Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

М.р. поддерживается Fonds voor докторантура стипендий фламандского Vlaanderen институте (FWO) (133722/1204517N) и признает постоянную поддержку сердечно-сосудистой де Колумбии Фонд и Административный отдел науки, Технологии и инновации (Грант CT-FP44842-307-2016, код проекта 656671250485.). М.м. поддерживается докторских стипендий FWO (1S48018N). M.G.H. была поддержана VIB институциональных грантов и внешней поддержки для Alzheimer исследований (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Грант 1513616N) и Совет европейских исследований (ERC) (Грант начиная от Тьерри Latran фонд (SOD-VIP), Фонд 281961 - AstroFunc; Доказательство концепции Грант 713755 - AD-VIP). Авторы признают Jeason Haughton за его помощь с мыши земледелием, Стефани Кастальдо за ее помощь, выполняя инъекции Вену хвост и Каролин Eykens для предоставления изображений transfected клеток HEK293T. M.G.H. признает Майкл Dunlop, Питер Хикман и декан Харрисон.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Производство рекомбинантных векторы AAV описано здесь использует материалы и оборудование, общие для большинства лаборатории молекулярной биологии и зал культуры клеток. Это позволяет пользователю получить чистый, доклинические класс векторы AAV, которые могут использоваться для нескольких типов клеток и тканей по спектру приложений in vitro и in vivo . Один из самых больших преимуществ этого протокола, по сравнению с другими (то есть, на основе CsCl очистки), — короче рабочее время требуется. Готовые к использованию векторы AAV достижимы в максимум 6 рабочих дней после первоначального transfection клетки HEK293T.
Некоторые факторы могут негативно повлиять окончательный выход или качество вектора AAV. Бедные трансфекции эффективность является одним из главных причин низкой вирусной урожайности33. Одной из основных рекомендаций является использование HEK293T клетки, которые не были пассированной более чем 20 раз и не имеют слияния клеток, больше чем 90% на момент трансфекции21. Кроме того метод трансфекции выбранный имеет существенное влияние на результаты. Этот протокол основан на использовании PEI. Пей-Катионный полимер с возможностью доставить экзогенной ДНК в ядре клетки через поколение комплексов полимера и нуклеиновых кислот, известный как polyplexes, которые занимают ячейку и торговли через endosomes34. На основе PEI трансфекции легко и быстро выполнять, в отличие от других широко используемых методов, например совместного осадков ДНК с фосфата кальция35. Кроме того на основе PEI трансфекции намного дешевле по сравнению с другими новые методы, такие как использование катионных липиды и магнит опосредованной трансфекции36.
В стратегии очистки играет ключевую роль в протоколе. По сравнению с другими методами, на основе iodixanol очищения, как правило, содержат более высокий процент пустых вирусных частиц (20%)20. Это компенсируется, до некоторой степени, тот факт, что на основе iodixanol очистки регулярно приводит в подготовке вектора AAV с коэффициентом частиц инфективности меньше 100. Это представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычной процедуры, основанные на CsCl, сообщил37которых является существенная потеря инфективности частиц. Другой общий альтернативный способ очистить векторы AAV — на основе хроматографии очистки. Однако этот метод имеет большой недостаток, что определенный столбец требуется для каждого вектора капсид используется: например, в то время как AAV2 классически изолированы с помощью столбцов гепарина, эта методология не работает с AAV4 и AAV5, которые не обладают гепарин привязки сайты на их capsids38. Учитывая, что хроматографии очистки также дорого, на основе iodixanol очистки обычно больше подходит для лабораторий, которые желают производить высококачественные пакеты векторы AAV на малых масштабах33,39, 40. Однако, чтобы максимизировать окончательные урожайности и чистоты вектора, крайнюю осторожность необходима при принятии iodixanol градиенты. Различные фракции iodixanol должны быть переданы ultracentrifugation трубки, используя стерильные пипетки Пастера чьи оконечности соприкасается стенке трубки: iodixanol должен быть выслан из пипетки, медленно и непрерывно. Как вектор частицы накапливаются в слое iodixanol 40%, необходимо обеспечить, что градиент интерфейсы не смешивать20. Наконец фракция, содержащий вектор должен быть восстановлен путем вставки тупой иглой из нержавеющей стали с габаритом не более 20 г. Для максимального восстановления вектор, четкие дроби должны быть восстановлены в полном объеме. Во время этого шага сроки имеет решающее значение. Чтобы избежать ущерба для чистоты подготовки, важно остановить коллекцию, прежде чем собираются другие (загрязняющих) этапы градиента.
Различия в полученных векторных титр может также объясняться вектора внутреннюю способность производить упакованных частиц. Сравнение между различными AAV серотипов показал, что некоторые векторы AAV сложнее производить на высокий титр, чем другие (например, AAV2)41. Осадков вектора, опреснительные этапе, может быть возможной причиной для нижней титр и легко предотвратить, избегая чрезмерной33. Кроме того это также возможно, что эффективность очистки на основе градиент iodixanol слегка отличается между серотипов, и, таким образом, расхождения в титре, полученных с различных серотипов может наблюдаться41.
Наконец необходимо отметить, что хотя ПЦР является очень точным методом для количественного определения ДНК могут наблюдаться некоторые присущие изменчивость в технике. Точность в титрования главным образом зависит от точное дозирование и надлежащего vortexing всех решений. Чтобы обеспечить наиболее точные титр чтения, ПЦР может повторяться самостоятельно, и полученные значения в среднем. Выбор грунтовки, представленные в настоящем Протоколе основан на последовательности промоутер ЦБА, расположенных в pTransgene плазмиды, используемых в нашей лаборатории. Промоутер АЗВ является сильным синтетических промоутер, который широко используется в векторное поле выражение диск через несколько типов клеток. Она включает в себя несколько элементов, включая элемент раннего усилитель цитомегаловирусом (CMV); Промоутер, первый экзона и первый Интрон ЦБА гена; и сращивания акцептор гена β-глобина кролика. Однако грунты могут быть спроектированы для практически любой элемент, расположенный в пределах выражения кассеты (включая промоутер, трансген и нормативных элементов). Также возможна сравнение титр через пакеты, предоставляя праймеры используются против общих для векторов в регионах.
В заключение этот протокол может использоваться для производства векторы AAV с различными capsids, геном конфигураций, промоутер типов и трансген грузов. Это позволит пользователям легко адаптировать окончательные характеристики их векторов, Лучший экспериментальный потребностям. В этом примере представлен в результатах представительных, использование PHP. B капсида, которая эффективно пересекает BBB, дал высокоэффективных ген выражение в ЦНС, инъекции Вену следующие хвост32. Системные администрация ЦНС капиллярный векторов имеет значительные преимущества с точки зрения возможных побочных эффектов2,17,32. Возможной альтернативой периферийных инъекций, избегая предостережения инвазивных методов, является Интратекальное доставки, которая состоит из доставки вектора AAV в спинномозговую жидкость. Этот маршрут доставки доказано, чтобы быть эффективной, показаны широкое выражение трансген через ЦНС, меньше пробить эффекты в периферических органах и низкий уровень иммунной реакции42. Однако Интратекальное инъекции являются гораздо более сложным, поскольку они требуют более высоких технических навыков, чем инъекции Вену хвост.
Дальнейшее развитие капсид для уточнения этой технологии будет определяться возможности для использования вектора AAV в приложениях генной терапии. Такие подходы предлагают привлекательные возможности для лечения в настоящее время неизлечимых заболеваний ЦНС, например боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, Паркинсона и болезнь Альцгеймера18.

За последние 30 лет одичал тип AAVs разработаны для создания рекомбинантных векторы AAV, которые оказались исключительно полезными инструментами для переноса генов в ЦНС1,2,3,4, 5,6 и генной терапии подходы к болезни (в том числе утвержденных FDA и EMA терапии)4,7. Значительной степени их пригодности для использования в ЦНС происходит от их способность заразить-деления, после митотическая клетки, как правило, найти в ЦНС8. Однако векторы AAV-основе также имеют преимущество, позволяя долгосрочный выражение любого заданного терапевтических трансген4,9 заручаясь мягче иммунный ответ, по сравнению с другими вирусных векторов7, 8,10,,1112.
Основными элементами любого вектора AAV являются генома и капсид. Одичал тип AAVs одноцепочечной ДНК вирусов с геном приблизительно 5 kilobases (КБ)13(СС). Для производства рекомбинантного векторы AAV, rep и Кап генов (необходимые для репликации генома и Ассамблея вирусного капсида) будут удалены из генома одичал тип AAV и в транс, оставляя место для Кассета выражения, содержащие трансген14,15. Перевернутый терминала повтора последовательности (РМЭ) оригинальных вирусного генома являются только сохраненные элементы вектора AAV, как они необходимы для репликации и упаковка3,10,14. Векторы AAV могут быть спроектированы для повышения трансген выражение; мутации в одном РМЭ приводит к образованию петли шпильки, который позволяет эффективно поколения взаимодополняющих ДНК пряди3,7,15. Главное преимущество этой конфигурации, называют себя дополнительные (sc) генома, является, что она обходит потребность второй стренги синтеза типично в обычных жизненного цикла AAVs, значительно увеличивая скорость и уровня трансген выражение 1. Тем не менее, с использованием генома scAAV уменьшает грузоподъемность вектора примерно 2,4 КБ. Это включает в себя трансген последовательности, а также любые нормативные последовательности, например промоутеров или микроРНК привязки сайтов, ограничивать выражение для определенных ячеек типы16.
Капсид AAV определяет вектор хост взаимодействие клеток и наделяет определенной ячейки типа или ткани тропизм для AAV серотип, который также может быть использована для ограничения трансген выражение в определенных местах. Несколько AAV серотипов встречаются в природе, в то время как другие были произведены в лаборатории рекомбинантных подходов (например, PHP. B). Кроме того, некоторые capsids также даровать другие полезные характеристики, такие как возможность пересечь BBB, что приводит к доставке трансгенов на протяжении ЦНС после системного администрирования. Это было показано для AAV9, а также недавно описан PHP. B капсид17. Как следствие эти серотипов оказываются особенно актуальны для новых подходов генной терапии нейродегенеративных расстройств1,17,18.
Цель настоящего Протокола заключается в описать эффективный метод для мелкомасштабного производства векторы AAV высокий титр и чистоты. Хотя здесь представлены результаты используете PHP. B капсида и scAAV выражение кассету, протокол подходит для производства нескольких серотипов вектора AAV и конфигураций генома, позволяя максимальную гибкость экспериментальной. Однако вектор урожайность и окончательный чистоты может варьироваться в зависимости от выбранной серотипа.
Сам протокол представляет собой вариант классического tri-transfection метод для производства вирусный вектор и включает в себя использование iodixanol градиента для векторных очистки, который, по сравнению с классической использование цезия хлорид (CsCl) градиентов, был сообщил производить векторы AAV более высокой чистоты в более эффективным с точки зрения времени образом19,,2021.
Трансфекция, очищения и концентрации шаги предназначены для быть выполнена согласно надлежащей лабораторной практики (GLP) в лаборатории тканевых культур оценили работу вирусный вектор. Каждой задачи должен выполняться в соответствии с соответствующие местные и национальные законы, касающиеся вирусный вектор производства и использования. Работа должна осуществляться под капотом ламинарного потока и в стерильных условиях. Внутри векторного объекта рекомендуется носить фартук лаборатории, помимо регулярных культуры тканей лаборатории пальто. Кроме того двойной пара перчаток, а также пластиковые Бахилы, должны носить все время.
До начала производства вектор, обеспечить все необходимое оборудование и плазмид доступны. 1) pCapsid плазмиды содержит респ ген, который кодирует четыре неструктурных белки, необходимые для репликации, а именно: Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 и крышка ген, который кодирует три структурных капсульных белков, а именно VP1, VP2 и VP3. 2) pHelper плазмиды содержит гены E4, Группа E2и ва от аденовируса, способствующие AAV производства в HEK293T клетках. 3) pTransgene плазмиды содержит выражение кассеты трансген, в окружении двух РМЭ. Эти плазмиды может быть синтезированным de novo в лаборатории с помощью последовательности доступных онлайн22. Для плазмиды сделал de novoособенно те, которые содержат Роман трансгенов, последовательности требуется, чтобы убедиться в правильности трансген и РМЭ. В качестве альтернативы готовые плазмиды могут приобретаться напрямую через онлайн плазмида репозиториев. При необходимости, плазмиды может быть усилена и очищается с помощью стандартных комплектов, согласно инструкции производителя23.
Вектор титр чистоты может пагубно отразиться на способности трансдукции вектора. Для оценки качества производимых вектора поставляются дополнительные протоколы. Окончательный векторов будет полезна для исследования функции клеток ЦНС в приложениях, как in vitro и in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Джин средства доставки на основе аденоассоциированный вирусов (AAVs) являются популярным выбором для доставки трансгенов центральной нервной системы (ЦНС), включая приложения генной терапии. Векторы AAV-тиражирование, способных заразить деления и не деления клетки и обеспечить долгосрочные трансген выражение. Важно отметить, что некоторые серотипы, таких как недавно описан PHP. B, может крест крови мозг барьера (ГЭБ) в моделях животных, после системного доставки. Векторы AAV может быть эффективно производится в лаборатории. Однако надежных и воспроизводимых протоколов обязаны получить векторы AAV с достаточной чистоты и титр значения достаточно высоким для приложений в естественных условиях . Этот протокол описывает стратегию эффективной и воспроизводимый для производства вектора AAV, основанный на стратегии градиента очистки iodixanol. Метод очистки iodixanol подходит для получения пакетов векторы AAV высокого титра высокой чистоты, когда по сравнению с другими методами очистки. Кроме того протокол обычно быстрее, чем другие методы, описанные в настоящее время. Кроме того, количественные полимеразы цепная реакция (ПЦР)-стратегия описана для быстрого и точного определения вектор титра, а также Серебряный пятнать метод для определения чистоты пакете вектор. Наконец представитель результаты доставки генов в ЦНС, после системного администрирования AAV-PHP. B, представлены. Такие результаты должны быть возможным в всех лабораториях с использованием протоколов, описанные в этой статье.

AAV9 считался, до недавнего времени, чтобы быть наиболее эффективным серотип вектора AAV в пересечении BBB и преобразователя клетки ЦНС, после периферийных администрации. Был достигнут значительный прогресс в капсид дизайн при Deverman et al. сообщили об использовании метода отбора капсид под названием Cre AAV-целевой основе рекомбинации эволюции (CREATE)17. С помощью этого метода, они определили новый капсида, названный PHP. B, в которых они сообщили, как способными передавать большинство астроциты и нейронов в нескольких регионах, ЦНС, после системного инъекции17. На данный момент, она должна быть отметил, что хотя PHP. B обеспечивает положительные результаты у мышей C57/Bl6 (что было напряжение, используемая в экспериментах по первоначальной изоляции), предварительные доклады предположить, что его эффективность может отличаться в зависимости от штамма. Без сомнения, дальнейшие эксперименты прольет больше света на этот вопрос31.
Однако несмотря на эти проблемы, PHP. B предлагает захватывающие возможности для неинвазивной генные манипуляции в ЦНС мышей, включая доказательства в концепция генной терапии эксперименты в модели заболеванием. Таким образом мы решили оценить эффективность трансген выражения с использованием PHP. B против AAV9, который был «золотой стандарт» вектор для трансдукции ЦНС после периферийных администрации начиная с 2009 года2. Чтобы выполнить прямое сравнение обоих серотипов, при оптимальных условиях для выражения трансген, мы использовали генома конфигурации sc32. Обе векторов осуществляется трансген для зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) под контролем промотора вездесущие курица β-актина (ЦБА). Самок мышей C57/Bl6 на послеродовой день 42 (примерно 20 г веса) получил дозу 1 x 1012 вол на мыши или scAAV2/PHP. B-СВА-GFP или scAAV2/9-СВА-GFP. Векторное управление был осуществляется через инъекции Вену хвост. Эксперименты были утверждены Этический Комитет ку Лёвен.
Три недели postinjection, мышей прошли transcardial перфузии с ледяной PBS, следуют ледяной параформальдегида 4% (w/v) (PFA). Их мозг были собраны и прошли дальше postfixation на ночь инкубации в том же фиксатором, перед передачей на 0,01% (w/v) Na азид/PBS для хранения до дальнейшего анализа. Потом мозги были секционного с помощью вибрационного микротом, и иммуногистохимии была выполнена на 50 µm толщиной секций.
Для оценки уровней экспрессии трансген, разделы окрашивали с первичных антител против GFP (кролик анти GFP), обнаружения, используя вторичные антитела, конъюгированных Люминесцентную краску (анти кролик Alexa Fluor 488) (рис. 4A, B ). Измерения интенсивности флуоресценции (в произвольных единицах [au]) подтвердили значительное увеличение экспрессии гена GFP когда sc генома и PHP. B капсид были использованы по отношению к AAV9. Увеличение ГФП были замечены в головном мозге (2105 ± 161 против 1441 ± 99 АС; p = 0,0032), мозжечок (2601 ± 196 против 1737 ± 135 АС; p = 0,0032) и ствола мозга (3082 ± 319 против 2485 ± 88 АС; p = 0.0038) (рис. 4 c).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Рисунок 4: Системные поставки scAAV2/PHP. B-СВА-GFP приводит к высокой экспрессия гена GFP в ЦНС. scAAV2/PHP. B-СВА-GFP или scAAV2/9-СВА-GFP (1 x 1012 vg/мышь) осуществлялось до 6 недель old мышей C57/Bl6 через инъекции Вену хвост. GFP был обнаружен с помощью иммуногистохимия на корональных мозга секции 3 недели postinjection. (A) головного мозга и (B) показаны мозжечка и ствола мозга. Масштаб баров = 1 mm. (C) была выполнена количественная оценка интенсивности флуоресценции относительной для определения уровней сигнала GFP с каждый вектор (10 секций на мышь; три мыши на вектор группы). Была выполнена односторонней теста ANOVA, следуют две Стьюдента t-теста; Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение; p < 0.01; АС. условные единицы. pCapsid, используемые для производства вектора AAV, содержит генов rep от серотипа 2 и гена колпачок от серотип PHP. B или AAV9, соответственно. Эта цифра была изменена от Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Здесь мы описываем стратегии эффективной и воспроизводимые производить, титр и контроль качества пакетов аденоассоциированный вирус векторов. Это позволяет пользователю получить вектор препарат с высоким титр (≥1 x 1013 вектор геномов/мл) и высокой чистоты, готовые для использования в vitro или в естественных условиях .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Следуя этому протоколу, пользователь сможет производить векторы AAV высокой чистоты и урожайности, подходящие для приложений in vitro или in vivo. Этот протокол может быть использован для производства и очистки ряда серотипов AAV с различиями в конфигурациях. Сочетание этих двух элементов может быть полезно для получения клеточного типа и ткани специфического выражения.Производство некоторых серотипов может дать более низкую урожайность. Это производство, где есть близкие серотипы и должны быть оценены на индивидуальной основе. Демонстрацией этих процедур будет Шелли Фрипонт, техник из нашей лаборатории.После выращивания клеток HEK смешайте 360 микрограммов плазмидной помощи, 180 микрограммов плазмидной, кодирующей капсид вектора, и 180 микрограммов плазмиды, содержащей трансген в 18 миллилитров 150 миллимолярный хлорид натрия для подготовки смеси ДНК. Распределите эту смесь по трем 50 миллилитровым коническим трубам. В новой конической трубке смешайте 840 микрограммов PEI и шесть миллилитров 150 миллимолярный хлорид натрия для приготовления смеси PEI для шести блюд клеточной культуры.Затем добавьте шесть миллилитров смеси PEI, капля за каплей, в одну из конических трубок, содержащих смесь ДНК. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем удалите из инкубатора шесть блюд клеточной культуры.В ламинарный капюшон потока, полностью аспирировать среды от каждого блюда. Промыть посуду пятью миллилитров предварительно разогретого DPBS, чтобы удалить следы среды. Аккуратно наклоните каждое блюдо, чтобы обеспечить равномерное распределение DPBS по всей поверхности.Затем аккуратно аспирировать DPBS. Добавить 12 миллилитров DMEM по одному к каждому блюду медленно, с пипеткой размещены на краю блюда. Смешайте PEI и смесь ДНК, трубя его вверх и вниз три-пять раз.Добавьте два миллилитров этой смеси к каждому из шести блюд клеточной культуры в капле моды, убедившись, что тщательно распределить его по всей поверхности. Повторите этот процесс, используя шесть блюд клеточной культуры одновременно до достижения 18 блюд клеточной культуры. Аккуратно встряхните блюда клеточной культуры, чтобы распределить смесь ДНК PEI.Инкубировать трансфицированных клеток при 37 градусов по Цельсию с 95 процентов влажности и пять процентов углекислого газа в течение пяти часов. После этого добавьте еще 12 миллилитров DMEM 10 к каждому из 18 блюд, не удаляя уже существующие среды. Продолжить инкубацию трансфицированных клеток в тех же условиях.В 72 часа после трансфекции используйте клеточный скребок, чтобы тщательно отделить клетки от каждого культурного блюда. Соберите медиум и клетки двух культурных блюд в 15 миллилитровую коническую трубку, хранится на льду. Центрифуга труб в 420 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут с ускорением и замедлением центрифуги установлен на максимум.Аккуратно выбросьте супернатант из каждой трубки, аккуратно выливая его в контейнер для удаления отходов. Затем поместите трубки, содержащие клеточные гранулы, на лед. Мы приостанавливаем каждую гранулу в два миллилитров буфера лиза и смешиваем, трубя вверх и вниз пять-десять раз.Вытяните AAV из трех труб, вместе. Для начала заморозить повторно приостановленные клетки, поместив их в ведро, содержащее сухой лед, смешанный с этанолом. Затем оттаивать клетки, немедленно поместив их в водяной бане установлен на 37 градусов по Цельсию.Повторите этот цикл замораживания и оттепели три раза, чтобы подморозить клетки и выпустить частицы AAV. После третьего шага оттаивания центрифуга в 1167 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Тщательно перенесите супернатанты для очистки 50 миллилитров конических трубок.Добавьте нуклеазу к каждой трубке до конечной концентрации 50 единиц на миллилитр супернатанта. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, в то время как закрученного труб каждые 10 минут, чтобы убедиться, что нуклеаза тщательно смешивается с супернатантом. Центрифуга при 13490 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы прояснить супернатант.После этого удалите поршень из 10 миллилитров шприца, прикрепите к шприцу фильтр 0,45 микрометра и поместите его поверх чистой 50-миллилитровой конической трубки. Аккуратно заполните шприц уточненным супернатантом. Используйте поршень, чтобы заставить лисировать через фильтр.Затем подготовь каждую из фракций йодиксанаола в четырех отдельных 50 миллилитровых конических трубках, как указано в таблице одного из текстовых протоколов. Пипетт восемь миллилитров 15 процентов йодиксанола в каждой из трех ультрацентрифуг труб. Pipette 5.5 миллилитров 25 процентов йодиксанола в чистую 50 миллилитров конической трубки.Используя неизданную трубу Pasteur, тщательно слой 5,5 миллилитров 25 процентов йодиксанола раствор ниже 15 процентов йодиксанола решения. Добавьте 40-процентные и 60-процентные решения, описанные в текстовом протоколе. Фракции йодиксанаола не должны перемешиваться при наслоениях.Используя пастер пипетку, слой сырой лисат на вершине 15 процентов йодиксанол градиент, капля за каплей, чтобы избежать нарушений интерфейс между сырой лисат и раствор йодиксанол. Заполните каждую ультрацентрифугированную трубку буфером лиза до тех пор, пока мениск не достигнет основания шеи трубки, чтобы трубка не рухнула под очень высокими силами, генерируемыми во время ультрацентрифугации. Закройте трубки с помощью соответствующих крышей.Используя цифровую шкалу, убедитесь, что все три ультрацентрифугации трубки имеют одинаковый вес. Корректировка веса по мере необходимости, путем добавления большего буфера лиза поверх сырого лизата. Используйте фиксированный угол титанового ротора для центрифуги труб в 301580 раз G и при 12 градусах Цельсия в течение одного часа и 40 минут, используя максимальное ускорение и замедление.Затем прикрепите иглу к пятими миллилитровому шприцу. Удалите промежитель из труб в роторе, и восстановить трубы после центробежки. Аспирировать только 40 процентов йодиксанол фракции, которая содержит векторные частицы.Либо обработать образец или хранить его при четырех градусах по Цельсию. Здесь демонстрируется протокол, который может быть использован для производства векторов AAV с различными капсидами, конфигурациями генома, типами промоутеров и трансгенными грузами. В этом примере мы произвели и очищали два различных вектора AAV, которые выражали зеленый флуоресцентный белок из генома.Два вектора отличаются различными капсидами: PHPB и AAV9. Они были доставлены, через инъекцию хвостовой вены, во взрослых C57 черные шесть мышей. Для оценки уровня трансгенного экспрессии через три недели после инъекции, разделы окрашены первичными антителами против GFP с обнаружением с использованием вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем.Измерения интенсивности флуоресценции показывают значительное увеличение экспрессии GFP при использовании вектора PHPB по отношению к AAV9. Увеличение GFP наблюдалось в мозге, мозжечка, и в стволе мозга. Точный сбор вектора, содержащего фракцию, имеет решающее значение для этого протокола.В случае, если это не делается должным образом, отрицательно сказывается урожайность вектора, а также чистота вектора. Будучи в состоянии производить векторы AAV, небольшие лаборатории будут в состоянии воспользоваться многочисленными экспериментальными возможностями для доставки генов в центральной нервной системе. Этот протокол требует использования ультрацентрифуга, и важно, чтобы получить надлежащую подготовку перед обработкой этого, чтобы избежать несчастных случаев.Кроме того, векторы AAV часто классифицируются как биоопасные и, следовательно, вы должны проконсультироваться с местными правилами, прежде чем обрабатывать и управлять ими.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Визуализация и живой изображений Олигодендроциты органелл в Organotypic мозга фрагментов с помощью аденоассоциированный вирус и конфокальная микроскопия

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Модель в Ovo для тестирования инсулин подражательный соединений

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Конвекция Расширенная доставка оптогенетической адено-ассоциированной вирусного вектора в кору ресуса макаки под руководством онлайн МРТ изображений

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Игровая платформа на основе управления колесами для изучения управления сенсорными датчиками человека

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...