Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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M.R. è supportato da un Fonds voor borsa di studio post-dottorato Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) e riconosce il continuo sostegno della Fundación cardiovascolare de Colombia e il dipartimento di scienza amministrativa, Tecnologia e innovazione (Grant CT-FP44842-307-2016, codice progetto 656671250485). M.m. è supportato da una borsa di studio dottorato FWO (1S48018N). M.G.H. è stato sostenuto da un grant istituzionali VIB e il supporto esterno da Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), la Fondazione per la ricerca di Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) e il Consiglio europeo della ricerca (CER) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Prova di concetto Grant 713755 - annuncio-VIP). Gli autori riconoscono Jeason Haughton per il suo aiuto con allevamento del mouse, Stephanie Castaldo per il suo aiuto eseguire le iniezioni di vena di coda e Caroline Eykens per fornire le immagini delle cellule transfected HEK293T. M.G.H. riconosce Michael Dunlop, Peter Hickman e Dean Harrison.

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	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La produzione di vettori ricombinanti AAV qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni alla maggior parte dei laboratori di biologia molecolare e cellulare cultura servizi. Permette all'utente di ottenere i vettori AAV puro, preclinici grado che possono essere utilizzati per più tipi di cellule e tessuti di destinazione attraverso una gamma di applicazioni in vitro e in vivo . Uno dei più grandi vantaggi di questo protocollo, rispetto ad altri (cioè, CsCl purificazione), è il più breve tempo di lavoro necessario. I vettori AAV Ready-to-use sono ottenibili in un massimo di 6 giorni lavorativi dopo la transfezione iniziale di HEK293T cellule.
Diversi fattori possono influenzare negativamente la resa finale o la qualità del vettore AAV. Efficienza di trasfezione povero è uno dei motivi principali per una bassa resa virale33. Una raccomandazione importante è l'uso di HEK293T cellule che non sono state attraversate più di 20 volte e non hanno una confluenza di cella supera al 90% al momento della trasfezione21. Inoltre, il metodo di transfezione selezionato ha un impatto significativo sui risultati. Questo protocollo è basato sull'uso di PEI. PEI è un polimero cationico con la capacità di trasportare DNA esogeno al nucleo della cellula attraverso la generazione di complessi di polimero e dell'acido nucleico, noto come polyplexes, che sono presi dalla cella e trafficata via gli endosomi34. Basato su PEI transfezione è facile e veloce da eseguire, in contrasto con altri metodi ampiamente usati, ad esempio la co-precipitazione del DNA con fosfato di calcio35. Inoltre, trasfezione basata su PEI è molto più conveniente rispetto ad altri metodi recentemente introdotti, come l'utilizzo di lipidi cationici e transfezione mediata magnete36.
La strategia di purificazione svolge un ruolo chiave nel protocollo. Rispetto ad altri metodi, basati su iodixanol purificazioni tendono a contenere una percentuale più elevata di particelle virali vuoto (20%)20. Questo è compensato, ad un grado, dal fatto che la purificazione iodixanol risultati ordinariamente nelle preparazioni di vettore AAV con un rapporto di particella di infettività di meno di 100. Questo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai convenzionali procedure basate su CsCl, per il quale perdita sostanziale di infettività delle particelle è segnalato37. Un altro metodo alternativo comune per purificare i vettori di AAV è purificazione basato su cromatografia. Tuttavia, questo metodo ha il grande svantaggio che una colonna specifica è necessaria per ogni capside del vettore utilizzato: ad esempio, mentre AAV2 è classicamente isolato utilizzando colonne di eparina, questa metodologia non funziona con AAV4 e AAV5, che non possiedono eparina-legante siti su loro capsidi38. Considerando che la purificazione di cromatografia è anche costoso, purificazione iodixanol è generalmente più adatto per i laboratori che desiderano produrre lotti di alta qualità di vettori AAV su una piccola scala33,39, 40. Tuttavia, per ottimizzare la resa finale e la purezza del vettore, estrema cura è necessaria quando si effettuano le pendenze di iodixanol. Le varie frazioni di iodixanol dovrebbero essere trasferite al tubo di ultracentrifugazione mediante una pipetta Pasteur sterile cui punta è a contatto della parete del tubo: iodixanol dovrebbero essere espulse dalla pipetta lentamente e continuamente. Come le particelle di vettore si accumulano nello strato iodixanol 40%, cura deve essere adottate per garantire che le interfacce di gradiente non mescolano20. Infine, la frazione contenente il vettore dovrebbe essere recuperata tramite l'inserzione di un ago smussato in acciaio inox con un calibro non superiore a 20 G. Per massimizzare il recupero di vettore, la frazione chiara deve essere recuperata nella sua interezza. Durante questo passaggio, il tempismo è fondamentale. Per evitare di compromettere la purezza della preparazione, è essenziale per interrompere la raccolta prima che altre fasi (contaminanti) della sfumatura sono raccolti.
Differenze nel titolo vettore ottenuti possono essere attribuite anche alla capacità intrinseca del vettore di produrre particelle confezionate. Un confronto tra diversi sierotipi di AAV hanno mostrato che alcuni vettori AAV sono più difficili da produrre ad un titolo più elevato rispetto ad altri (ad es., AAV2)41. Precipitazione del vettore, durante la fase di dissalazione, può essere un motivo possibile per un titolo inferiore e facilmente prevenuta evitando sovraconcentrazione33. Inoltre, è anche possibile che l'efficienza di iodixanol basati su gradiente purificazione differisce leggermente tra sierotipi e, di conseguenza, le discrepanze nel titolo ottenuti con diversi sierotipi possono essere osservate41.
Infine, occorre sottolineare che, anche se qPCR è un metodo molto preciso per la quantificazione del DNA certa variabilità insita nella tecnica può essere osservato. Precisione nella titolazione dipende in primo luogo il pipettaggio precisa e corretta nel Vortex di tutte le soluzioni. Per garantire il titolo più accurato lettura, la qPCR può essere ripetuta in modo indipendente, e i valori ottenuti in media. La scelta dei primer presentato in questo protocollo si basa sulla sequenza del promotore CBA situato nel plasmide pTransgene utilizzato nel nostro laboratorio. Il promotore CBA è un forte promotore sintetico che è ampiamente usato nel campo vettoriale per espressione di unità in più tipi di cellule. Esso incorpora elementi multipli, compreso l'elemento enhancer precoce del citomegalovirus (CMV); il promotore, primo esone e primo introne del gene CBA; e il ricettore della giuntura del gene della β-globina coniglio. Tuttavia, gli iniettori possono essere progettati per praticamente qualsiasi elemento che si trova all'interno della cassetta di espressione (compreso il promotore, il transgene ed elementi regolatori). Il confronto del titolo in batch è possibile, anche fornendo gli iniettori sono utilizzati contro le regioni comuni per i vettori in questione.
In conclusione, questo protocollo può essere usato per produrre vettori AAV con una varietà di capsidi, configurazioni del genoma, tipi di promotore e transgene carichi. Questo permetterà agli utenti di adattare facilmente le caratteristiche finali dei loro vettori base alle esigenze sperimentali. Nell'esempio presentato nei risultati rappresentativi, l'uso del PHP. Capside di B, che attraversa in modo efficiente la BBB, ha dato espressione genica altamente efficiente nel SNC, seguente coda vena iniezione32. La somministrazione sistemica di vettori penetranti CNS ha notevoli vantaggi in termini di possibili effetti collaterali2,17,32. Una possibile alternativa all'iniezione periferica, evitando i caveat di tecniche invasive, è consegna intrathecal, che consiste di consegna del vettore AAV nel fluido cerebrospinale. Questo itinerario di consegna è dimostrato di essere efficace, mostrando diffusa espressione del transgene in tutto il sistema nervoso centrale, effetti meno fuori bersaglio in organi periferici e bassi livelli di risposta immunitaria42. Tuttavia, iniezioni intratecali sono molto più impegnativo, in quanto richiedono maggiore abilità tecniche di iniezione della vena della coda.
Ulteriore sviluppo di capside a perfezionare questa tecnologia sarà guidato dall'opportunità di utilizzo di vettore AAV in applicazioni di terapia genica. Tali approcci offrono interessanti possibilità per trattare disturbi di CNS attualmente incurabili, come la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth, morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer18.

Negli ultimi 30 anni, il selvaggio-tipo adenoassociati sono stati progettati per creare vettori AAV ricombinanti, che hanno dimostrato di essere eccezionalmente utili strumenti per il trasferimento genico nei CNS1,2,3,4, 5,6 e la terapia genica si avvicina a malattia (comprese le terapie approvate da FDA ed EMA)4,7. Loro idoneità all'uso nello SNC deriva in gran parte dalla loro capacità di infettare le cellule post-mitotiche, divisione, in genere trovato nel CNS8. Tuttavia, vettori AAV-based hanno anche il vantaggio di permettere un'espressione a lungo termine di qualsiasi determinato transgene terapeutico4,9 mentre indurre una risposta immunitaria più mite rispetto ad altri vettori virali7, 8,10,11,12.
Gli elementi principali di qualsiasi vettore AAV sono il genoma e le proteine del capside. Selvaggio-tipo adenoassociati sono singolo filamento (ss) virus a DNA con un genoma di circa 5 kilobasi (kb)13. Per la produzione di vettori AAV ricombinanti, i geni rep e cap (necessari per la replica di genoma e l'assemblaggio del capside virale) vengono eliminati dal genoma di AAV il selvaggio-tipo e forniti in trans, lasciando spazio per un Cassetta di espressione contenente il transgene14,15. Le sequenze ripetizione terminale invertite (ITRs) del genoma virale originale sono gli unici elementi conservati in un vettore AAV, come questi sono essenziali per la replica e imballaggio3,10,14. Vettori di AAV possono essere progettati per migliorare l'espressione del transgene; una mutazione in uno dei ITRs conduce alla formazione di un ciclo di tornante efficacemente consente la generazione di un complementare DNA strand3,7,15. Il principale vantaggio di questa configurazione, definito un genoma di self-complementari (sc), è che ignora la necessità di sintesi secondo-filo tipica del ciclo convenzionale di AAVs, aumentando considerevolmente la velocità e i livelli di espressione del transgene 1. Tuttavia, l'utilizzo di un genoma di scAAV riduce la capacità di carico del vettore di circa 2,4 kb. Questo include sequenze di transgene, nonché eventuali sequenze regolatrici come promotori o siti di legame per microRNA, per limitare l'espressione a cella specifica tipi16.
Le proteine del capside AAV determina l'interazione tra cellula di vettore-ospite e conferisce un grado di tropismo di tessuto o tipo di cella per un sierotipo AAV, che può essere sfruttato anche per limitare l'espressione del transgene in posizioni specifiche. Diversi sierotipi AAV si trovano in natura, mentre gli altri sono stati prodotti nei laboratori attraverso approcci ricombinanti (cioè, PHP. B). Inoltre, alcuni capsidi conferiscono anche altre caratteristiche utili, quali la capacità di attraversare la BBB, conseguente la consegna di transgeni in tutto il sistema nervoso centrale dopo somministrazione sistemica. Ciò è stato dimostrato per AAV9, così come per il PHP recentemente descritto. B capside17. Di conseguenza, questi sierotipi stanno dimostrando di essere particolarmente rilevante per nuovi approcci di terapia genica per i disordini di neurodegenerative1,17,18.
L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere un metodo conveniente per la produzione su piccola scala di vettori AAV con alto titolo e purezza. Anche se i risultati presentati qui utilizzano il PHP. Capside di B e una cassetta di espressione scAAV, il protocollo è adatto per la produzione di diversi sierotipi di vettore AAV e configurazioni di genoma, permettendo la massima flessibilità sperimentale. Tuttavia, il vettore resa e purezza finale può variare secondo il sierotipo selezionato.
Il protocollo stesso è una variante del metodo classico tri-transfezione per la produzione di vettori virali e incorpora l'uso di un gradiente di iodixanol per vettore pulito-up, che, rispetto all'uso classico di gradienti di cesio cloruro (CsCl), è stato segnalato per produrre vettori AAV di purezza superiore a in un modo più efficienti in termini di tempo, il19,20,21.
I passaggi di transfezione, la purificazione e la concentrazione sono destinati a essere eseguiti secondo buona pratica di laboratorio (BPL) in un laboratorio di cultura del tessuto voto per il lavoro di vettore virale. Ogni attività deve essere eseguita in conformità con la legislazione locale e nazionale riguardante la produzione di vettori virali e utilizzare. Lavori devono essere eseguiti sotto cappa a flusso laminare e in condizioni di sterilità. All'interno della struttura di vettore, si raccomanda di indossare un grembiule di laboratorio, oltre al cappotto del laboratorio di coltura del tessuto normale. Inoltre, una doppia coppia di guanti, come pure Copriscarpe plastica, deve essere indossata in ogni momento.
Prima di iniziare la produzione di vettore, garantire tutte le attrezzature necessarie e plasmidi sono disponibili. 1) pCapsid plasmide contiene il gene rep che codifica quattro proteine non strutturali necessari per la replica, vale a dire Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e il tappo gene che codifica per tre proteine strutturali del capside, vale a dire VP1, VP2 e VP3. 2) pHelper plasmide contiene i geni E4, E2Ae VA da adenovirus, che facilitano la produzione di AAV in HEK293T cellule. 3) pTransgene plasmide contiene la cassetta di espressione del transgene, affiancata da due ITRs. Questi plasmidi possono essere sintetizzati de novo in laboratorio utilizzando sequenze disponibili online22. Per plasmidi fatti de novo, soprattutto quelli contenenti romanzo transgeni, sequenziamento è necessario assicurarsi che il transgene e ITRs siano corretti. In alternativa, premade plasmidi possono essere acquistati direttamente attraverso il repository online plasmide. Quando necessario, plasmidi possono essere amplificati e purificati mediante kit standard, secondo istruzioni23 del produttore.
Titolo di vettore e purezza possono influenzare negativamente la capacità di trasduzione del vettore. Protocolli aggiuntivi sono forniti per valutare la qualità del prodotto vettore. I vettori finali sarà utili per gli studi della funzione cella CNS in applicazioni sia in vitro che in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gene consegna strumenti basati su virus adeno-associato (AAVs) sono una scelta popolare per la consegna dei transgeni al sistema nervoso centrale (CNS), tra cui applicazioni di terapia genica. I vettori AAV sono non replicare, in grado di infettare le cellule di divisione e divisione e fornire a lungo termine espressione del transgene. Cosa importante, alcuni sierotipi, ad esempio il PHP recentemente descritto. B, può attraversare la sangue-cervello-barriera (BBB) nei modelli animali, seguendo la consegna sistematica. Vettori di AAV possono essere prodotto in modo efficiente in laboratorio. Tuttavia, protocolli affidabili e riproducibili sono necessari per ottenere vettori AAV con sufficienti livelli di purezza e i valori del titolo abbastanza alti per applicazioni in vivo . Questo protocollo descrive una strategia efficiente e riproducibile per la produzione di vettore AAV, basata su una strategia di purificazione gradiente di iodixanol. Il metodo di purificazione di iodixanol è adatto per ottenere lotti di vettori AAV alto-titolo di elevata purezza, quando rispetto ad altri metodi di purificazione. Inoltre, il protocollo è in genere più veloce rispetto ad altri metodi attualmente descritti. Inoltre, una polimerasi quantitativa (qPCR) di reazione a catena-strategia di base è descritto per una determinazione rapida e accurata del titolo di vettore, come pure un argento che macchia il metodo determinare la purezza del batch vettoriale. Infine, i risultati rappresentativi di consegna del gene al SNC, dopo somministrazione di AAV-PHP. B, sono presentati. Tali risultati dovrebbero essere possibile in tutti i laboratori utilizzando i protocolli descritti in questo articolo.

AAV9 è stato considerato, fino a poco tempo, per essere il più efficace sierotipo di vettore AAV di attraversare la BBB e transducing cellule del SNC, dopo somministrazione periferica. Un significativo passo avanti nel design del capsid è stato raggiunto quando Deverman et al ha riferito l'uso di un metodo di selezione del capsid denominato Cre basati su ricombinazione AAV-mirati evoluzione (Crea)17. Utilizzando questo metodo, hanno identificato un nuovo capside, denominato PHP. B, che hanno riferito come in grado di trasdurre la maggior parte degli astrociti e neuroni in più regioni dello SNC, dopo iniezione sistemica17. A questo punto, dovrebbe essere notato che anche se PHP. B fornisce risultati positivi in topi C57/Bl6 (che era il ceppo utilizzato negli esperimenti isolamento iniziale), rapporti preliminari suggeriscono la che sua efficienza può variare in un modo dipendente dalla deformazione. Ulteriori esperimenti saranno, senza dubbio, fare più luce su questo problema31.
Tuttavia, nonostante questi problemi, PHP. B offre interessanti possibilità per la manipolazione del gene non invadente nel SNC di topi, compresi gli esperimenti di terapia genica proof-of-concept in modelli di malattia. Come tale, abbiamo scelto di valutare l'efficienza di espressione del transgene utilizzando PHP. B contro AAV9, che è stato il vettore 'gold standard' per la trasduzione di CNS dopo somministrazione periferica dal 20092. Per eseguire un confronto diretto dei due sierotipi, in condizioni ottimali per l'espressione del transgene, abbiamo utilizzato un modulo di configurazione di genoma sc32. Entrambi i vettori ha trasportato il transgene per proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore onnipresente pollo β-actina (CBA). Topi C57/Bl6 femminili al giorno postnatale 42 (circa 20 g di peso) hanno ricevuto una dose di 1 x 1012 vg per topo di entrambi scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Amministrazione di vettore è stata eseguita tramite iniezione della vena della coda. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico di KU Leuven.
Postinjection di tre settimane, i topi hanno subito perfusione perfusione con PBS ghiacciata, seguita da 4% (p/v) ghiacciata paraformaldeide (PFA). I loro cervelli sono state raccolte e subì ulteriori postfixation da un'incubazione overnight nel fissativo stesso, prima del trasferimento a 0,01% (p/v) Na-azide/PBS per deposito fino a ulteriori analisi. In seguito, i cervelli sono stati sezionati usando un microtomo vibra e immunohistochemistry è stato effettuato su 50 µm sezioni spesse.
Per valutare i livelli di espressione del transgene, sezioni sono state macchiate con gli anticorpi primari contro GFP (coniglio anti-GFP), con il rilevamento utilizzando anticorpi secondari coniugati a una tintura fluorescente (anti-coniglio Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Misure di intensità di fluorescenza (in unità arbitrarie [au]) ha confermato un significativo aumento nell'espressione di GFP quando un sc genoma e PHP. Capside di B sono stati utilizzati rispetto al AAV9. Sono stati osservati aumenti GFP nel cervello (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), il cervelletto (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e del tronco cerebrale (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figura 4: consegna sistemica di scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce ad un'alta espressione di GFP nello SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mouse) è stato amministrato ai topi C57/Bl6 6 settimane-vecchio tramite iniezione della vena della coda. GFP è stato rilevato usando immunohistochemistry su postinjection di 3 settimane sezioni coronali del cervello. (A) il cervello e (B) sono mostrati il cervelletto e il tronco cerebrale. Scala bar = 1 mm. (C) la quantificazione dell'intensità di fluorescenza relativa è stata eseguita per determinare i livelli di segnale GFP raggiunto con ogni vettore (10 sezioni per topo; tre topi per gruppo vettoriale). È stato effettuato un test ANOVA unidirezionale, seguiti da t di uno studente due code-test; i dati sono espressi come media ± deviazione standard; p < 0.01; au. unità arbitrarie. pCapsid, utilizzato per la produzione di vettore AAV, contiene il gene rep da sierotipo 2 e del gene tappo da sierotipo PHP. B o AAV9, di conseguenza. Questa figura è stata modificata da Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Seguendo questo protocollo, l'utente sarà in grado di produrre vettori AAV ad alta purezza e resa adatti ad applicazioni in vitro o in vivo. Questo protocollo può essere utilizzato per produrre e purificare una gamma di sierotipi AAV con differenze nelle configurazioni. La combinazione di questi due elementi può essere utile per ottenere il tipo di cellula e l'espressione specifica del tessuto.La produzione di alcuni sierotipi può dare a una resa inferiore. Questa è la produzione in cui ci sono sierotipi stretti e dovrebbe essere valutata su base individuale. A dimostrare queste procedure sarà Shelly Fripont, un tecnico del nostro laboratorio.Dopo aver fatto crescere le cellule HEK, mescolare 360 microgrammi di plasmide aiutante, 180 microgrammi di plasmide che codificano il capsid vettoriale e 180 microgrammi di plasmide contenente il transgene in 18 millilitri di cloruro di sodio millimolare per preparare il mix di DNA. Distribuire questa miscela su tre tubi conici da 50 millilitri. In un nuovo tubo conico, mescolare 840 microgrammi di PEI e sei millilitri di cloruro di sodio millimolare per preparare il mix PEI per sei piatti di coltura cellulare.Quindi, aggiungere sei millilitri del mix PEI, goccia a goccia, a uno dei tubi conici contenenti il mix di DNA. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, rimuovere sei piatti di coltura cellulare dall'incubatrice.In un cappuccio a flusso laminare, aspirare completamente il mezzo da ogni piatto. Risciacquare i piatti con cinque millilitri di DPBS pre-riscaldato per rimuovere le tracce del mezzo. Inclinare delicatamente ogni piatto per garantire che DPBS sia distribuito uniformemente su tutta la superficie.Quindi, aspirare delicatamente il DPBS. Aggiungere lentamente 12 millilitri di DMEM a ogni piatto, con una pipetta posta sul bordo del piatto. Mescolare la miscela PEI e DNA pipettando su e giù da tre a cinque volte.Aggiungere due millilitri di questa miscela a ciascuno dei sei piatti di coltura cellulare in modo drop by drop, assicurandosi di distribuirlo con cura su tutta la superficie. Ripeti questo processo usando sei piatti di coltura cellulare alla volta fino a raggiungere 18 piatti di coltura cellulare. Agitare delicatamente i piatti di coltura cellulare per distribuire la miscela di DNA PEI.Incubare le cellule trasfette a 37 gradi Celsius con il 95% di umidità e il 5% di anidride carbonica per cinque ore. Successivamente, aggiungere altri 12 millilitri di DMEM 10 a ciascuno dei 18 piatti senza rimuovere il mezzo preesistente. Continuare a incubare le cellule trasfette nelle stesse condizioni.A 72 ore dopo la trasfezione, utilizzare un raschietto cellulare per staccare accuratamente le cellule da ogni piatto di coltura. Raccogliere il mezzo e le cellule di due piatti di coltura in un tubo conico da 15 millilitri, tenuto sul ghiaccio. Centrifugare i tubi a 420 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti con l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga impostate al massimo.Scartare con cura il supernatante da ogni tubo versandolo delicatamente in un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti. Quindi, posizionare i tubi contenenti i pellet cellulari sul ghiaccio. Sospendiamo ogni pellet in due millilitri di tampone di lisi e mescoliamo tubazione su e giù da cinque a 10 volte.Estrarre l'AAV da tre tubi, insieme. Per iniziare, congelare le cellule ri-sospese posizionandole in un secchio contenente ghiaccio secco mescolato con etanolo. Quindi scongelare le cellule posizionandole immediatamente in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius.Ripetere questo ciclo di congelamento e scongelamento tre volte per liscire le cellule e rilasciare le particelle AAV. Dopo la terza fase di scongelamento, centrifugare a 1167 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire con cura i supernatanti per pulire tubi conici da 50 millilitri.Aggiungere nucleasi a ciascun tubo ad una concentrazione finale di 50 unità per millilitro di supernatante. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, mentre ruotare i tubi ogni 10 minuti per assicurarsi che la nucleasi sia accuratamente mescolata con il supernatante. Centrifuga a 13490 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti per chiarire il supernatante.Successivamente, rimuovere lo stantuffo di una siringa da 10 millilitri, attaccare un filtro da 0,45 micrometri alla siringa e posizionarlo sopra un tubo conico pulito da 50 millilitri. Riempire con cura la siringa con il supernatante chiarificato. Utilizzare lo stantuffo per forzare il lisciviazione attraverso il filtro.Successivamente, preparare ciascuna delle frazioni di iodixanolo in quattro tubi conici separati da 50 millilitri, come indicato nella tabella uno del protocollo di testo. Pipetta otto millilitri del 15% di iodixanolo in ciascuno dei tre tubi ultracentrifugo. Pipetta 5,5 millilitri di iodixanolo al 25% in un tubo conico pulito da 50 millilitri.Utilizzando una pipetta Pasteur non graduata, stratalizza con cura 5,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al 25% al di sotto della soluzione di iodixanolo al 15%. Aggiungere le soluzioni del 40% e del 60% come descritto nel protocollo di testo. Le frazioni di iodixanolo non devono intermix sulla stratificazione.Utilizzando una pipetta Pasteur, sovrapporre il lisato grezzo sopra il gradiente di iodixanolo del 15%, goccia a goccia, per evitare di disturbare l'interfaccia tra il lisato grezzo e la soluzione di iodixanolo. Riempire ogni tubo di ultracentrifugazione con tampone di lisi fino a quando il menisco raggiunge la base del collo del tubo, per assicurarsi che il tubo non collassi sotto le forze molto elevate generate durante l'ultracentrifugazione. Chiudere i tubi utilizzando coperchi appropriati.Utilizzando una bilancia digitale, assicurati che tutti e tre i tubi di ultracentrifugazione abbiano lo stesso peso. Regolazione del peso in base alle esigenze, aggiungendo più tampone dilisi sopra il llysato grezzo. Utilizzare un rotore in titanio ad angolo fisso per centrifugare i tubi a 301580 volte G e a 12 gradi Celsius per un'ora e 40 minuti utilizzando la massima accelerazione e decelerazione.Quindi, attaccare un ago a una siringa da cinque millilitri. Rimuovere il distanziale dai tubi del rotore e recuperare i tubi dopo la centrifugazione. Aspirare solo la frazione iodixanolo al 40% che contiene le particelle vettoriali.Elaborare il campione o memorizzarlo a quattro gradi Celsius. Qui, viene dimostrato un protocollo che può essere utilizzato per produrre vettori AAV con una varietà di capsidi, configurazioni del genoma, tipi di promotori e carichi transgeni. In questo esempio, abbiamo prodotto e purificato due diversi vettori AAV che hanno espresso la proteina fluorescente verde da un genoma auto-gratuito.I due vettori si distinguono per diversi capsidi:PHPB e AAV9. Sono stati consegnati, tramite iniezione di vena della coda, in topi neri C57 adulti. Per valutare i livelli di espressione transgena tre settimane dopo l'iniezione, le sezioni sono macchiate di anticorpi primari contro la GFP con rilevamento utilizzando anticorpi secondari coniugati a un colorante fluorescente.Le misurazioni dell'intensità della fluorescenza mostrano un aumento significativo dell'espressione GFP quando il vettore PHPB viene utilizzato rispetto all'AAV9. Aumenti della GFP sono stati osservati nel cerebro, nel cervelletto e nel tronco encefalico. La raccolta accurata del vettore contenente la frazione è fondamentale per questo protocollo.Nel caso in cui ciò non avvenga correttamente, la resa vettoriale e la purezza vettoriale sono influenzate negativamente. Essendo in grado di produrre vettori AAV, piccoli laboratori saranno in grado di sfruttare numerose possibilità sperimentali per fornire geni nel sistema nervoso centrale. Questo protocollo richiede l'uso di un ultracentrifugo ed è importante ricevere una formazione adeguata prima di gestirlo al fine di evitare incidenti.Inoltre, i vettori AAV sono spesso classificati come rischi biologici e, pertanto, è necessario consultare le normative locali prima di gestirli e gestirli.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Ricerca

Neuroscienze

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Un modello In Ovo per testare composti insulino-mimetici

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: una piattaforma di gioco basata sul controllo delle ruote per studiare il controllo del senso umano

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...