Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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M.R. é suportado por um Fonds voor bolsa de pós-doutorado Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) e reconhece o apoio contínuo da Fundação Cardiovascular da Colômbia e do departamento de ciências administrativas, Tecnologia e inovação (Grant CT-FP44842-307-2016, código de projeto 656671250485). M.M. é apoiado por uma bolsa de PD FWO (1S48018N). M.G.H. foi apoiado por um VIB institucional grant e o apoio externo do Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), Fundação para pesquisa de Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), o FWO (Grant 1513616N) e o Conselho Europeu de investigação (CEI) (começando Grant 281961 - AstroFunc; Prova de conceito Grant 713755 - AD-VIP). Os autores reconhecem Jeason Haughton por sua ajuda com a criação do mouse, Stephanie Castaldo pela ajuda realizando as injeções de veia de cauda e Caroline Eykens por fornecer as imagens das células transfectadas de HEK293T. M.G.H. reconhece Michael Dunlop, Peter Hickman e Dean Harrison.

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Os autores não têm nada para divulgar.

A produção de vetores AAV recombinantes descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns à maioria dos laboratórios de biologia molecular e instalações de cultura de células. Permite ao usuário obter vetores AAV puro, pré-clínicos da classe que podem ser usados para vários tipos de células e tecidos-alvo através de uma gama de aplicações in vitro e in vivo . Uma das maiores vantagens do presente protocolo, em relação aos outros (ou seja, com base em CsCl purificação), é o mais curto tempo de trabalho necessário. Vetores AAV Ready-to-use são obtidos em um máximo de 6 dias úteis após a inicial transfecção de células HEK293T.
Vários fatores podem influenciar negativamente o rendimento final ou a qualidade do vetor AAV. Pobre do transfection eficiência é uma das principais razões para um baixo rendimento viral33. Uma recomendação importante é a utilização de células HEK293T isso não ter sido passado mais de 20 vezes e não têm uma confluência de célula superior a 90% no momento da transfecção21. Além disso, o método de transfeccao selecionado tem um grande impacto sobre os resultados. Este protocolo baseia-se na utilização de PEI. PEI é um polímero catiônico, com a capacidade para entregar o DNA exógeno para o núcleo da célula através da geração de complexos de polímero e de ácidos nucleicos, conhecido como polyplexes, que são aceites pelo celular e traficadas através de endossomos34. PEI-baseado transfection é fácil e rápido de executar, em contraste com outros métodos amplamente utilizados, tais como a co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio35. Também, o PEI-baseado transfection é muito mais barato quando comparado a outros métodos recentemente introduzidos, tais como o uso de lipídios catiônicos e mediada por ímã transfeccao36.
A estratégia de purificação desempenha um papel fundamental no protocolo. Em comparação com outros métodos, baseados em iodixanol purificações tendem a conter uma percentagem mais elevada de partículas virais vazio (20%)20. Isso é compensado, até certo ponto, pelo fato de que a purificação baseada em iodixanol rotineiramente resulta em preparações de vetor de vírus adeno-associados com um rácio de partícula-para-infectividade de menos de 100. Isto representa uma melhoria significativa em comparação com procedimentos convencionais baseados em CsCl, substancial perda de infecciosidade partícula for relatado37. Outro método alternativo comum para purificar vetores AAV é baseado em cromatografia de purificação. No entanto, este método tem a grande desvantagem que uma coluna específica é necessária para cada capsídeo de vetor usado: por exemplo, enquanto AAV2 é classicamente isolado usando colunas de heparina, esta metodologia não funciona com AAV4 e AAV5, que não possuem ligação de heparina sites sobre seus capsids38. Considerando que a purificação de cromatografia também é cara, baseada em iodixanol purificação é geralmente mais apropriada para laboratórios que desejam produzir lotes de alta qualidade de vetores AAV em uma pequena escala33,39, 40. no entanto, para maximizar o rendimento final e a pureza do vetor, extremo cuidado é necessário quando fazendo do iodixanol. As várias fracções iodixanol devem ser transferidas para o tubo de ultracentrifugação usando uma pipeta Pasteur estéril, cuja ponta é tocar a parede do tubo: iodixanol devia ser expulso da pipeta lentamente e continuamente. Como as partículas do vetor se acumulam na camada de iodixanol 40%, cuidado deve ser tomado para garantir que não se misturam as interfaces gradientes20. Finalmente, a fração que contém o vetor deve ser recuperada através da inserção de uma agulha em aço inoxidável com um calibre não superior a 20 G. Para maximizar a recuperação de vetor, a fração clara deve ser recuperada na sua totalidade. Durante esta etapa, o tempo é crítico. Para evitar comprometer a pureza da preparação, é essencial para parar a coleção antes de outras fases (contaminantes) do gradiente são coletados.
Diferenças do título obtidos vetor podem ser atribuídas também à capacidade intrínseca do vector para produzir partículas embaladas. Uma comparação entre diferentes sorotipos de vírus adeno-associados mostrou que alguns vetores AAV são mais difíceis de produzir em um título mais elevado do que outros (por exemplo, AAV2)41. Precipitação do vetor, durante a etapa do desalting, pode ser uma razão possível para um título inferior e facilmente prevenida evitando mais33. Além disso, também é possível que a eficiência da purificação de baseados em gradiente iodixanol difere ligeiramente entre sorotipos e, portanto, discrepâncias do título obtido com sorotipos diferentes podem ser observadas41.
Finalmente, ele precisa ser salientado que, apesar de qPCR é um método muito preciso para quantificação de DNA alguns variabilidade inerente a esta técnica pode ser observada. Precisão na titulação depende, principalmente, a pipetagem precisa e adequada utilização do Vortex de todas as soluções. Para garantir o título mais preciso ler, o qPCR pode ser repetido independentemente, e a média dos valores obtidos. A escolha das primeiras demão apresentado neste protocolo baseia-se na sequência do promotor CBA localizado no plasmídeo pTransgene usado em nosso laboratório. O promotor do CBA é um forte promotor sintético que é amplamente utilizado no campo vetor para expressão de carro em vários tipos de célula. Ele incorpora vários elementos, incluindo o elemento inicial do realçador citomegalovírus (CMV); o promotor, primeiro exon e o primeiro intron do gene da CBA; e o aceitador da tala do gene de β-globina do coelho. No entanto, as primeiras demão podem ser projetadas para praticamente qualquer elemento localizado dentro da gaveta de expressão (incluindo o promotor, transgene e dos elementos reguladores). A comparação do título através de lotes também é possível, desde que as primeiras demão são usadas contra regiões comuns para os vetores em questão.
Em conclusão, este protocolo pode ser usado para produzir vetores de vírus adeno-associados com uma variedade de capsids, configurações de genoma, tipos de promotor e cargas do transgene. Isto permitirá que os usuários facilmente adaptar as características finais de seus vetores para melhor atender as necessidades de experimentais. No exemplo apresentado nos resultados da representante, o uso do PHP. Capsídeo B, que eficientemente atravessa o BBB, deu expressão gênica altamente eficiente no SNC, seguir cauda veia injeção32. A administração sistémica de vetores penetrante CNS tem vantagens consideráveis em termos de possíveis efeitos colaterais de17,2,32. Uma possível alternativa à injeção periférica, evitando as advertências de técnicas invasivas, é entrega intratecal, que consiste em entrega do vetor AAV no fluido cerebrospinal. Esta rota de entrega é provada para ser eficaz, mostrando generalizada expressão do transgene através do CNS, menos efeitos fora do alvo em órgãos periféricos e baixos níveis de resposta imune42. No entanto, injeções intratecal são muito mais desafiador, que requerem habilidades técnicas mais elevadas do que a injeção de veia de cauda.
Desenvolvimento do capsídeo para refinar esta tecnologia será conduzido pelas oportunidades para o uso de vetor AAV em aplicações da terapia de gene. Tais abordagens oferecem possibilidades atraentes para tratar doenças do SNC atualmente incuráveis, tais como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer18.

Nos últimos 30 anos, selvagem-tipo AAVs tem sido projetados para criar vetores AAV recombinantes, que provaram para ser excepcionalmente úteis ferramentas para a transferência de genes para o CNS1,2,3,4, 5,6 e gene terapia aproxima-se a doença (incluindo aprovado pela FDA e EMA terapias)4,7. Sua adequação para uso no SNC em grande parte deriva de sua capacidade de infectar células não-dividindo, pós mitóticas, tipicamente encontrados no CNS8. No entanto, vectores baseados em vírus adeno-associados também têm a vantagem de permitir uma expressão a longo prazo de qualquer dado transgene terapêutica4,9 , suscitar uma resposta imune mais ameno, em comparação com outros vetores virais7, 8,10,11,12.
Os principais elementos de qualquer vetor de vírus adeno-associados são o genoma e o capsídeo. Selvagem-tipo AAVs são single-stranded (ss), vírus de DNA com um genoma de aproximadamente 5 kilobases (kb)13. Para a produção de vetores AAV recombinantes, os genes rep e cap (necessários para a replicação do genoma e a montagem do capsídeo viral) são excluídos do genoma do vírus adeno-associados do selvagem-tipo e fornecidos em trans, deixando espaço para uma gaveta de expressão contendo o transgene14,15. As invertido terminais repetir sequências (ITRs) do genoma viral original são os únicos elementos retidos em um vetor de vírus adeno-associados, como estas são essenciais para a replicação e empacotamento de10,3,14. Vetores AAV podem ser projetados para realçar a expressão do transgene; uma mutação em um dos ITRs leva à formação de um loop de grampo de cabelo que efetivamente permite a geração de uma vertente DNA complementar3,7,15. A principal vantagem desta configuração, denominado um genoma de autocomplementares (sc), é que ele ignora a necessidade de síntese do segundo-costa típico do ciclo de vida convencional de AAVs, aumentando consideravelmente a velocidade e os níveis de expressão do transgene 1., no entanto, usar um genoma scAAV reduz a capacidade de carga do vetor de aproximadamente 2,4 kb. Isso inclui sequências de transgene, bem como qualquer sequências reguladoras tais como promotores ou sites de microRNA-ligação, para limitar a expressão de tipos de célula específica16.
O capsídeo do vírus adeno-associados determina interação vetor-hospedeiro celular e confere um grau de tropismo de tipo ou tecido celular por um sorotipo de vírus adeno-associados, que também pode ser explorado para limitar a expressão do transgene para locais específicos. Vários sorotipos de vírus adeno-associados são encontrados na natureza, Considerando que os outros tenham sido produzidos em laboratórios através de abordagens recombinantes (i.e., PHP. B). Além disso, alguns capsids também conferem outras características úteis, tais como a capacidade de atravessar o BBB, resultando na entrega de transgenes em todo o SNC após administração sistémica. Isto foi mostrado para AAV9, bem como para o PHP recentemente descrita. B capsídeo17. Como consequência, estes sorotipos estão provando para ser particularmente relevante para novas abordagens de terapia do gene para1817,1,do doenças neurodegenerativas.
O objectivo do presente protocolo é descrever um método de baixo custo para a produção em pequena escala de vetores AAV com alta concentração e pureza. Embora os resultados apresentados aqui use o PHP. Capsídeo B e uma gaveta de expressão scAAV, o protocolo é apropriado para a produção de vários serótipos de vetor de vírus adeno-associados e configurações de genoma, permitindo a máxima flexibilidade experimental. No entanto, o rendimento de vetor e pureza final podem variar dependendo do serótipo escolhido.
O protocolo em si é uma variante do método de produção viral vector tri-transfecção clássica e incorpora o uso de um gradiente de iodixanol para vector limpar, que, em comparação com o clássico uso de gradientes (CsCl) de cloreto de césio, tem sido relatado para produzir vetores AAV de maior pureza em um tempo mais eficiente forma19,20,21.
As etapas de transfeccao, purificação e concentração destinam-se a ser realizada de acordo com boas práticas de laboratório (BPL) em um laboratório de cultura de tecido avaliado para trabalho de vetor viral. Cada tarefa deve ser executada em conformidade com a legislação pertinente de local e nacional relativas à produção de vetor viral e usar. Trabalho deve ser realizado sob uma capa de fluxo laminar e em condições estéreis. Dentro das instalações do vector, é aconselhável usar um avental de laboratório, além do jaleco de cultura de tecido normal. Além disso, um duplo par de luvas, bem como as galochas de plástico, deve ser usado em todos os momentos.
Antes de iniciar a produção de vetor, certifique-se de todos os equipamentos necessários e plasmídeos estão disponíveis. 1) pCapsid plasmídeo contém o rep o gene que codifica a quatro proteínas não estruturais necessárias para a replicação, nomeadamente Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e o cap gene que codifica a três proteínas estruturais do capsídeo, nomeadamente VP1, VP2 e VP3. 2) plasmídeo pHelper contém os genes E4 E2Ae VA de adenovírus, que facilitam a produção de AAV nas células HEK293T. 3) plasmídeo pTransgene contém a fita de expressão do transgene, ladeada por dois ITRs. Estes plasmídeos podem ser sintetizados de novo no laboratório usando sequências disponíveis on-line22. Para plasmídeos feitos de novo, especialmente aqueles que contêm transgenes romance, sequenciamento é necessário, para certificar-se de que o transgene e ITRs estão corretas. Como alternativa, do premade plasmídeos podem ser adquiridos directamente através de repositórios on-line do plasmídeo. Quando necessário, plasmídeos podem ser amplificados e purificada usando kits de padrão, de acordo com instruções23 as indicações do fabricante.
Título de vetor e pureza podem afectar negativamente a capacidade de transdução do vetor. Protocolos adicionais são fornecidos para avaliar a qualidade do vetor produzido. Os vetores finais serão úteis para estudos da função de célula CNS em aplicações tanto in vitro e in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Ferramentas de entrega de gene com base no vírus adeno-associado (AAVs) são uma escolha popular para a entrega de transgenes para o sistema nervoso central (CNS), incluindo aplicações da terapia de gene. Vetores AAV são não se replicam, capaz de infectar células de divisão e não dividindo e fornecer a longo prazo expressão do transgene. Importante, alguns serotipos, tais como o PHP recém descrito. B, pode cruzar a sangue-cérebro-barreira (BBB) em modelos animais, após o parto sistêmico. Vetores de vírus adeno-associados podem ser eficientemente produzidos em laboratório. No entanto, robustos e reprodutíveis protocolos são necessários para obter vetores AAV com níveis suficientes de pureza e valores de concentração altas o suficiente para aplicações em vivo . Este protocolo descreve uma estratégia eficiente e reprodutível para produção de vetor AAV, baseada numa estratégia iodixanol gradiente de purificação. O método de purificação iodixanol é adequado para a obtenção de lotes de vetores AAV alta-título de alta pureza, quando comparado a outros métodos de purificação. Além disso, o protocolo é geralmente mais rápido que outros métodos descritos atualmente. Além disso, um quantitativo polymerase chain reação (qPCR)-estratégia baseada é descrito por uma determinação rápida e precisa do título o vetor, bem como uma método de coloração de prata determinar a pureza do lote vector. Finalmente, resultados representativos da entrega do gene ao SNC, seguindo a administração sistémica de AAV-PHP. B, são apresentados. Tais resultados devem ser possíveis em todos os laboratórios usando os protocolos descritos neste artigo.

AAV9 foi considerada, até recentemente, para ser o mais eficaz sorotipo de vetor AAV no cruzando o BBB e transducing células do SNC, após a administração periférica. Foi conseguido um avanço significativo no projeto de capsídeo quando Deverman et al. relataram o uso de um método de seleção de capsídeo chamado Cre evolução de AAV-alvo baseados na recombinação (criar)17. Usando este método, eles identificaram um novo capsídeo, chamado PHP. B, que relataram como capaz de transduce a maioria dos astrócitos e neurônios em várias regiões do CNS, após a injeção sistêmica de17. Neste ponto, deve ser observou que mesmo que PHP. B fornece resultados positivos em camundongos C57/Bl6 (que era a tensão utilizada nas experiências de isolamento inicial), relatórios preliminares sugerem que sua eficácia pode variar de forma dependente da tensão. Mais experimentos verterá, sem dúvida, mais luz sobre esta questão31.
No entanto, apesar desses problemas, PHP. B oferece possibilidades excitantes para manipulação de gene não-invasiva no SNC de camundongos, incluindo experiências de terapia do gene de prova de conceito em modelos de doenças. Como tal, escolhemos avaliar a eficiência da expressão do transgene utilizando PHP. B contra o AAV9, que tem sido o vetor 'padrão ouro' para a transdução de CNS administração periférica desde 20092a seguir. Para realizar uma comparação direta entre os dois serótipos, sob condições ideais para a expressão do transgene, usamos um genoma de sc configuração32. Ambos os vetores carregava o transgene para a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor frango onipresente β-actina (CBA). Camundongos C57/Bl6 fêmeas no dia pós-natal 42 (cerca de 20 g de peso) receberam uma dose de 1 x 1012 vg por rato de qualquer scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administração foi realizada através de injeção de veia de cauda. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética do KU Leuven.
Postinjection de três semanas, os ratos foram submetidos a perfusão transcardial com PBS gelado, seguido de 4% (p/v) gelada paraformaldeído (PFA). Seus cérebros foram colhidos e submeteu-se ainda mais postfixation por uma incubação durante a noite no fixador mesmo, antes de transferir para 0,01% (p/v) at-azida/PBS para armazenamento até posterior análise. Depois, os cérebros foram seccionados usando um micrótomo vibratório e imuno-histoquímica foi realizada em 50 µm de seções espessas.
Para avaliar os níveis de expressão do transgene, seções foram coradas com anticorpos primários contra GFP (coelho anti-GFP), com deteção usando anticorpos secundarios conjugados a um corante fluorescente (anticoelho Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Medições de intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias [au]) confirmaram um aumento significativo na expressão de GFP quando um sc genoma e o PHP. Capsídeo B foram usados em relação ao AAV9. Foram observados aumentos na GFP no cérebro (2105 que 161 de ± vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), o cerebelo (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e o tronco cerebral (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 UA; p = 0.0038) (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figura 4: entrega sistêmica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leva a uma alta expressão de GFP no SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mouse) foi administrado a camundongos C57/Bl6 de 6 semanas de idade através da injeção de veia de cauda. GFP foi detectado usando imuno-histoquímica na postinjection de 3 semanas de secções coronais do cérebro. (A) o encéfalo e (B) o cerebelo e tronco encefálico são mostrados. Barras de escala = 1 mm. (C) a quantificação das intensidades de fluorescência relativa foi realizada para determinar os níveis de sinal GFP alcançado com cada vetor (10 seções por rato; três ratos por grupo de vetor). Foi realizado um teste ANOVA One-Way, seguido de um Student bicaudal t-teste; os dados são expressos como média ± desvio-padrão; p < 0,01; au. unidades arbitrárias. pCapsid, usado para a produção de vetor de vírus adeno-associados, contém o gene rep do sorotipo 2 e o gene cap do sorotipo PHP. B ou AAV9, em conformidade. Esta figura foi modificada em Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Seguindo este protocolo, o usuário poderá produzir vetores AAV de alta pureza e rendimento adequado para aplicações in vitro ou in vivo. Este protocolo pode ser usado para produzir e purificar uma gama de sorotipos AAV com diferenças nas configurações. A combinação desses dois elementos pode ser útil para obter o tipo celular e a expressão específica do tecido.A produção de alguns sorotipos pode dar um rendimento menor. Esta é a produção onde há sorotipos próximos e deve ser avaliado individualmente. Demonstrando esses procedimentos será Shelly Fripont, técnica do nosso laboratório.Depois de cultivar as células HEK, misture 360 microgramas de plasmídeos auxiliares, 180 microgramas de plasmid codificando o capsídeo vetorial, e 180 microgramas de plasmídeo contendo o transgene em 18 mililitros de 150 milimilas de cloreto de sódio para preparar a mistura de DNA. Distribua esta mistura por três tubos cônicos de 50 mililitros. Em um novo tubo cônico, misture 840 microgramas de PEI e seis mililitros de cloreto de sódio de 150 mililitros para preparar a mistura pei para seis pratos de cultura celular.Em seguida, adicione seis mililitros da mistura PEI, gota a gota, a um dos tubos cônicos contendo a mistura de DNA. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova seis pratos de cultura celular da incubadora.Em uma capa de fluxo laminar, aspire completamente o meio de cada prato. Enxágüe os pratos com cinco mililitros de DPBS pré-aquecidos para remover traços do meio. Incline suavemente cada prato para garantir que o DPBS seja distribuído uniformemente por toda a superfície.Em seguida, aspire suavemente o DPBS. Adicione 12 mililitros de DMEM um a cada prato lentamente, com uma pipeta colocada na borda do prato. Misture o PEI e a mistura de DNA, encanar-o para cima e para baixo três a cinco vezes.Adicione dois mililitros desta mistura a cada um dos seis pratos de cultura celular de forma gota a gota, certificando-se de distribuí-lo cuidadosamente sobre toda a superfície. Repita este processo usando seis pratos de cultura celular de cada vez até chegar a 18 pratos de cultura celular. Agite suavemente os pratos da cultura celular para distribuir a mistura de DNA PEI.Incubar as células transfeinadas a 37 graus Celsius com 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois disso, adicione mais 12 mililitros de DMEM 10 a cada um dos 18 pratos sem remover o meio pré-existente. Continue incubando as células transfeinadas nas mesmas condições.Às 72 horas após a transfecção, use um raspador de células para separar cuidadosamente as células de cada prato de cultura. Colete o meio e as células de dois pratos de cultura em um tubo cônico de 15 mililitros, mantidos no gelo. Centrifugar os tubos a 420 vezes G e a quatro graus Celsius por 10 minutos com a aceleração e desaceleração da centrífuga definida ao máximo.Descarte cuidadosamente o supernatante de cada tubo, despejando-o suavemente em um recipiente de descarte de resíduos. Em seguida, coloque os tubos contendo as pelotas de célula no gelo. Suspendemos cada pelota em dois mililitros de tampão de lise e misturamos pipetting para cima e para baixo cinco a dez vezes.Puxe o AAV de três tubos, juntos. Para começar, congele as células re-suspensas colocando-as em um balde contendo gelo seco misturado com etanol. Em seguida, descongele as células colocando-as imediatamente em um banho de água a 37 graus Celsius.Repita este ciclo de congelamento e degelo três vezes para lise as células e solte as partículas AAV. Após o terceiro passo de descongelamento, centrífuga a 1167 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira cuidadosamente os supernantes para limpar tubos cônicos de 50 mililitros.Adicione nuclease a cada tubo a uma concentração final de 50 unidades por mililitro de supernaspeuta. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, enquanto gira os tubos a cada 10 minutos para garantir que a nuclease seja completamente misturada com o sobrenante. Centrifugar a 13490 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o supernaspe.Depois disso, remova o êmbolo de uma seringa de 10 mililitros, conecte um filtro de 0,45 micrômetro à seringa e coloque-a em cima de um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Encha cuidadosamente a seringa com o supernatante esclarecido. Use o êmbolo para forçar o lise através do filtro.Em seguida, prepare cada uma das frações iodixanol em quatro tubos cônicos separados de 50 mililitros, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Pipeta oito mililitros de 15% de iodixanol em cada um dos três tubos ultracentrífugas. Pipeta 5,5 mililitros de 25% de iodixanol em um tubo cônico limpo de 50 mililitros.Usando uma pipeta Pasteur não graduada, cuidadosamente camada 5,5 mililitros de solução iodixanol de 25% abaixo da solução iodixanol de 15%. Adicione as soluções de 40% e 60% conforme descrito no protocolo de texto. Frações iodixanol não devem se misturar em camadas.Usando uma pipeta Pasteur, coloque o liseto bruto em cima do gradiente iodixanol de 15%, gota a gota, para evitar perturbar a interface entre o lise bruto e a solução iodixanol. Encha cada tubo de ultracentrifugação com tampão de lise até que o menisco atinja a base do pescoço do tubo, para garantir que o tubo não entre em colapso sob as forças muito altas geradas durante a ultracentrifugação. Feche os tubos usando tampas apropriadas.Usando uma escala digital, certifique-se de que todos os três tubos de ultracentrifugação tenham o mesmo peso. Ajustando o peso conforme necessário, adicionando mais tampão de lise em cima do lise bruto. Use um rotor de titânio de ângulo fixo para centrifugar os tubos a 301580 vezes G e a 12 graus Celsius por uma hora e 40 minutos usando aceleração máxima e desaceleração.Em seguida, anexar uma agulha a uma seringa de cinco mililitros. Remova o espaçador dos tubos do rotor e recupere os tubos após a centrifugação. Aspire apenas a fração de 40% de iodixanol que contém as partículas vetoriais.Processe a amostra ou armazene-a a quatro graus Celsius. Aqui, é demonstrado um protocolo que pode ser usado para produzir vetores AAV com uma variedade de capsídeos, configurações de genoma, tipos de promotores e cargas transgênicas. Neste exemplo, produzimos e purificamos dois vetores AAV diferentes que expressavam a proteína fluorescente verde a partir de um genoma auto-complementar.Os dois vetores são distinguidos por capsídeos diferentes:PHPB e AAV9. Eles foram entregues, por injeção de veia traseira, em seis camundongos adultos C57 pretos. Para avaliar os níveis de expressão transgênica três semanas após a injeção, as seções são manchadas com anticorpos primários contra gfp com detecção usando anticorpos secundários conjugados a um corante fluorescente.As medidas de intensidade de fluorescência mostram um aumento significativo na expressão GFP quando o vetor PHPB é usado em relação ao AAV9. Aumentos no GFP foram observados no cerebrum, no cerebelo e no tronco cerebral. A coleta precisa do vetor contendo fração é crucial para este protocolo.Caso isso não seja feito corretamente, o rendimento do vetor, bem como a pureza vetorial são adversamente afetados. Sendo capazes de produzir vetores AAV, pequenos laboratórios estarão em posição de aproveitar inúmeras possibilidades experimentais para fornecer genes no sistema nervoso central. Este protocolo requer o uso de uma ultracentrifuagem e é importante receber treinamento adequado antes de lidar com isso para evitar acidentes.Além disso, os vetores AAV são frequentemente classificados como riscos biológicos e, portanto, você deve consultar as regulamentações locais antes de manuseá-los e gerenciá-los.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Neurociência

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Um modelo em Ovo para testar compostos insulino-mimética

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Uma plataforma de jogos baseada em controle de rodas para estudar controle sensorial humano

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...