई (विरोधी खरगोश Alexa Fluor ४८८) के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग कर पता लगाने के साथ (4a, बी चित्र ). प्रतिदीप्ति तीव्रता माप (मनमाना इकाइयों में [au]) GFP अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि की पुष्टि की जब एक अनुसूचित जाति जीनोम और PHP । बी कैप्सिड AAV9 के रिश्तेदार थे । GFP में वृद्धि मस्तिष्क में मनाया गया (२१०५ ± १६१ बनाम १४४१ ± ९९ au; p = ०.००३२), सेरिबैलम (२६०१ ± १९६ बनाम १७३७ ± १३५ au; p = ०.००३२), और brainstem (३०८२ ± ३१९ बनाम २४८५ ± ८८ au; p = ०.००३८) (figure 4c).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> चित्रा 4: scAAV2/PHP के प्रणालीगत वितरण । बी-CBA-GFP सीएनएस में एक उच्च GFP अभिव्यक्ति की ओर जाता है । scAAV2/PHP । बी-CBA-GFP या scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 वी. पी./माउस) पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से 6 सप्ताह की उंर C57/Bl6 चूहों के लिए प्रशासित किया गया था । GFP कोरोनरी मस्तिष्क वर्गों पर immunohistochemistry का उपयोग कर पाया गया था 3 सप्ताह postinjection. (क) मस्तिष्क और (ख) सेरिबैलम और brainstem को दिखाया गया है । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. (ग) ठहराव के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर का निर्धारण करने के लिए किया गया था GFP संकेत प्रत्येक सदिश के साथ प्राप्त (10 वर्गों के प्रति माउस; तीन चूहों प्रति वेक्टर समूह) । एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया था, जिसके बाद एक दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट हुआ; डेटा अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; * *p < ०.०१; Au. मनमानी इकाइयां । pCapsid, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया, 2 सीरोटाइप से जीन प्रतिनिधि और सीरोटाइप PHP से जीन टोपी शामिल हैं । बी या AAV9, तदनुसार । यह आंकड़ा Rincon एट अल.३२से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Adeno-जुड़े वायरस आधारित वैक्टर के लिए उत्पादन, शुद्धिकरण, और गुणवत्ता नियंत्रण

यहां, हम एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन करने के लिए उत्पादन, titer, और adeno के गुणवत्ता नियंत्रण बैचों-जुड़े वायरस वैक्टर । यह उपयोगकर्ता उच्च-titer (≥ 1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल) और एक उच्च शुद्धता के साथ एक वेक्टर तैयारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, इन विट्रो में या vivo उपयोग में के लिए तैयार है ।

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

इस प्रोटोकॉल का पालन करके, उपयोगकर्ता उच्च शुद्धता और इन विट्रो या वीवो अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त उपज के एएवी वैक्टर का उत्पादन करने में सक्षम हो जाएगा। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विन्यास में अंतर के साथ एएवी सेरोटाइप की एक श्रृंखला का उत्पादन और शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है। इन दो तत्वों का संयोजन सेल प्रकार और ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो सकता है।कुछ सेरोटाइप का उत्पादन कम उपज को दे सकता है। यह उत्पादन है जहां करीब सेरोटाइप हैं और एक व्यक्तिगत आधार पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए । इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन शैली Fripont, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।एचईके कोशिकाओं को उगाने के बाद, डीएनए मिश्रण तैयार करने के लिए 150 मिलीलीटर सोडियम क्लोराइड के 18 मिलीलीटर में ट्रांसजीन युक्त 360 माइक्रोग्राम हेल्पर प्लाज्मिड, 180 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड को मिलाएं। तीन 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों पर इस मिश्रण को वितरित करें। एक नई शंकु नली में, छह सेल संस्कृति व्यंजनों के लिए पी मिश्रण तैयार करने के लिए पी के 840 माइक्रोग्राम पीई और 150 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड के छह मिलीलीटर मिलाएं।फिर, डीएनए मिश्रण युक्त शंकु ट्यूबों में से एक के लिए, ड्रॉप बाय ड्रॉप, पी मिश्रण के छह मिलीलीटर जोड़ें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। इसके बाद, इनक्यूबेटर से छह सेल संस्कृति व्यंजन हटा दें।एक लैमिनार प्रवाह हुड में, प्रत्येक पकवान से माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें। माध्यम के निशान को हटाने के लिए पूर्व-गर्म डीपीबीएस के पांच मिलीलीटर के साथ व्यंजन कुल्ला। डीपीबीएस को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पकवान को धीरे-धीरे झुकाएं पूरी सतह पर समान रूप से वितरित किया जाता है।फिर, धीरे से डीपीबीएस को आकांक्षी करें। प्रत्येक डिश में डीएमईएम वन के 12 मिलीलीटर धीरे-धीरे जोड़ें, जिसमें डिश के किनारे पर रखा गया एक पिपेट है। इसे तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पीई और डीएनए मिश्रण मिलाएं।ड्रॉप फैशन द्वारा एक बूंद में छह सेल संस्कृति व्यंजनों में से प्रत्येक के लिए इस मिश्रण के दो मिलीलीटर जोड़ें, ध्यान से यह पूरी सतह पर वितरित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । 18 सेल संस्कृति व्यंजन तक पहुंचने तक एक समय में छह सेल संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करके इस प्रक्रिया को दोहराएं। धीरे से पी डीएनए मिश्रण वितरित करने के लिए सेल संस्कृति व्यंजन हिला ।९५ प्रतिशत आर्द्रता और पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट । इसके बाद, पहले से मौजूद माध्यम को हटाए बिना 18 व्यंजनों में से प्रत्येक में डीएमईएम 10 के अतिरिक्त 12 मिलीलीटर जोड़ें। एक ही परिस्थितियों में संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग जारी रखें।72 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर, प्रत्येक संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को ध्यान से अलग करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। एक 15 मिलीलीटर शंकु नली में दो संस्कृति व्यंजनों की मध्यम और कोशिकाओं को इकट्ठा करें, जो बर्फ पर रखा गया है। अपकेंद्रित्र ४२० बार जी पर ट्यूबों और अधिकतम करने के लिए निर्धारित अपकेंद्रित्र की त्वरण और मंदी के साथ 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ।ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से सुपरनेट को धीरे-धीरे अपशिष्ट निपटान कंटेनर में डालकर त्यागें। फिर, कोशिका छर्रों युक्त ट्यूबों को बर्फ पर रखें। हम लाइसिस बफर के दो मिलीलीटर में प्रत्येक गोली को निलंबित करते हैं और पांच से 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाते हैं।एक साथ तीन ट्यूबों से एएवी खींचो। शुरू करने के लिए, इथेनॉल के साथ मिश्रित सूखी बर्फ युक्त बाल्टी में रखकर फिर से निलंबित कोशिकाओं को फ्रीज करें। फिर कोशिकाओं को तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान सेट में रखकर गल लें।कोशिकाओं को lyse और AAV कणों को छोड़ने के लिए इस फ्रीज और गल चक्र को तीन बार दोहराएं। तीसरे विगलन कदम के बाद, ११६७ बार जी पर अपकेंद्रित्र और 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । 50 मिलीलीटर शंकु नलियों को साफ करने के लिए सुपरनेटेंट को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।सुपरनेटेंट के प्रति मिलीलीटर 50 इकाइयों की अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक ट्यूब में नाभिक जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, जबकि हर 10 मिनट में ट्यूब घूमता है यह सुनिश्चित करने के लिए कि नाभिक अच्छी तरह से supernatant के साथ मिलाया जाता है। अपकेंद्रित्र १३४९० बार जी पर और 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर supernatant स्पष्ट करने के लिए ।इसके बाद, 10 मिलीलीटर सिरिंज के प्लंजर को हटा दें, सिरिंज में 0.45 माइक्रोमीटर फिल्टर संलग्न करें और इसे एक साफ 50 मिलीलीटर शंकु नली के शीर्ष पर रखें। स्पष्ट सुपरनेट के साथ सिरिंज को सावधानी से भरें। फिल्टर के माध्यम से lysate मजबूर करने के लिए प्लंजर का प्रयोग करें।इसके बाद, प्रत्येक iodixanol अंशों को चार अलग-अलग 50 मिलीलीटर शंकु नलियों में तैयार करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में से एक तालिका में उल्लिखित है। तीन अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 15 प्रतिशत iodixanol के आठ मिलीलीटर पिपेट । एक साफ 50 मिलीलीटर शंकु नली में 25 प्रतिशत iodixanol के पिपेट 5.5 मिलीलीटर।एक गैर-स्नातक पाश्चात पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से 15 प्रतिशत iodixanol समाधान से नीचे 25 प्रतिशत iodixanol समाधान के 5.5 मिलीलीटर परत। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित ४० प्रतिशत और ६० प्रतिशत समाधान जोड़ें । आयोडिक्सनॉल अंशों को लेयरिंग पर इंटरमिक्स नहीं करना चाहिए।एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, क्रूड को 15 प्रतिशत iodixanol ढाल के शीर्ष पर लेयर करें, ड्रॉप बाय ड्रॉप करें, ताकि क्रूड लिसेट और इओडिक्सानॉल समाधान के बीच इंटरफेस को परेशान करने से बचा जा सके। प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन ट्यूब को लाइसिस बफर के साथ तब तक भरें जब तक कि मेनिस्कस ट्यूब गर्दन के आधार तक न पहुंच जाए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के दौरान उत्पन्न बहुत उच्च बलों के नीचे गिर न जाए। उचित ढक्कन का उपयोग करके ट्यूबों को बंद करें।डिजिटल पैमाने का उपयोग करके, सुनिश्चित करें कि सभी तीन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन ट्यूब का वजन समान है। कच्चे तेल के शीर्ष पर अधिक लाइसिस बफर जोड़कर, आवश्यक के रूप में वजन को समायोजित करना। 301580 बार जी पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करने के लिए एक निश्चित कोण टाइटेनियम रोटर का उपयोग करें और अधिकतम त्वरण और मंदी का उपयोग करके एक घंटे और 40 मिनट के लिए 12 डिग्री सेल्सियस पर।इसके बाद, एक सुई को पांच मिलीलीटर सिरिंज में संलग्न करें। रोटर में ट्यूबों से स्पेसर निकालें, और अपकेंद्रित्रीकरण के बाद ट्यूबों को ठीक करें। केवल 40 प्रतिशत आयोडिक्सनॉल अंश को एस्पिरेट करें जिसमें वेक्टर कण होते हैं।या तो नमूने की प्रक्रिया करें या इसे चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यहां, एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के कैप्सिड, जीनोम कॉन्फ़िगरेशन, प्रमोटर प्रकार और ट्रांसजीन कार्गो के साथ एएवी वैक्टर का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। इस उदाहरण में, हमने दो अलग-अलग एएवी वैक्टर का उत्पादन और शुद्ध किया जो एक आत्म मानार्थ जीनोम से हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते थे।दो वैक्टर अलग-अलग कैप्सिड द्वारा प्रतिष्ठित हैं: पीएचपीबी और एएवी 9। वे दिया गया, पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से, वयस्क C57 काले छह चूहों में । तीन सप्ताह के बाद इंजेक्शन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, वर्गों एक फ्लोरोसेंट डाई के लिए conjugated माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर का पता लगाने के साथ GFP के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं ।फ्लोरेसेंस तीव्रता माप GFP अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाते हैं जब पीएचपीबी वेक्टर का उपयोग एएवी 9 के सापेक्ष किया जाता है। जीएफपी में वृद्धि सेरेब्रम, सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम में देखी गई। अंश युक्त वेक्टर का सटीक संग्रह इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है।यदि यह ठीक से नहीं किया जाता है, तो वेक्टर यील्ड के साथ-साथ वेक्टर शुद्धता पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। AAV वैक्टर का उत्पादन करने में सक्षम होने के नाते, छोटी प्रयोगशालाओं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीन देने के लिए कई प्रयोगात्मक संभावनाओं का लाभ उठाने की स्थिति में होगा । इस प्रोटोकॉल के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूज के उपयोग की आवश्यकता होती है और दुर्घटनाओं से बचने के लिए इसे संभालने से पहले उचित प्रशिक्षण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।इसके अलावा, एएवी वैक्टर को अक्सर बायोहैजार्ड के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और इसलिए, आपको उन्हें संभालने और प्रबंधित करने से पहले स्थानीय नियमों से परामर्श करना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

एडिनो - जुड़े वायरल vectors के intracranial इंजेक्शन

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र से Transducing कक्ष के लिए lentiviral वैक्टर का उत्पादन

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

तरीकों और Adeno के नसों में प्रशासन के लिए युक्तियां-चूहों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र Transduction के मूल्यांकन से जुड़े वायरस

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

इंसुलिन-mimetic यौगिकों के परीक्षण के लिए एक Ovo मॉडल में

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-संबद्ध वायरस-रीढ़ की हड्डी की आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन्स में मध्यस्थता Transgene अभिव्यक्ति

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

रिकॉमबिनेंट Adeno-वयस्क चूहों में जुड़े वायरस के प्रत्यक्ष Intrathecal इंजेक्शन

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

ऑनलाइन एमआरआई छवियों के मार्गदर्शन के तहत Rhesus Macakue के कोर्टेक्स के लिए Optogenetic Adeno-संबद्ध वायरल वेक्टर की Convection बढ़ी डिलीवरी

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

व्हीलकॉन: मानव संवेदी नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक व्हील कंट्रोल-आधारित गेमिंग प्लेटफॉर्म

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...