Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Mr støttes av en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorstipend (133722/1204517N) og anerkjenner kontinuerlig Fundación hjerte de Colombia og Administrative Department of Science, Teknologi og innovasjon (gi CT-FP44842-307-2016, prosjektkode 656671250485). Mm støttes av en CVE doktorgrad fellesskap (1S48018N). M.G.H. ble støttet av en VIB institusjonelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (TORV-VIP), stiftelsen for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det europeiske Research Council (ERC) (starter Grant 281961 - AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 - AD-VIP). Forfatterne bekrefter Jeason Haughton for hans hjelp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hennes hjelp med å hale blodåre injeksjoner og Caroline Eykens for å gi bilder av transfekterte HEK293T celler. M.G.H. erkjenner Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Produksjon av rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruker materialer og utstyr som er felles for de fleste molekylær biologi labs og celle kultur fasiliteter. Det lar brukeren få ren, preklinisk klasse AAV vektorer som kan brukes til å målrette flere celler og vev typer over en rekke i vitro og vivo applikasjoner. En av de største fordelene med denne protokollen, sammenlignet med andre (dvs. CsCl-baserte rensing), er kortere arbeidstid nødvendig. Klar til bruk AAV vektorer er oppnåelig i maksimum 6 virkedager etter den første transfection HEK293T celler.
Flere faktorer kan negativt påvirke den endelige avkastningen eller kvaliteten på AAV vektoren. Dårlig hva effektivitet er en av hovedårsakene til en lav viral yield33. En stor anbefaling er bruken av HEK293T celler som ikke har vært passaged mer enn 20 ganger og ikke har en celle samløpet større enn 90% ved transfection21. Dessuten, har hva metoden valgt stor innvirkning på resultatene. Denne protokollen er basert på bruk av PEI. PEI er en kationisk polymer muligheten til å levere eksogene DNA til cellekjernen gjennom generasjon komplekser av polymer og nucleic acid, kjent som polyplexes, som er tatt opp av celle- og menneskehandel via endosomes34. PEI-baserte hva er enkelt og raskt å utføre, i motsetning til andre brukte metoder, som co nedbør av DNA med kalsium fosfat35. PEI-baserte transfection er også mye billigere sammenlignet med andre nylig introduserte metoder, som bruken av kationisk lipider og magnet-mediert transfection36.
Rensing strategien spiller en nøkkelrolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserte renselser tendens til å inneholde en høyere prosentandel av Tom virus partikler (20%)20. Dette er motvirket, til en grad, for av det faktum at iodixanol-baserte rensing rutinemessig resulterer i AAV vektor preparater med en partikkel-til-infectivity ratio på mindre enn 100. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle CsCl-baserte prosedyrer, som er betydelige tap av partikkel infectivity rapporterte37. En annen vanlig alternativ metode å rense AAV vektorer er Ture-baserte rensing. Denne metoden har imidlertid den store ulempen at det kreves en bestemt kolonne for hver vektor kapsid brukes: for eksempel mens AAV2 er klassisk isolere benytter heparin kolonner, denne metoden fungerer ikke med AAV4 og AAV5, som ikke har heparin-bindende steder på deres capsids38. Tatt i betraktning at kromatografi rensing er også dyr, er iodixanol-baserte rensing generelt mer egnet for laboratorier som ønsker å produsere høykvalitets grupper av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. imidlertid for å maksimere siste avkastning og renhet av vektoren, forsiktig er nødvendig når du gjør den iodixanol forløpninger. Ulike iodixanol fraksjoner skal overføres til ultracentrifugation røret med en bakteriefri Pasteur pipette som har tipset er rørende veggen av røret: iodixanol bør bli utvist fra pipette sakte og kontinuerlig. Som vektor partikler akkumuleres i 40% iodixanol laget, må omsorg tas for å sikre at gradient grensesnittene ikke blander20. Til slutt, brøkdel inneholder vektoren skal hentes ved innsetting av en rustfritt stål sløv nål med en måler ikke større enn 20 G. For å maksimere vektor utvinning, skal klart brøken hentes i sin helhet. I dette trinnet er timingen kritiske. For å unngå forlegenhet renheten av preparatet, er det viktig å stoppe samlingen før andre (forurensende) faser av graderingen er samlet.
Forskjeller i innhentet vektor titer kan også tilskrives iboende evne til vektoren å produsere pakket partikler. En sammenligning mellom ulike AAV serotyper viste at noen AAV vektorer er vanskeligere å produsere på en høyere titer enn andre (f.eks AAV2)41. Nedbør av vektoren, under det avsalting trinnet kan være en mulig årsak til en lavere titer og forhindret lett ved å unngå overconcentration33. Dessuten, det er også mulig at effektiviteten av iodixanol forløpning-baserte rensing litt forskjellig mellom serotyper, og derfor avvik titer med forskjellige serotyper kan observeres41.
Til slutt må påpekes at selv om qPCR er en svært nøyaktig metode for DNA kvantifisering kan noen iboende variasjon i teknikken observeres. Nøyaktighet i Serine avhenger hovedsakelig nøyaktige pipettering og riktig vortexing for alle løsningene. For å garantere den mest nøyaktige titer lesing, qPCR kan være uavhengig gjentas, og fått verdiene i gjennomsnitt. Valg av primere presentert i denne protokollen er basert på rekkefølgen av CBA arrangøren i pTransgene plasmider brukes i vårt laboratorium. CBA er en sterk syntetisk promoter som er mye brukt i feltet vektor stasjonen uttrykk over flere celletyper. Den inneholder flere elementer, inkludert cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; arrangøren, første ekson og den første intron av CBA genet; og skjøte acceptor av kanin β-globin genet. Men kan primere være konstruert for nesten alle elementet ligger uttrykk kassetten (inkludert arrangøren, transgene og regulatoriske elementer). Sammenligning av titer på tvers av grupper er også mulig, gir deg primere brukes mot regioner felles for vektorer i spørsmålet.
Avslutningsvis kan denne protokollen brukes til å produsere AAV vektorer med en rekke capsids, genomet konfigurasjoner, formidler typer og transgene cargos. Dette vil tillate brukere å enkelt tilpasse seg siste kjennetegner deres vektorer som passer eksperimentelle behov. I eksemplet i representant resultatene, bruk av PHP. B kapsid, som effektivt krysser BBB, ga høyeffektive genuttrykk i CNS følgende hale blodåre injeksjon32. Systemisk administrasjonen av CNS penetrant vektorer har betydelige fordeler i form av mulige bivirkninger2,17,32. Et mulig alternativ til eksterne injeksjon, og unngå begrensningene av invasiv teknikker, er intratekal levering, som består av levering av AAV vektoren i spinalvæske. Denne levering ruten er bevist for å være effektive, viser utbredt uttrykket av transgene over CNS mindre off-målet effekter i eksterne organer og lave nivåer av immunrespons42. Imidlertid er intratekal injeksjoner mye mer utfordrende, siden de krever høyere tekniske ferdigheter enn hale blodåre injeksjon.
Kapsid videreutvikling å avgrense denne teknologien vil bli drevet av muligheter for AAV vektor bruk gene terapi. Disse tilbyr attraktive muligheter til å behandle er uhelbredelig CNS lidelser, som amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Parkinsons og Alzheimers18.

De siste 30 årene, har vill-type AAVs blitt utviklet for å opprette rekombinant AAV vektorer, som har vist seg for å være svært nyttig verktøy for genoverføring til CNS1,2,3,4, 5,6 og gene terapi tilnærminger til sykdom (inkludert FDA - og EMA-godkjent terapi)4,7. Deres egnethet for bruk i CNS stammer hovedsakelig fra deres evne til å infisere ikke dele, etter mitotisk celler, vanligvis finnes i CNS8. Men har AAV-baserte vektorer også fordelen at en langsiktig uttrykk for enhver gitt terapeutiske transgene4,9 mens fremlokkende en mildere immunrespons sammenlignet med andre viral vektorer7, 8,10,11,12.
Hovedelementene i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Vill-type AAVs er enkelt-strandet (ss) DNA virus med et genom omtrent 5 kilobases (kb)13. For produksjon av rekombinant AAV vektorer, rep og cap genene (nødvendig for genomet replikering og montering av viral kapsid) slettes fra genomet av vill-type AAV og gitt i trans, forlater rommet for en uttrykket kassett som inneholder transgene14,15. Invertert terminal gjenta sekvenser (ITRs) av det opprinnelige viral genomet er bare beholdt elementene i en AAV vektor, ettersom disse er avgjørende for replikering og emballasje3,10,14. AAV vektorer kan være konstruert for å forbedre transgene uttrykk. en mutasjon i en av ITRs fører til dannelsen av en hårnål loop som effektivt tillater generering av en komplementære DNA strand3,7,15. Den største fordelen med denne konfigurasjonen kalles en selv-utfyllende (sc) genom, er at det omgår behovet for andre-strand syntese vanlig i AAVs, betydelig øke hastigheten og nivåer av transgene uttrykket konvensjonelle livssyklus 1. likevel bruke en scAAV genomet reduserer lastekapasitet på vektoren til ca 2.4 kb. Dette inkluderer transgene sekvenser, samt noen regulatoriske sekvenser som arrangører eller microRNA bindende områder, for å begrense uttrykk til bestemte cellen typer16.
AAV kapsid bestemmer vektor-verten celle samspillet og gir en grad av celle type eller vev tropism for en AAV serotype, som kan også utnyttes til å begrense transgene uttrykk til bestemte steder. Flere AAV serotyper finnes i naturen, mens andre er produsert i laboratorier gjennom rekombinant tilnærminger (dvs. PHP. B). dessuten noen capsids også gi andre nyttige egenskaper, for eksempel muligheten til å krysse BBB, resulterer i levering av effekter av transgener i CNS når systemisk administrasjon. Dette har vist for AAV9 og nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som en konsekvens, viser disse serotyper seg for å være spesielt relevant for nye gene terapi tilnærminger nevrodegenerative lidelser1,17,18.
Målet med denne protokollen er å beskrive en kostnadseffektiv metode for småskala produksjon av AAV vektorer med høy titer og renhet. Selv om resultatene presenteres her bruk PHP. B kapsid og en scAAV uttrykk kassett, protokollen er egnet for produksjon av flere AAV vektor serotyper og genom konfigurasjoner, slik at eksperimentelle fleksibilitet. Imidlertid kan vektor avkastning og endelige renhet variere avhengig av den valgte serotype.
Protokollen er en variant av klassisk tri-transfection metoden for viral vektor produksjon og omfatter bruk av en iodixanol gradering for vektor opprydning, som, i forhold til den klassiske bruken av cesium chloride (CsCl) graderinger, er rapportert for å produsere AAV vektorer av høyere renhet i en mindre tidkrevende måte19,20,21.
Hva, rensing og konsentrasjon trinnene skal utføres i henhold til god laboratoriepraksis (GLP) i et vev kultur laboratorium vurdert for viral vektor arbeidet. Hver aktivitet må utføres i henhold til relevante lokale og nasjonale lovgivningen om viral vektor produksjon og bruk. Arbeidet må utføres under laminær strømning hette og sterile forhold. Inne vektor anlegget anbefales det å ha en lab forkle, i tillegg til den vanlige vev kultur lab coat. Videre bør et dobbelt par hansker, samt plast overtrekk på, brukes til alle tider.
Før starter vektor produksjon, sikre alt nødvendig utstyr og plasmider er tilgjengelig. 1) pCapsid plasmider inneholder rep genet som koder fire ikke-strukturelle proteiner nødvendig for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og cap genet som koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmider inneholder genene E4 E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produksjon i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmider inneholder transgene uttrykk kassetten, flankert av to ITRs. Disse plasmider kan være syntetisk de novo i laboratoriet ved hjelp sekvenser tilgjengelig online22. Plasmider laget de novo, er spesielt de som inneholder romanen effekter av transgener, sekvensering nødvendig, sørge for at transgene og ITRs er riktig. Alternativt kan forhåndslagde plasmider være direkte ervervet gjennom online plasmider repositories. Når det er nødvendig, plasmider kan bli forsterket og renset med standard kits, i henhold til produsentens instruksjoner23.
Vector titer og renhet kan påvirke signaltransduksjon evne til vektor. Ytterligere protokoller leveres for å vurdere kvaliteten på produsert vektoren. Siste vektorer vil være nyttig for studier av CNS celle-funksjonen i både i vitro og vivo programmer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gen levering verktøy basert på adeno-assosiert virus (AAVs) er et populært valg for levering av effekter av transgener til sentralnervesystemet (CNS), inkludert gene terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan infisere både dele og ikke dele celler og gi langsiktig transgene uttrykk. Viktigere, noen serotyper, som nylig beskrevet PHP. B, kan krysse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, etter systemisk levering. AAV vektorer kan være effektivt produsert i laboratoriet. Robust og reproduserbar protokoller er imidlertid nødvendig for å hente AAV vektorer med tilstrekkelig renhet nivåer og titer verdiene høy nok for i vivo programmer. Denne protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar strategi for AAV vektor produksjon basert på en iodixanol gradient rensing strategi. Iodixanol rensing metoden er egnet for å få grupper av høy-titer AAV vektorer av høy renhet, sammenlignet med andre metoder for rensing. Videre er protokollen raskere enn andre metoder for øyeblikket beskrevet. I tillegg en kvantitativ polymerase kjede reaksjon (qPCR)-basert strategi er beskrevet for en rask og nøyaktig bestemmelse av vektor titer, samt en silver flekker metode å avgjøre renheten av vektor bunken. Til slutt, representant resultatene av genet levering til CNS etter systemisk administrasjon av AAV-PHP. B, presenteres. Slike resultater bør være mulig i alle labs ved hjelp av protokoller som er beskrevet i denne artikkelen.

AAV9 ble ansett, inntil nylig, å være den mest effektive AAV vektor serotype i krysset BBB og transducing celler i CNS etter ekstern administrasjon. En betydelig fordel i kapsid design ble oppnådd når Deverman et al. rapportert bruk av en kapsid utvalg metode kalt grobunn rekombinasjon-baserte AAV målrettede utviklingen (Opprett)17. På denne måten, identifiserte de en ny kapsid, kalt PHP. B, som de rapporterte som kunne transduce de fleste av astrocyttene og nerveceller i flere CNS områder, etter systemisk injeksjon17. På dette punktet det bør bemerkes at selv om PHP. B gir positive resultater i C57/Bl6 mus (som var påkjenningen brukes i første isolasjon forsøkene), foreløpige rapporter tyder effektiviteten kan variere på en stamme-avhengige måte. Ytterligere eksperimenter vil uten tvil kaste mer lys over dette problemet31.
Men til tross for disse problemene, PHP. B gir spennende muligheter for noninvasive genet manipulasjon i CNS mus, inkludert proof-of-concept gene terapi eksperimenter i sykdom modeller. Som sådan, valgte vi å vurdere effektiviteten av transgene uttrykk ved hjelp av PHP. B mot AAV9, som har vært 'gull-standard' vektoren for CNS signaltransduksjon etter ekstern administrasjon siden 20092. Hvis du vil utføre en direkte sammenligning av både serotyper, under optimale forhold for transgene uttrykk, brukte vi en sc genomet konfigurasjon32. Både vektorer gjennomført transgene for grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av allestedsnærværende kylling β-utgangen (CBA) arrangøren. Kvinnelige C57/Bl6 mus på postnatal dag 42 (ca 20 g i vekt) mottok en dose av 1 x 1012 vg per musen enten scAAV2/php. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administrasjon ble utført via hale blodåre injeksjon. Eksperimentene ble godkjent av den etiske komiteen KU Leuven.
Tre uker postinjection, mus gjennomgikk transcardial perfusjon med iskald PBS, etterfulgt av 4% (w/v) iskalde paraformaldehyde (PFA). Hjernen ble høstet og gjennomgikk ytterligere postfixation av en overnatting inkubasjon i den samme bindemiddel, før du overfører til 0,01% (w/v) Na-azide/PBS for lagring til videre analyse. Etterpå hjernen ble delt med en vibrerende mikrotom, og immunohistochemistry ble utført på 50 µm tykke snitt.
For å evaluere nivåer av transgene uttrykk, deler var farget med primære antistoffer mot GFP (kanin anti-GFP), med oppdagelsen bruke sekundære antistoffer konjugert til en fluorescerende farge (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet målinger (i vilkårlig enheter [au]) bekreftet en betydelig økning i GFP uttrykk når en sc genom og PHP. B kapsid ble brukt i forhold til AAV9. Økning i GFP ble observert i cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillehjernen (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0.0032), og hjernestammen (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figur 4: systemisk levering av scAAV2/PHP. B-CBA-GFP fører til en høy GFP uttrykk i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mus) ble administrert til 6 uker gamle C57/Bl6 mus via hale blodåre injeksjon. GFP ble oppdaget ved hjelp av immunohistochemistry på koronale hjernen deler 3 uker postinjection. (A) cerebrum og (B) av lillehjernen og hjernestammen vises. Skalere barer = 1 mm. (C) kvantifisering av relativ fluorescens intensiteter ble utført for å bestemme nivået av GFP signal med hver vektor (10 deler per musen, tre mus per vektor gruppe). En enveis ANOVA test ble utført, etterfulgt av en tosidige Student t-test; dataene er uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik; p < 0.01; Au. vilkårlig enheter. pCapsid, brukes for AAV vektor produksjon, inneholder genet rep fra serotype 2 og gene cap fra serotype PHP. B eller AAV9, tilsvarende. Dette tallet har blitt endret fra Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Her beskriver vi en effektiv og reproduserbar strategi å produsere titer og kvalitetskontroll grupper av adeno-assosiert virus vektorer. Det lar brukeren få en vektor forberedelse med høy-titer (≥1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høy renhet, klar til bruk i vitro eller vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Ved å følge denne protokollen vil brukeren kunne produsere AAV vektorer med høy renhet og utbytte egnet for in vitro eller in vivo applikasjoner. Denne protokollen kan brukes til å produsere og rense en rekke AAV-serotyper med forskjeller i konfigurasjoner. Kombinere disse to elementene kan være nyttig for å få celletype og vevsspesifikt uttrykk.Produksjon av noen serotyper kan gi til lavere utbytte. Dette er produksjon der det er nære serotyper og bør evalueres individuelt. Viser disse prosedyrene vil være Shelly Fripont, en tekniker fra vårt laboratorium.Etter å ha dyrket HEK-cellene, bland 360 mikrogram hjelperplasmid, 180 mikrogram plasmidkoding av vektorcapid, og 180 mikrogram plasmid som inneholder transgenen i 18 milliliter med 150 millimolar natriumklorid for å forberede DNA-blandingen. Fordel denne blandingen over tre 50 milliliter koniske rør. I et nytt konisk rør, bland 840 mikrogram PEI og seks milliliter med 150 millimolar natriumklorid for å forberede PEI-blandingen for seks cellekulturretter.Deretter legger du til seks milliliter av PEI-blandingen, dråpe for dråpe, til et av de koniske rørene som inneholder DNA-blandingen. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter fjerner du seks cellekulturretter fra inkubatoren.I en laminær strømningshette, aspirerer mediet helt fra hver tallerken. Skyll oppvasken med fem milliliter forhåndsvarmet DPBS for å fjerne spor av mediet. Vipp forsiktig hver tallerken for å sikre at DPBS er jevnt fordelt over hele overflaten.Deretter aspirerer du forsiktig DPBS. Tilsett 12 milliliter DMEM en til hver tallerken sakte, med en pipette plassert på kanten av parabolen. Bland PEI- og DNA-blandingen ved å pipe den opp og ned tre til fem ganger.Tilsett to milliliter av denne blandingen til hver av de seks cellekulturrettene i en dråpe for dråpemote, og sørg for å distribuere den forsiktig over hele overflaten. Gjenta denne prosessen ved hjelp av seks cellekulturretter om gangen til du når 18 cellekulturretter. Rist forsiktig cellekulturrettene for å fordele PEI DNA-blandingen.Inkuber de trans infiserte cellene ved 37 grader Celsius med 95 prosent fuktighet og fem prosent karbondioksid i fem timer. Etter dette legger du til ytterligere 12 milliliter DMEM 10 til hver av de 18 rettene uten å fjerne det eksisterende mediet. Fortsett å inkubere de trans infiserte cellene under de samme forholdene.Ved 72 timer etter transinfeksjon, bruk en celleskraper til å forsiktig løsne cellene fra hver kulturrett. Samle mediet og cellene i to kulturretter i et 15 milliliter konisk rør, holdt på is. Sentrifuger rørene ved 420 ganger G og ved fire grader Celsius i 10 minutter med akselerasjon og retardasjon av sentrifugen satt til maksimum.Kast forsiktig overnatanten fra hvert rør ved å helle det forsiktig i en avfallsbeholder. Deretter plasserer du rørene som inneholder cellepellets på isen. Vi suspenderer hver pellet i to milliliter lysisbuffer og blandes ved å pipetter opp og ned fem til 10 ganger.Trekk AAV fra tre rør, sammen. Til å begynne med, frys de re-suspenderte cellene ved å plassere dem i en bøtte som inneholder tørris blandet med etanol. Tin deretter cellene ved å umiddelbart plassere dem i et vannbad satt til 37 grader Celsius.Gjenta denne fryse- og tinesyklusen tre ganger for å lyse cellene og frigjøre AAV-partiklene. Etter det tredje tiningstrinnet sentrifuge ved 1167 ganger G og ved fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør forsiktig supernativa for å rengjøre 50 milliliter koniske rør.Tilsett kjerner til hvert rør til en endelig konsentrasjon på 50 enheter per milliliter supernatant. Inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter, mens virvlende rørene hvert 10. Sentrifuge ved 13490 ganger G og ved fire grader Celsius i 20 minutter for å avklare det overnaturlige.Etter dette fjerner du stempelet på en 10 milliliter sprøyte, fester et 0,45 mikrometerfilter til sprøyten og plasserer det på toppen av et rent 50 milliliter konisk rør. Fyll sprøyten forsiktig med det avklarte supernatantet. Bruk stempelet til å tvinge lysatet gjennom filteret.Deretter forbereder du hver av iodixanol-brøkene i fire separate 50 milliliter koniske rør, som beskrevet i tabell en av tekstprotokollen. Pipette åtte milliliter på 15 prosent iodixanol i hver av de tre ultracentrifuge rørene. Pipette 5,5 milliliter på 25 prosent iodixanol i et rent konisk rør på 50 milliliter.Ved hjelp av en ikke-gradert Pasteur pipette, nøye lag 5,5 milliliter av 25 prosent iodixanol løsning under 15 prosent iodixanol løsning. Legg til løsningene på 40 prosent og 60 prosent som beskrevet i tekstprotokollen. Iodixanol fraksjoner bør ikke intermix på lagdeling.Bruk en Pasteur pipette, lag rålysatet på toppen av 15 prosent iodixanol gradient, dråpe for dråpe, for å unngå å forstyrre grensesnittet mellom rålyst og iodixanolløsningen. Fyll hvert ultracentrifugation tube med lysis buffer til menisken når bunnen av rørhalsen, for å sikre at røret ikke kollapser under de svært høye kreftene som genereres under ultracentrifugation. Lukk rørene med passende lokk.Bruk en digital skala, sørg for at alle tre ultracentrifugation rør har samme vekt. Justere vekten etter behov, ved å legge til mer lysis buffer på toppen av råoljelyst. Bruk en fast vinkel titanrotor til å sentrifugere rørene ved 301580 ganger G og ved 12 grader Celsius i en time og 40 minutter ved hjelp av maksimal akselerasjon og retardasjon.Deretter fester du en nål til en fem milliliter sprøyte. Fjern avstandsslangen fra rørene i rotoren, og gjenopprett rørene etter sentrifugalisering. Aspirer bare 40 prosent iodixanolfraksjon som inneholder vektorpartiklene.Enten behandle prøven eller lagre den på fire grader Celsius. Her demonstreres en protokoll som kan brukes til å produsere AAV-vektorer med en rekke capsids, genomkonfigurasjoner, promotortyper og transgenelaster. I dette eksemplet produserte og renset vi to forskjellige AAV-vektorer som uttrykte det grønne fluorescerende proteinet fra et selv gratis genom.De to vektorene er preget av forskjellige capsids: PHPB og AAV9. De ble levert, via hale vene injeksjon, i voksen C57 svart seks mus. For å evaluere nivåene av transgenuttrykk tre uker etter injeksjon, er seksjoner farget med primære antistoffer mot GFP ved hjelp av sekundære antistoffer konjugert til et fluorescerende fargestoff.Fluorescensintensitetsmålinger viser en betydelig økning i GFP-uttrykk når PHPB-vektoren brukes i forhold til AAV9. Økninger i GFP ble observert i cerebrum, lillehjernen, og i hjernestammen. Den nøyaktige samlingen av vektoren som inneholder brøk er avgjørende for denne protokollen.I tilfelle dette ikke gjøres riktig, påvirkes vektorutbyttet samt vektorrenheten negativt. Å kunne produsere AAV vektorer, små laboratorier vil være i stand til å dra nytte av mange eksperimentelle muligheter til å levere gener i sentralnervesystemet. Denne protokollen krever bruk av en ultracentrifuge og det er viktig å få riktig opplæring før du håndterer dette for å unngå ulykker.Videre er AAV vektorer ofte klassifisert som biohazards, og derfor bør du konsultere lokale forskrifter før du håndterer og administrerer dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

En i Ovo modell for Testing Insulin-mimetic forbindelser

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte intratekal injeksjon av rekombinant Adeno-assosiert virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konveksjon Enhanced levering av Optogenetic Adeno-Associated viral Vector til cortex på rhesus macaque under veiledning av online MRI bilder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: En hjulkontrollbasert spillplattform for å studere menneskelig sensorisk kontroll

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...